<p class="jove_content"&gt; El trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia (CHE-0749737). El uso del instrumento fue proporcionada por el Fondo de Espectrometría de Masas de la Universidad del Pacífico.</p

1. Preparación de las soluciones de muestra <ol><li> En primer lugar preparar las soluciones madre de péptido y los ácidos de referencia seis utilizando un disolvente mixto de metanol y agua en una relación en volumen 01:01. Las soluciones madre deben tener una concentración de aproximadamente 10 -3 M. </li><li> Pesar 1 mg de la muestra péptido sólido, un 3 CH, en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y añadir 1,0 ml de disolvente mixto de metanol y agua, y mezclar usando un vórtice. </li><li> Pesar 1 mg de ácido difluoroacético (DFAH) y añadir 1,0 ml de la mezcla de disolventes de metanol y agua, y mezclar usando un vórtice. </li><li> Utilice el mismo procedimiento para hacer las soluciones madre de las otras cinco Referencia ácidos ácido cloroacético (MCAH), ácido bromoacético (MBAH), ácido dicloroacético (DCAH), ácido dibromoacético (DBAH) y ácido trifluoroacético (TFAH). </li><li> Dibuje sobre 50 l de la solución madre de péptido en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, y dibujar sobre 50 l de la solución madre de DFAH en el SAMe tubo Eppendorf. Diluir la solución mezclada con 900 l de la mezcla de disolventes de metanol y agua para conseguir una concentración final de aproximadamente 10 -4 M. Esta solución diluida se utiliza como la solución de la muestra para las mediciones de espectrometría de masas. La relación real del péptido con el ácido de referencia, así como la concentración final de la solución de muestra se puede ajustar sobre la base de las abundancias de señal de iones observados en el espectrómetro de masas. </li><li> Utilice el mismo procedimiento para preparar las soluciones de muestra del péptido con los otros ácidos cinco de referencia. </li></ol> 2. La espectrometría de masa Medida 1: Proton-bound Formación Cluster Ion <ol><li> El primer paso de la medición de espectrometría de masas es generar iones agrupados de protones enlazados estables del péptido con un ácido referencia. </li><li> Ajuste el instrumento en el modo de iones negativos MS con el voltaje de la aguja ESI a -4,5 kV, el voltaje capilar en alrededor de -35 V, y la temperatura del gas de secadomantenido a 150 ° C. Establecer la anchura del pico Q1 y la anchura del pico Q3 tanto a la escala calibrada (La anchura del pico es un parámetro de instrumento que se puede utilizar para ajustar la resolución de los picos. El ajuste de &quot;escala calibrada&quot; permite mostrar picos estrechos para una mejor separación de los picos ). La tensión capilar y la temperatura del gas de secado se pueden ajustar para mejorar las abundancias de iones observados. </li><li> Infundir aproximadamente 0,5 ml de la solución de muestra de péptido-DFAH en una jeringa Hamilton de 1 ml y conectar la jeringa a la entrada de la aguja ESI usando tubo de PEEK. A continuación, coloque la jeringa en la bomba de jeringa. Encienda la bomba de jeringa para infundir la solución de muestra en la aguja ESI con la velocidad de flujo a 10 l / min. </li><li> Encienda el voltaje de la aguja ESI para activar el proceso de ESI. Encienda el detector. Una pantalla de espectro de masas debe ser observado en el modo de perfil. Si la pantalla está en el modo de centro de gravedad, cambiar al modo de perfil. Ver el cúmulo de protones-bound formación de iones de monitoring el pico a m / z 428. La abundancia de la señal del ion de clúster puede ser ajustada mediante la regulación fina del instrumento. Un parámetro importante es la tensión capilar. Uno puede cambiar manualmente la tensión capilar (típicamente en el intervalo de -20 a -50 V) para maximizar la abundancia del pico a m / z 428. </li></ol> 3. La espectrometría de masa Medida 2: Los experimentos de horquillado CID <ol><li> El siguiente paso es para llevar a cabo el experimento horquillado CID. </li><li> Una vez que la abundancia del ion del cluster alcanza el valor deseado (en torno a 100 mV), cambie el instrumento en el modo MS / MS. En este modo, las funciones de Q1 como un filtro de masa para aislar el ion clúster, funciones Q2 como la celda de colisión, y funciones Q3 como el analizador de masas. </li><li> Ajuste el gas de colisión (argón, en este caso) de presión a 0,5 mTorr y la energía de colisión en 17 eV. Tres picos se deben observar en la ventana de visualización del espectro de masas. El pico a m / z 428 corresponde a la de iones de clúster, [DFA • H • A 3 CS] ¯. Los dos picos a m / z 332 y m / z 95 corresponden al péptido desprotonado (A 3 CS ¯) y el ácido difluoroacético desprotonado (DFA ¯), respectivamente. El pico menor a m / z 298 es un fragmento secundaria del péptido desprotonado. Adquirir un espectro CID de 2 min, la Figura 3a. </li><li> Lleve a cabo experimentos similares CID y adquirir un espectro CID para la solución de la muestra del péptido con ácido bromoacético (MBAH), la Figura 3b. </li><li> Realizar experimentos similares CID y adquirir los espectros CID para las soluciones de muestra del péptido con todos los otros ácidos de referencia. Los espectros CID resultante será cualitativamente similares a las Figuras 3a y 3b, pero los valores de m / z y las alturas relativas de los picos será diferente. </li></ol> 4. La espectrometría de masas de medición 3: El método cinético <ol><li> El último paso es la adquisición de los espectros de SRM. </li><li> Cambie la visualización del espectro de centroide y establezca el instrumento para la vigilancia de reacción seleccionada (SRM) de modo. Mantenga m / z 428 como ion aislado por el primer cuadrupolo (Q1), y rellenar cuatro masas (relación masa-carga) sean supervisados ​​por el tercer cuadrupolo (Q3). Los cuatro masas son m / z 428 (el ion clúster), m / z 332 (el ion péptido), m / z 298 (el fragmento del péptido de iones), y m / z 95 (la DFA ¯ de iones). Mantenga la presión del gas de colisión en 0,5 mTorr. </li><li> Establecer la energía de colisión de 11,7 eV y adquirir los espectros durante 5 min. </li><li> Cambie la energía de colisión a 17,6 eV y adquirir los espectros durante 5 min. </li><li> Cambie la energía de colisión a 23,4 eV y 29,3 eV, y adquirir los espectros en los dos energías de colisión durante 5 min. </li><li> Realizar mediciones similares para el péptido con todos los otros ácidos de referencia. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Copie los valores de las intensidades de iones de All los espectros SRM en una hoja de cálculo Excel. </li><li> Calcular los productos del CID iones fracciones de desintegración, ln ([A ¯] / [A i ¯]), medidas para los seis grupos de protones unidos en las cuatro energías de colisión. Los valores de ejemplo se muestran en la Tabla 1. </li><li> Grafica los valores de ln ([A ¯] / [A i ¯]) contra los valores de Δ ácido H i - Δ H ácido promedio. Esto dará a cuatro parcelas correspondientes a los datos en cuatro energías de colisión, la Figura 4a. </li><li> Extraer los valores de las pendientes y las ordenadas por la regresión lineal de las cuatro parcelas. En este caso, las pendientes son valores positivos y las intersecciones son valores negativos. Dé el símbolo &quot;X&quot; a las pistas y el símbolo &quot;S&quot; para las intersecciones. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Multiplicar los valores de Y por -1 y utilizar el símbolo Y &#39;para representar los valores positivos (esto permite que el eje y para desreproducir valores positivos). Nota, esta conversión es opcional, siempre y cuando los valores correspondientes se utilizan para hacer la trama para el siguiente paso. </li><li> Grafica los valores de Y &#39;en contra de los valores de X, la Figura 4b. Regresión lineal de la trama da una pendiente de 1.706 y una intercepción de -0,536. La pendiente se corresponde con ácido Δ H - Δ H ácido promedio. El valor de ácido Δ H promedio se sabe que es 330,5 kcal / mol, que se determina por el conjunto de los ácidos de referencia seleccionados. El valor de la acidez de la fase gaseosa del péptido se obtiene entonces a partir de la pendiente: ácido Δ H (A 3 CH) = 332,2 kcal / mol. </li></ol>

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No hay nada que revelar.

El éxito de la medición de la acidez en fase gaseosa de un péptido se basa en gran medida de la selección de los ácidos de referencia adecuados. Los ácidos de referencia ideales son compuestos orgánicos estructuralmente similares con valores de acidez en fase gaseosa bien establecidos. Los ácidos de referencia deben tener estructuras similares el uno al otro. Esto asegurará una entropía similar de desprotonación para cada uno de los ácidos de referencia en el conjunto. Los ácidos de referencia deben tener v...

Los acidez de los residuos de aminoácidos están entre las propiedades más importantes termoquímicos que influyen en las estructuras, la reactividad, y los procesos de plegado de las proteínas que se desarrollan 9,19. Residuos de aminoácidos individuales a menudo muestran diferentes acideces eficaces en función de sus ubicaciones en las proteínas. En particular, los residuos localizados en los sitios activos exhiben a menudo perturbados significativamente acidez. Un ejemplo de ello es el residuo de cisteína que residen en los sitios activos de la tiorredoxina super-familia de enzimas 20,21. La cisteína del sitio activo es inusualmente ácida en comparación con los de las proteínas desplegadas 3-5. Se ha sugerido que la conformación helicoidal puede tener una importante contribución a la acidez inusual. Hay amplios estudios experimentales sobre las propiedades ácido-base de los péptidos realizadas en soluciones, sobre todo en soluciones acuosas 2,6-8. Los resultados a menudo se complica por los efectos del solvente7. De hecho, la mayoría de los sitios activos en las proteínas se encuentran cerca de la región interior, donde los efectos del disolvente se reducen al mínimo 9,10. A fin de comprender las propiedades ácido-base intrínsecas de péptidos y proteínas, es importante para llevar a cabo los estudios en un entorno libre de disolvente. Aquí presentamos un método de espectrometría de masas basado en la determinación de la acidez de la fase de gas. Se conoce como el método de cinética cocineros extendida El enfoque. Este método se ha aplicado con éxito a una amplia gama de sistemas químicos para la determinación de diversas propiedades termoquímicas, tales como la acidez en fase gaseosa, la afinidad protónica, la afinidad con un ion de metal, la afinidad electrónica, y la energía de ionización 11-15, 22-26. Hemos aplicado este método para determinar la acidez de fase de gas de una serie de oligo-polialanina cisteína y cisteína-poliglicina péptidos 17,18,27. Estos estudios muestran que la cisteína N-terminal de PeptidES son significativamente más ácidos que los correspondientes C-terminales. Es probable que los altos acidez de la ex se deben a los efectos conformacionales helicoidales en el que el anión tiolato está fuertemente estabilizado por la interacción con la hélice macro-dipolo. Debido a la naturaleza no volátil y térmicamente lábiles de los péptidos, el método de cinética es el enfoque más práctico disponible en la actualidad para producir ácido-base termoquímicos cantidades razonablemente precisos de péptidos 28. El esquema general y la ecuación asociada con el método de cinética se muestran en la Figura 1. La determinación de la acidez en fase gaseosa de un péptido (AH) comienza con la formación de una serie de aniones de racimo de protones enlazados, [A • H • Un i] ¯ (o [A ¯ • H + • Un i ¯] ¯), en la región de la fuente de iones del espectrómetro de masas, donde A y A i ¯ ¯ son las formas desprotonados del péptido ylos ácidos de referencia, respectivamente. Los ácidos de referencia son compuestos orgánicos con conocidos acidez de fase de gas. Los ácidos de referencia deben tener estructuras similares entre sí (pero no necesariamente similar a la del péptido). La similitud de las estructuras entre ácidos de referencia asegura la similitud de las entropías de desprotonación entre ellos. El cluster de protones enlazado aniones se seleccionan de masa y colisional activados y posteriormente disociarse utilizando experimentos de disociación inducida por colisión (CID) para producir los correspondientes aniones monoméricos, Un ¯ y A i ¯, con constantes de velocidad de k y k i, respectivamente, se muestra en la Figura 1a. Si fragmentaciones secundarios son insignificantes, la razón de abundancia de los iones de fragmentos CID, [A ¯] / [A i ¯], representa una medida aproximada de la relación de las constantes de velocidad, k / k i. Bajo el supuesto de que no hay marcha atrás activatbarreras de iones para ambos canales de disociación, el ión producto CID relaciones de ramificación, ln [A ·] / [A i ¯], se linealmente correlacionados con la acidez de la fase gaseosa del péptido (Δ ácido H) y las de los ácidos de referencia (Δ ácido H i), como se muestra en la Figura 1b. En esta ecuación, ácido Δ H promedio es la acidez media en fase gaseosa de los ácidos de referencia, Δ (Δ S) es el término de entropía (que puede ser asumido constante si los ácidos de referencia son estructuralmente similares entre sí), R es la constante universal de los gases, y T ef es la temperatura efectiva del sistema. La temperatura efectiva es un parámetro empírico que depende de varias variables experimentales, incluyendo la energía de colisión. El valor de la acidez de la fase de gas se determina mediante la construcción de dos conjuntos de parcelas termo-cinéticas. El primer conjunto es obcontenida por el trazado de ln ([A ¯] / [A i ¯]) contra ácido Δ H i - ácido Δ H promedio, como se muestra en la Figura 4a. La regresión lineal dará lugar a un conjunto de líneas rectas con las pistas de X = 1 / RT ef e intercepta de Y = - [ácido Δ H - Δ ácido promedio H] / RT ef - Δ (Δ S) / R. El segundo conjunto de parcelas se obtiene mediante el trazado de las intersecciones resultantes (Y) desde el primer conjunto contra las pistas correspondientes (X), como se muestra en la Figura 4b. Regresión lineal produce una nueva línea con una pendiente de ácido Δ H - Δ H ácido promedio y una intercepción de Δ (Δ S) / R. El valor Δ de ácido H se obtiene entonces a partir de la pendiente y el término entropía, Δ (Δ S), se obtiene a partirla intersección. Los experimentos se realizaron con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo interfaz con una ionización por electrospray (ESI) fuente de iones. Un diagrama esquemático del espectrómetro de masas se muestra en la Figura 2. Los experimentos CID se llevan a cabo en masa seleccionar los aniones de racimo de protones enlazados con la primera unidad de cuadrupolo y permitiendo a someterse a colisiones con átomos de argón filtrados en la cámara de colisión que se mantiene a una presión de alrededor de 0,5 mTorr. Los iones de productos de disociación se analizaron en masa con la tercera unidad de cuadrupolo. Los espectros CID se registran a varias energías de colisión con la gama de m / z suficientemente amplia para cubrir todos los posibles fragmentos secundarios. Los CID intensidades de iones de productos se miden configurando el instrumento en el control de la reacción seleccionada (SRM) en el que el modo de exploración se centra en iones de productos seleccionados. Los experimentos CID se realizan en cuatro energías de colisión diferentes, correspondientes aenergías centro de masa (E cm) de 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 eV, respectivamente. La energía del centro-de-masa se ​​calcula utilizando la ecuación: E = E laboratorio cm [m / (M + m)], donde E es laboratorio de la energía de colisión en el marco del laboratorio, m es la masa de argón, y M es la masa del ion clúster de protones enlazado. En este artículo, utilizamos el oligopéptido Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) como compuesto modelo. El extremo C-terminal está amidado y el grupo tiol (SH) del resto de cisteína será el sitio ácido. La selección de los ácidos de referencia adecuados es crucial para el éxito de la medición de la acidez de la fase de gas. Los ácidos de referencia ideales son estructuralmente similares (entre sí) compuestos orgánicos con valores de acidez en fase gaseosa bien establecidos. Los ácidos de referencia deben tener valores de acidez cercanas a la de los péptidos. Para el péptido A 3 CH, seis halogenado carboxılicoc ácidos son elegidos como los ácidos de referencia. Los ácidos de referencia seis son el ácido cloroacético (MCAH), ácido bromoacético (MBAH), ácido difluoroacético (DFAH), ácido dicloroacético (DCAH), ácido dibromoacético (DBAH) y trifluoroacético (TFAH). Dos de ellos, DFAH y MBAH, servirán para ilustrar el protocolo.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Los residuos de aminoácidos situados en diferentes posiciones en las proteínas plegadas a menudo exhiben diferentes grados de acidez. Por ejemplo, un residuo de cisteína localizado en o cerca del extremo N-terminal de una hélice es a menudo más ácidos que los que en o cerca del extremo C-terminal 1-6. Aunque extensos estudios experimentales sobre las propiedades ácido-base de péptidos se han llevado a cabo en la fase condensada, en particular en soluciones acuosas 6-8, los resultados son a menudo complicados por los efectos del disolvente 7. De hecho, la mayoría de los sitios activos en las proteínas se encuentran cerca de la región interior, donde los efectos del disolvente se han minimizado 9,10. A fin de comprender las propiedades ácido-base intrínsecas de péptidos y proteínas, es importante para llevar a cabo los estudios en un entorno libre de disolvente. Se presenta un método para medir la acidez de oligopéptidos en la fase de gas. Utilizamos una cisteína que contiene oligopéptido, Ala 3 CysNH <sub&gt; 2 (A 3 CH), como el compuesto modelo. Las mediciones se basan en el método bien establecido cocineros extendida cinética (Figura 1) 11-16. Los experimentos se llevaron a cabo utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo-interconectado con una ionización por electrospray (ESI) fuente de iones (Figura 2). Para cada muestra de péptido, varios ácidos de referencia se seleccionan. Los ácidos de referencia son compuestos orgánicos estructuralmente similares conocidos con acidez de fase de gas. Una solución de la mezcla del péptido y un ácido de referencia se introduce en el espectrómetro de masas, y se forma una fase de gas de protones enlazado grupo aniónico de ácido péptido-referencia. El cúmulo de protones unido se masa aislados y fragmentados posteriormente a través de experimentos de disociación inducida por colisión (CID). Las abundancias de iones de fragmentos resultantes se analizaron mediante una relación entre la acidez y el grupo de iones de disociación cinética. La acidez de la fase gaseosa del péptido es entonces obteNed por regresión lineal de las parcelas termo-cinéticas 17,18. El método se puede aplicar a una variedad de sistemas moleculares, incluyendo compuestos orgánicos, aminoácidos y sus derivados, oligonucleótidos y oligopéptidos. Al comparar la acidez de la fase gas medidos experimentalmente con los valores calculados para los diferentes confórmeros, se pueden evaluar los efectos conformacionales en la acidez.

<ol><li> Los experimentos de horquillado CID proporcionan información sobre los acidez relativa del péptido en comparación con los ácidos de referencia seleccionados. Dos espectros CID representante del péptido (A 3 CH) con dos ácidos referencia, DFAH y MBAH, se muestran en la Figura 3. En la Figura 3a la abundancia de iones (altura del pico) del ion péptido es más débil que la de DFA ¯, y en la Figura 3b, la abundancia de iones del ion péptido es más fuerte que la de MBA...

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Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Se describe la determinación de la acidez de la fase de gas de oligopéptidos que contienen cisteína. Los experimentos se realizaron con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. La acidez relativa de los péptidos se miden utilizando experimentos de disociación inducida por colisión, y la acidez cuantitativas se determinaron utilizando los cocineros extendidas método cinético.

Determinación de la acidez en fase gaseosa de oligopéptidos

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

determination-of-the-gas-phase-acidities-of-oligopeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.0K vistas.  University of the Pacific. Se describe la determinación de la acidez de la fase de gas de oligopéptidos que contienen cisteína. Los experimentos se realizaron con un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo. La acidez relativa de los péptidos se miden utilizando experimentos de disociación inducida por colisión, y la acidez cuantitativas se determinaron utilizando los cocineros extendidas método cinético.

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Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

Rápida y alto rendimiento La amilosa Determinación de Freeze Dried papa Muestras

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Investigación

Química

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

From Constructs to Crystals &amp;#8211; Towards Structure Determination of &amp;#946;-barrel Outer Membrane Proteins

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls cause an increase in viscosity (often referred to as &#39;aging&#39;) during storage of bio-oils. As such, carbonyl content has previously been used as a method of tracking bio-oil aging and condensation reactions with less variability than viscosity measurements. Additionally, carbonyls are also responsible for coke formation in bio-oil upgrading processes. Given the importance of carbonyls in bio-oils, accurate analytical methods for their quantification are very important for the bio-oil community. Potentiometric titration methods based on carbonyl oximation have long been used for the determination of carbonyl content in pyrolysis bio-oils. Here, we present a modification of the traditional carbonyl oximation procedures that results in less reaction time, smaller sample size, higher precision, and more accurate carbonyl determinations. While traditional carbonyl oximation methods occur at room temperature, the Faix method presented here occurs at an elevated temperature of 80 &#176;C.

Here we present a potentiometric titration technique for accurately quantifying carbonyl compounds in pyrolysis bio-oils.

Determinación de carbonilo grupos funcionales en aceites biológicos mediante valoración potenciométrica: El Método Faix

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline earth-liquid metal alloys as functions of both composition and temperature in order to acquire thermodynamic data. The cell consists of a chemically stable solid-state CaF2-AF2 electrolyte (where A is the alkaline-earth element such as Ca, Sr, or Ba), with binary A-B alloy (where B is the liquid metal such as Bi or Sb) working electrodes, and a pure A metal reference electrode. Emf data are collected over a temperature range of 723 K to 1,123 K in 25 K increments for multiple alloy compositions per experiment and the results are analyzed to yield activity values, phase transition temperatures, and partial molar entropies/enthalpies for each composition.

This protocol describes the measurement of the electromotive force of alkaline-earth elements in liquid metal alloys at high temperatures (723-1,123 K) to determine their thermodynamic properties, including activity, partial molar entropy, partial molar enthalpy, and phase transition temperatures, over a wide composition range.

Determinación de propiedades termodinámicas de aleaciones de metales alcalinotérreos-líquido utilizando la técnica de la fuerza electromotriz

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Desenredar las fibras de aramida de copolímero de alta resistencia para permitir la determinación de sus propiedades mecánicas

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Synthesis and Structure Determination of &amp;#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, metal-binding interactions, and conformational shape. Coupling ESI with ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an instrumental technique that allows for simultaneous measurement of a peptide&#8217;s mass-to-charge (m/z) and collision cross section (CCS) that relate to its stoichiometry, protonation state, and conformational shape. The overall charge of a peptide complex is controlled by the protonation of 1) the peptide&#8217;s acidic and basic sites and 2) the oxidation state of the metal ion(s). Therefore, the overall charge state of a complex is a function of the pH of the solution that affects the peptides metal ion binding affinity. For ESI-IM-MS analyses, peptide and metal ions solutions are prepared from aqueous-only solutions, with the pH adjusted with dilute aqueous acetic acid or ammonium hydroxide. This allows for pH dependence and metal ion selectivity to be determined for a specific peptide. Furthermore, the m/z and CCS of a peptide complex can be used with B3LYP/LanL2DZ molecular modeling to discern binding sites of the metal ion coordination and tertiary structure of the complex. The results show how ESI-IM-MS can characterize the selective chelating performance of a set of alternative methanobactin peptides and compare them to the copper-binding peptide methanobactin.

Ion mobility-mass spectrometry and molecular modeling techniques can characterize the selective metal chelating performance of designed metal-binding peptides and the copper-binding peptide methanobactin. Developing new classes of metal chelating peptides will help lead to therapeutics for diseases associated with metal ion misbalance.

Técnicas de Espectrometría de Masa de Movilidad de Iones para Determinar la Estructura y Mecanismos de Reconocimiento de Iones Metálicos y Actividad Redox de Oligopéptidos de Unión De Metal

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Determination of the Photoisomerization Quantum Yield of a Hydrazone Photoswitch

Photoswitching organic molecules that undergo light-driven structural transformations are key components to construct adaptive molecular systems, and they are utilized in a wide variety of applications. In most studies employing photoswitches, several important photophysical properties such as maximum wavelengths of absorption and emission, molar attenuation coefficient, fluorescence lifetime, and photoisomerization quantum yield are carefully determined to investigate their electronic states and transition processes. However, measurement of the photoisomerization quantum yield, the efficiency of photoisomerization with respect to the absorbed photons, in a typical laboratory setting is often complicated and prone to error because it requires the implementation of rigorous spectroscopic measurements and calculations based on an appropriate integration method. This article introduces a set of procedures to measure the photoisomerization quantum yield of a bistable photoswitch using a photochromic hydrazone. We anticipate that this article will be a useful guide for the investigation of bistable photoswitches that are being increasingly developed.

Photoisomerization quantum yield is a fundamental photophysical property that should be accurately determined in the investigation of newly developed photoswitches. Here, we describe a set of procedures to measure the photoisomerization quantum yield of a photochromic hydrazone as a model bistable photoswitch.

Determinación del rendimiento cuántico de fotoisomerización de un interruptor de fotos de hidrazona

Photoswitching organic molecules that undergo light-driven structural transformations are key components to construct adaptive molecular systems, and they ...

Análisis de plaguicidas en aguacate utilizando el método QuEChERS y CG-MS/MS

Determination of 45 Pesticides in Avocado Varieties by the QuEChERS Method and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Gas chromatography (GC) tandem mass spectrometry (MS/MS) stands as a preeminent analytical instrument extensively employed for the surveillance of pesticide residues in food. Nevertheless, these methods are vulnerable to matrix effects (MEs), which can potentially affect accurate quantification depending on the specific combination of analyte and matrix. Among the various strategies to mitigate MEs, matrix-matched calibration represents the prevailing approach in pesticide residue applications due to its cost-effectiveness and straightforward implementation. In this study, a total of 45 representative pesticides were analyzed in three different varieties of avocado (i.e., Criollo, Hass, and Lorena) using the Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) method with ammonium formate and GC-MS/MS. 
For this purpose, 5 g of the avocado sample was extracted with 10 mL of acetonitrile, and then 2.5 g of ammonium formate was added to induce phase separation. Subsequently, the supernatant underwent a cleanup process via dispersive solid-phase extraction employing 150 mg of anhydrous MgSO4, 50 mg of primary-secondary amine, 50 mg of octadecylsilane, 10 mg of graphitized carbon black, and 60 mg of a zirconium oxide-based sorbent (Z-Sep+). The GC-MS/MS analysis was successfully performed in less than 25 min. Rigorous validation experiments were carried out to assess the performance of the method. The examination of a matrix-matched calibration curve for each variety of avocado revealed that the ME remained relatively consistent and less than 20% (considered as a soft ME) for most pesticide/variety combinations. Furthermore, the method&#180;s limits of quantification were lower than 5 &#181;g/kg for all three varieties. Finally, the recovery values for most pesticides fell within the acceptable range of 70-120%, with relative standard deviation values below 20%.

Preparación de muestras de aguacate utilizando el método QuEChERS con formiato de amonio para el análisis de pesticidas

The present protocol describes the analysis of multiclass pesticide residues in avocado varieties using the Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) method with ammonium formate, followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry.