<p class="jove_content"&gt; O trabalho foi financiado pela National Science Foundation (CHE-0749737). O uso do instrumento foi fornecido pelo Facility Mass Spectrometry da Universidade do Pacífico.</p

1. Preparação das Soluções Amostra <ol><li> Primeiro preparar as soluções de estoque de péptido e os seis ácidos de referência, utilizando um solvente misto de metanol e água numa proporção de 1:1 em volume. As soluções de reserva deve ter uma concentração de cerca de 10 -3 M. </li><li> Pesam-se 1 mg de péptido a amostra sólida, A 3 CH, num tubo Eppendorf de 1,5 mL e adicionar 1,0 ml de solvente misto de metanol e água, e misturar utilizando um vortex. </li><li> Pesam-se 1 mg de ácido difluoroacético (DFAH) e adicionar 1,0 ml da mistura de solventes de metanol e água, e misturar utilizando um vortex. </li><li> Use o mesmo procedimento para fazer as soluções estoque para os outros cinco referência ácidos ácido chloroacetic (MCAH), ácido bromoacético (MBAH), ácido dicloroacético (DCAH), ácido dibromoacetic (DBAH) e ácido trifluoroacético (TFAH). </li><li> Desenhar cerca de 50 ul da solução-mãe de péptido para um tubo Eppendorf de 1,5 ml, e extrair cerca de 50 ul da solução de estoque de DFAH na same tubo Eppendorf. Dilui-se a solução da mistura com 900 ul da mistura de solventes de metanol e água para se obter uma concentração final de cerca de 10 -4 M. Esta solução diluída será utilizada como a solução de amostra para as medições de espectrometria de massa. A proporção efectiva do péptido para o ácido de referência, bem como a concentração final da solução da amostra será ajustado com base nas abundâncias sinais observados iões no espectrómetro de massa. </li><li> Utilizar o mesmo procedimento para preparar as amostras de soluções do péptido com as outras cinco ácidos referência. </li></ol> 2. Espectrometria de Massa de medição 1: Proton-bound Cluster Formação Ion <ol><li> O primeiro passo na medição de espectrometria de massa é a de gerar iões de fragmentação de protões ligados estáveis ​​do péptido com um ácido de referência. </li><li> Definir o instrumento no modo de ião negativo MS, com a voltagem da agulha ESI -4,5 kV e a voltagem capilar de cerca de -35 V, e a temperatura do gás de secagemmantida a 150 ° C. Definir a largura do pico Q1 e Q3 a largura do pico, tanto com a escala calibrada (A largura do pico é um parâmetro de instrumento que pode ser utilizado para ajustar a resolução dos picos. A definição &quot;escala calibrada&quot; permite mostrar picos estreitos para uma melhor separação dos picos ). A voltagem capilar e a temperatura do gás de secagem pode ser ajustada para melhorar a abundância de iões observados. </li><li> Infundir cerca de 0,5 ml da solução de amostra de péptido-DFAH numa seringa Hamilton de 1 mL e ligar a seringa para a entrada da agulha ESI utilizando tubagem de PEEK. Em seguida, coloque a seringa na bomba de seringa. Ligar a bomba de seringa para infusão da solução de amostra para dentro da agulha ESI com a taxa de fluxo a 10 ml / min. </li><li> Ligue a tensão agulha ESI para ativar o processo ESI. Ligue o detector. Um espectro de massa de exibição deve ser observada no modo de perfil. Se a tela estiver em modo de baricentro, mude para o modo de perfil. Assista o cluster formação de iões de prótons ligados por monitoring do pico a m / z 428. A abundância do sinal do ião cluster pode ser ajustado por afinar o instrumento. Um parâmetro importante é a voltagem capilar. Pode-se alterar manualmente a voltagem capilar (tipicamente na gama de -20 a -50 V) para maximizar a abundância do pico a m / z 428. </li></ol> 3. Espectrometria de Massa de medição 2: As Experiências de Bracketing CID <ol><li> O próximo passo é realizar o experimento bracketing CID. </li><li> Uma vez que a abundância do íon conjunto atinge o valor desejado (cerca de 100 mV), desligue o aparelho para o modo MS / MS. Neste modo, as funções de Q1 como um filtro para isolar o ião de cluster, Q2 como funções da célula de colisão, e funções Q3 como o analisador de massa de massa. </li><li> Definir o gás de colisão (árgon, neste caso) pressão a 0,5 mTorr e a energia de colisão de 17 eV. Três picos devem ser observados na janela de exibição espectro de massa. O pico a m / z 428 corresponde ao ião de cluster, [DFA • H • A 3 CS] ¯. Os dois picos a m / z 332 e m / z 95 correspondem ao péptido desprotonada (A 3 CS ¯) e o ácido difluoroacético desprotonada (DFA ¯), respectivamente. O pico menor a m / z 298 é derivado de um fragmento do péptido desprotonada. Adquirir um espectro CID para 2 min, Figura 3a. </li><li> Realizar experiências semelhantes CID e adquirir um espectro CID para a solução da amostra do péptido com o ácido bromoacético (MBAH), Figura 3b. </li><li> Realizar experiências semelhantes CID e adquirir o espectro de CID para as soluções de amostra de péptido com todos os outros ácidos de referência. Os espectros de CID resultante será qualitativamente semelhantes às Figuras 3a e 3b, mas os valores m / z e as alturas relativas dos picos será diferente. </li></ol> 4. Mass Spectrometry Medição 3: O Método Kinetic <ol><li> O último passo é a aquisição de espectros SRM. </li><li> Ligue a tela do espectro de centróide e definir o instrumento para o modo de monitoramento de reação selecionada (SRM). Mantenha m / z 428 como o íon isolado pelo primeiro quadrupolo (Q1), e preencher quatro massas (relações massa-carga) a ser monitorados pelo terceiro quadrupolo (Q3). As quatro massas são m / z 428 (ião cluster), m / z 332 (ião péptido), m / z 298 (o fragmento do péptido de iões), e m / z 95 (a DFA ¯ iões). Mantenha a pressão do gás de colisão em 0,5 mTorr. </li><li> Defina a energia de colisão a 11,7 eV e adquirir os espectros de 5 min. </li><li> Alterar a energia de colisão de 17,6 eV e adquirir espectros durante 5 min. </li><li> Mude a energia de colisão de 23,4 eV e 29,3 eV, e adquirir o espectro em ambas as energias de colisão por 5 min. </li><li> Realizar medições similares para o péptido, com todos os outros ácidos de referência. </li></ol> 5. Análise de Dados <ol><li> Copiar os valores das intensidades de iões de all espectros SRM em uma planilha do Excel. </li><li> Calcule os produtos índices de ramificação íon CID, ln ([A ¯] / [A ¯ i]), medido para todos os seis grupos de prótons ligados em todas as quatro energias de colisão. Os valores de amostra são apresentadas na Tabela 1. </li><li> Plotar os valores de ln ([A ¯] / [A ¯ i]) contra os valores de Δ ácido H i - Δ ácido H média. Isto vai dar quatro parcelas correspondentes aos dados de quatro energias de colisão, a Figura 4a. </li><li> Extraia os valores das encostas e os intercepta por regressão linear das quatro parcelas. Neste caso, as pistas são valores positivos e as intercepções são valores negativos. Dê o símbolo &quot;X&quot; para as pistas eo símbolo &quot;Y&quot; para as interceptações. Os resultados são apresentados na Tabela 2. Multiplicar os valores de Y e por -1 usar o símbolo Y &#39;representar os valores positivos (isto permite que o eixo y disjogar valores positivos). Note-se, esta conversão é opcional, desde que os valores correspondentes são usados ​​para fazer o lote para a próxima etapa. </li><li> Plotar os valores de Y &#39;contra os valores de X, figura 4b. Regressão linear da trama dá uma inclinação de 1,706 e uma interceptação de -0,536. A inclinação corresponde ao Δ ácido H - Δ ácido H média. O valor médio Δ ácido H é conhecida por ser 330,5 kcal / mol, o que é determinado pelo conjunto de ácidos referência seleccionadas. O valor da acidez da fase gasosa do péptido é então obtido a partir do declive: Δ ácido H (A 3 CH) = 332,2 kcal / mol. </li></ol>

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Nada a divulgar.

A medição bem sucedida da acidez em fase gasosa de um péptido depende em grande medida a selecção de ácidos de referência adequados. Os ácidos de referência ideais são compostos orgânicos estruturalmente semelhantes com valores de acidez em fase gasosa bem estabelecidas. Os ácidos de referência deve ter estruturas semelhantes uns aos outros. Isto irá assegurar uma entropia de desprotonação semelhante para cada um dos ácidos de referência no conjunto. Os ácidos de referência deve ter valores de acidez...

A acidez de resíduos de aminoácidos estão entre as mais importantes propriedades termoquímicos que influenciam as estruturas, a reactividade, e os processos de dobragem de proteínas que se desdobram-9,19. Resíduos de aminoácidos individuais mostram muitas vezes diferentes acidez eficazes dependendo de suas localizações em proteínas. Em particular, os resíduos localizados nos locais activos exibem frequentemente perturbado significativamente a acidez. Um exemplo é o resíduo de cisteína residentes nos sítios ativos do thioredoxin super-família de enzimas 20,21. A cisteína sítio ativo é extraordinariamente ácidos em relação aos de proteínas desdobradas 3-5. Tem sido sugerido que a conformação helicoidal pode ter uma contribuição significativa para a acidez incomum. Existem amplos estudos experimentais sobre as propriedades do ácido-base de péptidos realizadas em soluções, especialmente em soluções aquosas 2,6-8. Os resultados foram muitas vezes complicada por efeitos do solvente7. Na verdade, a maioria dos sítios ativos das proteínas estão localizadas perto da região do interior, onde os efeitos de solventes são minimizados 9,10. A fim de compreender as propriedades dos péptidos e proteínas intrínsecas ácido-base, é importante para a realização dos estudos em um ambiente livre de solvente. Apresentamos aqui um método baseado em espectrometria de massa para a determinação da acidez em fase gasosa. A abordagem é referido como o método cinético prolongado cozinheiros. Este método tem sido aplicado com sucesso a uma grande gama de sistemas químicos para a determinação de diversas propriedades termodinâmicas, tais como a acidez da fase gasosa, a afinidade do protão, a afinidade de ião de metal, a afinidade de electrões, e a energia de ionização 11-15, 22-26. Aplicou-se este método para determinar a acidez em fase gasosa de uma série de oligossacáridos de cisteína-cisteína e polialanina poliglicina péptidos 17,18,27. Esses estudos mostram que a cisteína N-terminal peptídeoes são significativamente mais ácida do que os correspondentes de C-terminal. As altas acidez da primeira são provavelmente devido aos efeitos conformacionais helicoidais em que o anião tiolato é fortemente estabilizados pela interacção com a hélice a macro-dipolo. Devido à natureza não-voláteis e termicamente lábil de péptidos, o método de cinética é a abordagem mais prática actualmente disponíveis para produzir o ácido-base termoquímica quantidades razoavelmente precisos de péptidos 28. O esquema geral e a equação associado com o método cinético são mostrados na Figura 1. A determinação da acidez em fase gasosa de um péptido (AH) começa com a formação de uma série de aniões de fragmentação de protões ligados, [A • • H A i] ¯ (ou [A ¯ • • H + A i ¯] ¯), na região da fonte de iões do espectrómetro de massa, em que A e A ¯ i ¯ desprotonados são as formas do péptido eos ácidos de referência, respectivamente. Os ácidos orgânicos são os compostos de referência conhecidos, com a acidez da fase de gás. Os ácidos de referência deve ter estruturas semelhantes uns aos outros (mas não necessariamente idêntico ao do péptido). A semelhança de estruturas entre os ácidos de referência assegura a semelhança das entropias de desprotonação entre eles. O aglomerado próton-bound aniões são seleccionados de massa e collisionally activado e subsequentemente dissociado utilizando dissociação induzida por colisão (CID) experiências para produzir os correspondentes aniões monoméricos, A e A ¯ i ¯, com constantes de taxa de K e K i, respectivamente, mostrados na Figura 1A. Se fragmentações secundárias são negligenciáveis, a taxa de abundância dos iões de fragmentos CID, [A ¯] / [A i ¯], representa uma medida aproximada do rácio das constantes de velocidade, k / k i. Sob a hipótese de que não há activat reversabarreiras de iões para a dissociação de ambos os canais, o ião do produto de CID ramificação rácios, ln [A °] / [A i ¯], será linearmente correlacionada com a acidez da fase gasosa do péptido (Δ ácido H) e os dos ácidos de referência (Δ ácido i H), como mostrado na Figura 1b. Nesta equação, Δ ácido H médio é a acidez média de fase gasosa dos ácidos de referência, Δ (Δ S) é o termo de entropia (que pode ser assumida constante se os ácidos de referência são estruturalmente semelhantes uns aos outros), R é o constante universal dos gases e T é a temperatura ef eficaz do sistema. A temperatura efectiva é um parâmetro empírico que depende de diversas variáveis ​​experimentais, incluindo a energia de colisão. O valor da acidez da fase gasosa é determinado pela construção de dois conjuntos de gráficos de termo-cinéticos. O primeiro conjunto é obretidos pela traçando ln ([A ¯] / [A i ¯]) contra Δ ácido H i - Δ ácido H médio, como mostrado na Figura 4a. Regressão linear trará um conjunto de linhas retas com as encostas de X = 1 / RT FEP e interceptações de Y = - [Δ ácido H - Δ ácido H médio] / RT FEP - Δ (Δ S) / R. O segundo conjunto de parcelas é obtido através da representação gráfica dos intercepta resultantes (Y) a partir do primeiro conjunto de encontro às inclinações correspondentes (X), conforme mostrado na Figura 4b. A regressão linear produz uma nova linha com um declive de Δ ácido H - Δ ácido H médio e uma intercepção de Δ (Δ S) / R. O valor de ácido Δ H é então obtido a partir do declive e o termo entropia, Δ (Δ S) é obtido a partir dea interceptação. Os experimentos são realizados usando um espectrómetro de massa de triplo quadrupolo, interligados a uma ionização por electrospray (ESI), fonte de iões. Um diagrama esquemático do espectrómetro de massa é mostrado na Figura 2. As experiências são realizadas por CID massa escolhendo os aniões de fragmentação de protões ligados com a primeira unidade de quadrupolo e permitindo que eles sofrem colisões com átomos de árgon vazados para a câmara de colisão, que é realizada a uma pressão de cerca de 0,5 mTorr. Os iões dos produtos de dissociação são analisados ​​em massa com a terceira unidade de quadrupolo. Os espectros de CID são registrados em várias energias de colisão com a faixa de m / z grande o suficiente para cobrir todas as possíveis fragmentos secundários. As intensidades de iões produtos CID são medidos, definindo o instrumento no modo de monitorização de reacção seleccionada (SRM) no qual a verificação é focada em iões dos produtos seleccionados. Os experimentos são realizados CID em quatro diferentes energias de colisão, o que corresponde aenergias de centro de massa (E cm) de 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 eV, respectivamente. A energia de centro de massa é calculado utilizando a fórmula: E = E cm laboratório [M / (M + m)], onde E é a energia de laboratório colisão no quadro de laboratório, m é a massa de árgon, e M é a massa do ião de cluster protão ligado. Neste artigo, usamos o oligopéptido Ala 3 CysNH 2 (CH 3) como composto modelo. O C-terminal está amidado e o grupo tiol (SH), do resíduo de cisteína será o local ácido. A selecção dos ácidos de referência adequado é crucial para o sucesso da medida da acidez em fase gasosa. Os ácidos de referência ideais são estruturalmente semelhantes (entre si) compostos orgânicos com valores de acidez em fase gasosa bem estabelecidas. Os ácidos de referência deve ter valores de acidez mais próximos daquele dos péptidos. Para o péptido A 3 CH, seis halogenados carboxylic ácidos são escolhidos como os ácidos de referência. Os seis ácidos de referência são o ácido cloroacético (MCAH), ácido bromoacético (MBAH), ácido difluoroacético (DFAH), ácido dicloroacético (DCAH), ácido dibromoacetic (DBAH) e trifluoroacico (TFAH). Dois deles, DFAH e MBAH, irá ser usado para ilustrar o protocolo.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Os resíduos de aminoácidos localizados em posições diferentes proteínas dobradas apresentam frequentemente diferentes graus de acidez. Por exemplo, um resíduo de cisteína localizado no ou perto do terminal N de uma hélice é muitas vezes mais ácido do que o que está em ou próximo do terminal C 1-6. Apesar de extensos estudos experimentais sobre as propriedades do ácido-base de péptidos foram efectuados na fase de condensado, em particular em soluções aquosas de 6-8, os resultados são muitas vezes complicada por efeitos do solvente 7. Na verdade, a maioria dos sítios ativos das proteínas estão localizadas perto da região do interior, onde os efeitos de solvente foram minimizados 9,10. A fim de compreender as propriedades dos péptidos e proteínas intrínsecas ácido-base, é importante para efectuar os estudos em um ambiente livre de solvente. Nós apresentamos um método para medir a acidez de oligopeptides na fase gasosa. Nós usamos uma cisteína contendo um oligopéptido, Ala 3 CysNH <sub&gt; 2 (CH 3), como composto modelo. As medições baseiam-se no método bem estabelecido cozinheiros cinético prolongado (Figura 1), 11-16. Os experimentos são realizados utilizando um espectrómetro de massa de triplo quadrupolo com uma interface de ionização por electropulverização (ESI), fonte de iões (Figura 2). Para cada amostra de péptido, vários ácidos de referência são seleccionados. Os ácidos orgânicos são os compostos de referência estruturalmente semelhantes conhecidos, com a acidez da fase de gás. Uma solução da mistura do péptido e de um ácido de referência é introduzida no espectrómetro de massa, e em fase gasosa de um protão ligado agrupamento aniónico do ácido péptido de referência é formado. O aglomerado próton-bound é massa isolada e posteriormente fragmentado via dissociação induzida por colisão (CID) experimentos. A abundância de iões dos fragmentos resultantes são analisados ​​usando uma relação entre as acidezes e cinéticas de dissociação do agrupamento de iões. A acidez da fase gasosa do péptido é então obtined por regressão linear das parcelas thermo-cinéticos 17,18. O método pode ser aplicado a uma variedade de sistemas moleculares, incluindo compostos orgânicos, aminoácidos e seus derivados, oligonucleótidos, e oligopéptidos. Ao comparar as acidezes de fase de gás medidos experimentalmente com os valores calculados para as diferentes conformações, os efeitos conformacionais nos acidez pode ser avaliada.

<ol><li> As experiências de escalonamento CID fornecer informação sobre as acidezes relativas do péptido em comparação com os ácidos de referência seleccionados. Dois espectros CID representante do peptídeo (CH 3) com dois ácidos de referência, e DFAH MBAH, são mostrados na Figura 3. Na Figura 3a a abundância de iões (altura do pico) do ião de péptido é mais fraca do que a de DFA ¯, e na Figura 3b, a abundância de iões dos iões péptido é mais forte do que a de ...

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Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

A determinação da acidez em fase gasosa de oligopéptidos contendo cisteína é descrito. As experiências são realizadas utilizando um espectrômetro de massas triplo quadrupolo. Os acidezes relativas dos péptidos são medidos através de ensaios de dissociação induzida por colisão, e as acidezes quantitativos são determinados utilizando os Cook extensas método cinético.

Determinação da acidez em fase gasosa de Oligopeptídeos

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

determination-of-the-gas-phase-acidities-of-oligopeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.0K visualizações.  University of the Pacific. A determinação da acidez em fase gasosa de oligopéptidos contendo cisteína é descrito. As experiências são realizadas utilizando um espectrômetro de massas triplo quadrupolo. Os acidezes relativas dos péptidos são medidos através de ensaios de dissociação induzida por colisão, e as acidezes quantitativos são determinados utilizando os Cook extensas método cinético.

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Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

Rápidas alto rendimento amilose Determinação em amostras liofilizadas tubérculo

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Química

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

A formação de estruturas biomoleculares ordenada pelo auto-montagem de pequenos peptídeos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls cause an increase in viscosity (often referred to as &#39;aging&#39;) during storage of bio-oils. As such, carbonyl content has previously been used as a method of tracking bio-oil aging and condensation reactions with less variability than viscosity measurements. Additionally, carbonyls are also responsible for coke formation in bio-oil upgrading processes. Given the importance of carbonyls in bio-oils, accurate analytical methods for their quantification are very important for the bio-oil community. Potentiometric titration methods based on carbonyl oximation have long been used for the determination of carbonyl content in pyrolysis bio-oils. Here, we present a modification of the traditional carbonyl oximation procedures that results in less reaction time, smaller sample size, higher precision, and more accurate carbonyl determinations. While traditional carbonyl oximation methods occur at room temperature, the Faix method presented here occurs at an elevated temperature of 80 &#176;C.

Here we present a potentiometric titration technique for accurately quantifying carbonyl compounds in pyrolysis bio-oils.

Determinação da carbonila grupos funcionais bio-óleos por Potentiometric Titulação: O Método Faix

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline earth-liquid metal alloys as functions of both composition and temperature in order to acquire thermodynamic data. The cell consists of a chemically stable solid-state CaF2-AF2 electrolyte (where A is the alkaline-earth element such as Ca, Sr, or Ba), with binary A-B alloy (where B is the liquid metal such as Bi or Sb) working electrodes, and a pure A metal reference electrode. Emf data are collected over a temperature range of 723 K to 1,123 K in 25 K increments for multiple alloy compositions per experiment and the results are analyzed to yield activity values, phase transition temperatures, and partial molar entropies/enthalpies for each composition.

This protocol describes the measurement of the electromotive force of alkaline-earth elements in liquid metal alloys at high temperatures (723-1,123 K) to determine their thermodynamic properties, including activity, partial molar entropy, partial molar enthalpy, and phase transition temperatures, over a wide composition range.

Determinação de propriedades termodinâmicas de líquidos alcalinos terrosos de ligas metálicas utilizando a técnica de força eletromotriz

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Desembaraçar as fibras de aramida de copolímero de alta resistência para permitir a determinação de suas propriedades mecânicas

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...