<p class="jove_content"&gt; העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מל&quot;ג-0,749,737). השימוש במכשיר סופק על ידי המתקן המוני ספקטרומטריית באוניברסיטה של ​​האוקיינוס ​​השקט.</p

1. הכנה של פתרונות לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשון להכין את פתרונות המניות של הפפטיד ואת חומצות התייחסות לשש מעורב בשימוש בממס של מתנול ומים ביחס נפח של 1:1. את פתרונות המניות צריכים להיות בריכוז של כ -10 מ &#39;-3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 1 מ&quot;ג של מדגם פפטיד המוצק, CH 3, בצינור 1.5 מיליליטר אפנדורף ולהוסיף 1.0 מ&quot;ל של חומר ממס מעורב של מתנול ומים, ומערבבים בעזרת מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 1 מ&quot;ג של חומצת difluoroacetic (DFAH) ולהוסיף 1.0 מ&quot;ל של הממס מעורב של מתנול ומים, ומערבבים בעזרת מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש באותו הליך כדי להפוך את פתרונות המניות להתייחסות חומצות חומצה אחרת חמש chloroacetic (MCAH), bromoacetic החומצה (MBAH), חומצת dichloroacetic (DCAH), dibromoacetic חומצה (DBAH), וחומצת trifluoroacetic (TFAH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר כ -50 μl של פתרון מניות פפטיד לתוך צינור 1.5 מיליליטר אפנדורף, ולצייר על 50 μl של פתרון המניות של DFAH לsaשלי צינור Eppendorf. לדלל את התמיסה המעורבת עם 900 μl של הממס מעורב של מתנול ומים כדי להשיג ריכוז סופי של כ -10 מ &#39;-4 תמיסה מדוללת זה תשמש כפתרון לדוגמה עבור מדידות ספקטרומטריית המסה. היחס בפועל של הפפטיד לחומצת ההתייחסות, כמו גם את הריכוז הסופי של פתרון המדגם יותאם מבוסס על שכיחות אות יון שנצפתה בספקטרומטר המסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו הליך כדי להכין את פתרונות לדוגמה של פפטיד עם חמש חומצות התייחסות האחרות. </li></ol> 2. ספקטרומטריית מסה 1 מידות: גיבוש יון אשכול פרוטון בכריכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצעד הראשון של מדידת ספקטרומטריית המסה הוא ליצור יוני מצרר פרוטון בכריכות יציבות של פפטיד עם חומצת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המכשיר במצב השלילי יון MS עם מתח מחט ESI ב-4.5 קילו וולט, מתח הנימים בכ -35 וולט, וטמפרטורת גז הייבוששמור על 150 ° C. הגדר את רוחב שיא Q1 ורוחב שיא Q3 הן לקנה המידה המכויל (רוחב השיא הוא פרמטר כלי שניתן להשתמש בו כדי להתאים את הרזולוציה של הפסגות. ההגדרה &quot;מכוילת בקנה מידה&quot; מאפשרת לך להציג פסגות צרות להפרדת שיא טובה יותר ). מתח הנימים וטמפרטורת גז הייבוש יכולים להיות מותאם כדי לשפר את שכיחות יון שנצפתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות על 0.5 מ&quot;ל של פתרון המדגם של פפטיד DFAH לתוך מזרק 1 מיליליטר המילטון ולחבר את המזרק לכניסת מחט ESI באמצעות צינורות להציץ. לאחר מכן הנח את המזרק על מזרק המשאבה. הפעל את משאבת המזרק כדי להחדיר את פתרון המדגם לתוך מחט ESI עם קצב הזרימה ב10 μl / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מתח מחט ESI כדי להפעיל את תהליך ESI. הפעל את הגלאי. תצוגת ספקטרום המונית צריכה להיות שנצפתה במצב הפרופיל. אם המסך נמצא במצב centroid, לעבור למצב הפרופיל. צפה היווצרות יון אשכול הפרוטון הנכנס על ידי monitoring השיא ב &#39;/ z 428. שפע האות של יון האשכול יכול להיות מותאם על ידי כוונון עדין של המכשיר. פרמטר חשוב הוא מתח הנימים. אפשר לשנות באופן ידני את מתח הנימים (בדרך כלל בטווח של -20 עד -50 V) על מנת למקסם את השפע של השיא ב &#39;/ z 428. </li></ol> 3. ספקטרומטריית מסת מדידה 2: ניסויי bracketing CID <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא לבצע את ניסוי bracketing CID. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השפע של יון האשכול מגיע לערך הרצוי (סביב 100 mV), לעבור למכשיר מצב MS / MS. במצב זה, פונקציות Q1 כגוש מסנן כדי לבודד את יון האשכול, פונקציות Q2 כתא ההתנגשות, ופונקציות Q3 כמנתח המוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גז ההתנגשות (ארגון, במקרה זה) בלחץ 0.5 mTorr ואנרגיה ההתנגשות ב17 eV. שלוש פסגות צריכים להיות שנצפתה בחלון ראוות הספקטרום ההמוני. השיא ב &#39;/ z 428 מתאים ליון האשכול, [DFA • H • 3 CS] ¯. שני השיאים ב &#39;/ z 332 ו&#39;/ z 95 מתאים לפפטיד deprotonated (3 CS ¯) וחומצת difluoroacetic deprotonated (DFA ¯), בהתאמה. השיא בקטין מ &#39;/ z 298 הוא שבר משני פפטיד deprotonated. לרכוש ספקטרום CID למשך 2 דקות, איור 3 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויים דומים CID ולרכוש ספקטרום CID לפתרון המדגם של פפטיד עם חומצת bromoacetic (MBAH), איור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויים דומים CID ולרכוש את ספקטרום CID לפתרונות לדוגמא של פפטיד עם כל חומצות התייחסות האחרות. ספקטרום CID שיתקבל יהיה איכותי בדומה ל3 א ו 3 ב מספרים, אבל את ערכי m / z וגבה השיא היחסי יהיו שונים. </li></ol> 4. ספקטרומטריית מסת מדידה 3: שיטת קינטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב האחרון הוא לרכוש את ספקטרום SRM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לתצוגת ספקטרום centroid ולהגדיר את המכשיר לניטור התגובה הנבחר (SRM) במצב. שמור מ &#39;/ z 428 כיון המבודד על ידי quadrupole הראשון (Q1), ולמלא בארבעה המונים (יחס מסה למטען) כדי להיות במעקב על ידי quadrupole השלישי (רבעון 3). ארבעת ההמונים הם מ &#39;/ z 428 (יון האשכול), מ&#39; / z 332 (יון פפטיד), מ &#39;/ z 298 (שבר של יון פפטיד), ו&#39;/ z 95 (DFA ¯ יון). שמור על לחץ גז ההתנגשות ברמה של 0.5 mTorr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האנרגיה ההתנגשות ל11.7 eV ולרכוש את הספקטרום למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את האנרגיה ההתנגשות ל17.6 eV ולרכוש את הספקטרום למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את האנרגיה ההתנגשות ל23.4 EV, ו29.3 EV, ולרכוש את הספקטרום בשתי אנרגיות התנגשות למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מדידות דומות לפפטיד עם כל חומצות התייחסות האחרות. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את הערכים של עוצמות יון מאלl ספקטרום SRM על גבי גיליון עבודה של Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את יחסי יון מוצר CID הסתעפות, LN ([¯] / [i ¯]), שנמדד לכל ששת אשכולות פרוטון בכריכות בכל אנרגיות התנגשות ארבע. ערכי מדגם מוצגים בטבלת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את ערכיה של LN ([¯] / [i ¯]) נגד הערכים של חומצת Δ H i - Δ H החומצה AVG. זה ייתן לי ארבע חלקות מתאימות לנתונים בארבע אנרגיות התנגשות, איור 4 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ את הערכים של המדרונות ומיירט על ידי רגרסיה לינארית מארבעת המגרשים. במקרה זה, המדרונות הם ערכים חיוביים ואת מיירט הם ערכים שליליים. תן הסימן &quot;X&quot; למדרונות והסמל &quot;Y&quot; למיירט. התוצאות מוצגות בטבלה 2. הכפל את הערכים של Y ב -1 ולהשתמש בסמל Y &#39;כדי לייצג את הערכים החיוביים (זה מאפשר ציר ה-Y לדיסלשחק ערכים חיוביים). שימו לב, המרה זו היא אופציונלית כל עוד הערכים התואמים משמשים כדי להפוך את העלילה לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את הערכים של Y &quot;נגד הערכים של X, איור 4. רגרסיה לינארית של העלילה מניבה שיפוע של 1.706 ויירוט של -0.536. השיפוע מתאים לחומצת H Δ - Δ H החומצה AVG. הערך של Δ חומצת H AVG ידוע להיות 330.5 קלוריות / מול, אשר נקבעה על ידי הקבוצה של חומצות התייחסות לנבחרות. הערך של חומציות גז השלב של הפפטיד לאחר מכן התקבל מהמדרון: Δ החומצה H (3 CH) = 332.2 קלוריות / מול. </li></ol>

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

אין לחשוף.

המדידה המוצלחת של חומציות גז השלב של פפטיד מסתמכת במידה רבה על הבחירה של חומצות התייחסות מתאימות. חומצות התייחסות האידיאליות הן תרכובות אורגניות מבני דומות עם ערכי חומציות גז שלב מבוססים היטב. חומצות התייחסות צריכה להיות מבנים דומים זה לזה. זה יבטיח אנטרופיה דומה של...

את acidities של שאריות חומצת אמינו הוא בין המאפיינים החשובים ביותר המשפיעים על thermochemical מבנים, תגובתיות, והתהליכים שהתרחש קיפול של חלבונים 9,19. שאריות חומצת אמינו בודדות לעתים קרובות להראות acidities היעיל שונה בהתאם למיקומם בחלבונים. בפרט, את השאריות הנמצאות באתרים הפעילים מפגינות לעתים קרובות מוטרד acidities באופן משמעותי. דוגמה אחת כזו היא שאריות ציסטאין המתגוררים באתרים הפעילים של סופר המשפחה של אנזימי thioredoxin 20,21. ציסטאין האתר הפעיל הוא חומצי במיוחד בהשוואה לאלו בפרשו חלבונים 3-5. היה מי שהציע שקונפורמציה הסליל יכולה להיות תרומה משמעותית לחומציות יוצאת דופן. ישנם מחקרים ניסיוניים נרחבים על מאפייני חומצת הבסיס של פפטידים שבוצעו בפתרונות, בעיקר בתמיסות מימיות 2,6-8. התוצאות לעתים קרובות היו מסובכות על ידי אפקטי ממס7. למעשה, מרבית האתרים הפעילים בחלבונים הממוקמים בסמוך לאזור הפנים שבו אפקטי ממס הם מזעריים 9,10. על מנת להבין את תכונות חומצת בסיס מהותיות של פפטידים וחלבונים, חשוב לבצע את המחקרים בסביבה נטולת ממס. כאן אנו מציגים שיטה המבוססת על ספקטרומטריית מסה לקביעת חומציות גז השלב. הגישה שמכונה שיטה הקינטית המורחבת טבחים. שיטה זו יושמה בהצלחה במגוון רחב של מערכות כימיות לזיהוי תכונות thermochemical שונים, כגון חומציות גז השלב, זיקת הפרוטון, זיקת יון המתכת, זיקה האלקטרונית, ואנרגיה יינון 11-15, 22-26. יש לנו ליישם שיטה זו על מנת לקבוע את acidities גז השלב של סדרה של אוליגו ציסטאין-polyalanine וציסטאין-polyglycine פפטידים 17,18,27. מחקרים אלה מראים כי ציסטאין N-מסוף peptidES באופן משמעותי יותר חומצי מאלה C-המסוף המתאימים. את acidities הגבוהות של לשעבר צפוי בשל השפעות קונפורמציה הסליל שבי אניון thiolate הוא התייצב בחום על ידי האינטראקציה עם מקרו דיפול סליל. בגלל האופי בלתי נדיף ותרמית יציב של פפטידים, השיטה הקינטית היא הגישה המעשית ביותר שקיים כיום כדי לייצר כמויות thermochemical מדויקות למדי חומצת בסיס של פפטידים 28. התכנית הכללית והמשוואה קשורה לשיטה הקינטית מוצגות באיור 1. קביעת חומציות גז השלב של הפפטיד (AH) מתחילה עם הקמתה של סדרה של אניוני מצרר פרוטון בכריכות, [• H • i] ¯ (או [¯ • + H • אני ¯] ¯), באזור מקור יון של ספקטרומטר המסה, שבו ¯ ואני ¯ הם צורות deprotonated של הפפטיד וחומצות התייחסות, בהתאמה. חומצות התייחסות הן תרכובות אורגניות עם acidities גז שלב ידוע. חומצות התייחסות צריכה להיות מבנים דומים זה לזה (אך לא בהכרח דומה לזה של פפטיד). הדמיון של המבנים בין חומצות התייחסות מבטיח דמיון של entropies של deprotonation ביניהם. אשכול פרוטון בכריכה האניונים נבחרו המוניים והופעל collisionally ולאחר מכן ניתק באמצעות התנגשות-Induced דיסוציאציה (CID) ניסויים כדי להניב את אניוני monomeric המקביל, ¯ ואני ¯, עם קבועי קצב של K ו-K אני, בהתאמה, מוצג באיור 1 א. אם פיצולים משניים הם זניחים, יחס השפע של יוני בר CID, [¯] / [i ¯], מייצג מידה משוערת של היחס של קבועי קצב, K / K i. בהנחה שאין activat ההפוךמחסומי יונים בשני ערוצי דיסוציאציה, יון מוצר CID הסתעפות יחסים, בפיו [א ¯] / [A i ¯] חומצות התייחסות, יהיה מתואם ליניארי לחומציות גז השלב של הפפטיד (Δ החומצה H) ואלה של (Δ חומצת ח ט), כפי שמוצג באיור 1. במשוואה זו, Δ חומצת H ממוצע היא חומציות גז השלב הממוצעת של חומצות התייחסות, Δ (Δ S) הוא מונח האנטרופיה (שניתן להניח מתמיד אם חומצות התייחסות הן מבחינה מבנית דומות זה לזה), R הוא קבוע גז אוניברסלי, ו-T EFF הוא הטמפרטורה היעילה של המערכת. הטמפרטורה היעילה היא פרמטר אמפירי שתלוי במספר משתנים ניסיוניים, כולל את האנרגיה ההתנגשות. הערך של חומציות גז השלב נקבע על ידי בניית שני סטים של חלקות תרמו הקינטית. הסט הראשון הוא obמזרקה על ידי התוויית LN ([¯] / [i ¯]) נגד Δ חומצת H i - Δ חומצת H ממוצע, כפי שמוצגת באיור 4 א. רגרסיה לינארית תניב קבוצה של קווים ישרים עם המדרונות של X = 1 / RT EFF ומיירט של Y = - [Δ H החומצה - חומצת Δ H AVG] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. הסט השני של חלקות מתקבל על ידי מתכנן את תוצאת מיירט (Y) מהקבוצה הראשונה נגד המדרונות המתאימים (X), כפי שמוצגת באיור 4. רגרסיה לינארית מייצרת קו חדש עם שיפוע של Δ H החומצה - חומצת Δ H AVG ויירוט של Δ (Δ S) / R. הערך של Δ החומצה H לאחר מכן התקבל מהמדרון ומונח אנטרופיה, Δ (Δ S), מתקבלהיירוט. הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש ממשק ליינון electrospray (ESI) מקור יון. תרשים סכמטי של ספקטרומטר המסה מוצג באיור 2. ניסויי CID מבוצעים על ידי מסת בחירת אניוני מצרר פרוטונים הכרוכים עם יחידת quadrupole הראשונה ומאפשרת להם לעבור התנגשויות עם אטומי ארגון דלפו לתוך תא ההתנגשות המתקיים בלחץ של סביב 0.5 mTorr. את יוני מוצר דיסוציאציה מנותחים המוניים עם יחידת quadrupole השלישית. ספקטרום CID נרשם בכמה אנרגיות התנגשות עם מגוון מ &#39;/ z הרחב מספיק כדי לכסות את כל שברים משניים האפשריים. עוצמות יון מוצר CID נמדדות על ידי הגדרת המכשיר בניטור התגובה הנבחרת (SRM) במצב שבו הסריקה מתמקדת ביוני מוצר נבחרים. ניסויי CID מבוצעים בארבע אנרגיות התנגשות שונות, המקביל לאנרגיות מרכז מסה של-E (ס&quot;מ) של 1.0, 1.5, 2.0, ו -2.5 EV, בהתאמה. מרכז האנרגיה של המסה מחושבת באמצעות המשוואה: E = E ס&quot;מ המעבדה [מ &#39;/ (M + מ&#39;)], שבו דואר מעבדה היא האנרגיה ההתנגשות במסגרת המעבדה, מ &#39;הוא המסה של ארגון, ו-M הוא המסה של פרוטון יון האשכול בכריכה. במאמר זה, אנו משתמשים עלא Oligopeptide 3 CysNH 2 (CH 3) כמתחם המודל. C-הסופית הוא amidated וקבוצת תיאול (SH) של שאריות ציסטאין תהיה חומצי באתר. הבחירה של חומצות התייחסות המתאימות היא קריטית למדידת ההצלחה של חומציות גז השלב. חומצות התייחסות האידיאליות הן דומות מבחינה מבנית (זה לזה) תרכובות אורגניות עם ערכי חומציות גז שלב מבוססים היטב. חומצות התייחסות צריכה להיות ערכי חומציות קרובים לזו של פפטידים. לפפטיד CH 3, שש הלוגניים carboxyliחומצות C הן נבחרו כחומצות התייחסות. חומצות התייחסות לשש הן חומצת chloroacetic (MCAH), bromoacetic חומצה (MBAH), חומצת difluoroacetic (DFAH), חומצת dichloroacetic (DCAH), חומצת dibromoacetic (DBAH), וtrifluoroacetic (TFAH). שניים מהם, וDFAH MBAH, ישמש כדי להמחיש את הפרוטוקול.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

שאריות חומצת אמינו הנמצאים בתפקידים שונים בחלבונים מקופלים מפגינות לעתים קרובות דרגות acidities שונות. לדוגמה, שאריות ציסטאין ממוקמים ליד או N-סופית של סליל היא לעתים קרובות יותר חומצי מזה ליד או C-הסופית 1-6. למרות שמחקרים ניסיוניים נרחבים על מאפייני חומצת הבסיס של פפטידים בוצעו בשלב המרוכז, במיוחד בתמיסות מימיות 6-8, התוצאות לעתים קרובות מסובכות על ידי השפעות ממס 7. למעשה, מרבית האתרים הפעילים בחלבונים הממוקמים בסמוך לאזור הפנים שבו אפקטי ממס כבר ממוזערים 9,10. על מנת להבין את תכונות חומצת בסיס מהותיות של פפטידים וחלבונים, חשוב לבצע המחקרים בסביבה נטולת ממס. אנו מציגים שיטה למדידת acidities של oligopeptides בגז השלב. אנו משתמשים המכיל ציסטאין Oligopeptide, עלא 3 CysNH <sUB&gt; 2 (CH 3), כמודל למתחם. המדידות מתבססות על השיטה המבוססת היטב המורחבת טבחים הקינטית (איור 1) 11-16. הניסויים מתבצעים באמצעות ספקטרומטר מסה משולש quadrupole ממשק עם יינון electrospray (ESI) מקור יון (איור 2). עבור כל דגימת פפטיד, חומצות התייחסות למספר נבחרו. חומצות התייחסות הן תרכובות אורגניות מבני דומות עם acidities גז שלב ידוע. פתרון של התערובת של הפפטיד וחומצת התייחסות מוחדר ספקטרומטר המסה, ומקבץ anionic גז שלב פרוטון בכריכה של חומצת פפטיד הפניה הוא נוצר. אשכול פרוטון בכריכה מבודד המוני ומקוטע בהמשך דרך התנגשות-Induced דיסוציאציה (CID) ניסויים. את שכיחות יון שבר כתוצאה מכך הם נותחו באמצעות מערכת יחסים בין acidities וקינטיקה דיסוציאציה יון האשכול. חומציות גז השלב של הפפטיד היא אז obtaiנד על ידי רגרסיה לינארית של החלקות תרמו הקינטית 17,18. השיטה ניתן ליישם במגוון רחב של מערכות מולקולריות, כולל תרכובות אורגניות, חומצות אמינו ונגזרותיהם, oligonucleotides וoligopeptides. על ידי השוואת acidities גז השלב נמדד בניסוי עם אותם הערכים שחושבו עבור conformers שונה, ניתן להעריך השפעות קונפורמציה על acidities.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויי סוגר CID לספק מידע על acidities היחסי של פפטיד בהשוואה לחומצות התייחסות לנבחרות. שניים ספקטרום CID נציג של הפפטיד (CH 3) עם שתי חומצות התייחסות, וDFAH MBAH, מוצג באיור 3. באיור 3 א שפע יון (גובה שיא) של יון פפטיד הוא חלש יותר מזה של DFA ¯, ובאיור 3</str...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

קביעת acidities גז השלב של oligopeptides המכיל ציסטאין מתוארת. הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש. את acidities היחסי של פפטידים נמדדים באמצעות ניסויי דיסוציאציה התנגשות-Induced, ואת acidities כמותיות נקבעות באמצעות טבחים ממושכים שיטה קינטית.

קביעת Acidities גז השלב של Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

determination-of-the-gas-phase-acidities-of-oligopeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.0K Views.  University of the Pacific. קביעת acidities גז השלב של oligopeptides המכיל ציסטאין מתוארת. הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש. את acidities היחסי של פפטידים נמדדים באמצעות ניסויי דיסוציאציה התנגשות-Induced, ואת acidities כמותיות נקבעות באמצעות טבחים ממושכים שיטה קינטית.

Video: Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

קביעה המהירה amylose התפוקה גבוה בדוגמאות פקעת תפוח האדמה להקפיא יבשים

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

היווצרות של מבני Biomolecular הוזמנו על ידי ההרכבה העצמית של פפטידים קצרים

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls cause an increase in viscosity (often referred to as &#39;aging&#39;) during storage of bio-oils. As such, carbonyl content has previously been used as a method of tracking bio-oil aging and condensation reactions with less variability than viscosity measurements. Additionally, carbonyls are also responsible for coke formation in bio-oil upgrading processes. Given the importance of carbonyls in bio-oils, accurate analytical methods for their quantification are very important for the bio-oil community. Potentiometric titration methods based on carbonyl oximation have long been used for the determination of carbonyl content in pyrolysis bio-oils. Here, we present a modification of the traditional carbonyl oximation procedures that results in less reaction time, smaller sample size, higher precision, and more accurate carbonyl determinations. While traditional carbonyl oximation methods occur at room temperature, the Faix method presented here occurs at an elevated temperature of 80 &#176;C.

Here we present a potentiometric titration technique for accurately quantifying carbonyl compounds in pyrolysis bio-oils.

קביעת קבוצות פונקציונליות קרבוניל Bio-שמנים ידי טיטרציה פוטנציומטריים: שיטת Faix

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline earth-liquid metal alloys as functions of both composition and temperature in order to acquire thermodynamic data. The cell consists of a chemically stable solid-state CaF2-AF2 electrolyte (where A is the alkaline-earth element such as Ca, Sr, or Ba), with binary A-B alloy (where B is the liquid metal such as Bi or Sb) working electrodes, and a pure A metal reference electrode. Emf data are collected over a temperature range of 723 K to 1,123 K in 25 K increments for multiple alloy compositions per experiment and the results are analyzed to yield activity values, phase transition temperatures, and partial molar entropies/enthalpies for each composition.

This protocol describes the measurement of the electromotive force of alkaline-earth elements in liquid metal alloys at high temperatures (723-1,123 K) to determine their thermodynamic properties, including activity, partial molar entropy, partial molar enthalpy, and phase transition temperatures, over a wide composition range.

קביעת מאפייני תרמודינמי בסגסוגות מתכת עפרורית נוזלי בטכניקה כוח אלקטרו מניע

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Disentangling חוזק גבוה קופולימר ארמיד סיבים כדי לאפשר קביעת תכונות מכניות שלהם

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

סינתזה וקביעת מבנה ממוצע-Conotoxin Isomers PIIIA עם Connectivities דיסולפידי שונים

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

קביעת Acidities גז השלב של Oligopeptides

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video