<p class="jove_content"&gt; Çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CHE-0.749.737) tarafından desteklenmiştir. Cihaz kullanım Pasifik Üniversitesi&#39;nde kütle spektrometresi Tesis tarafından sağlandı.</p

1. Örnek Çözeltisinin Hazırlanması <ol><li> Üretim peptidin stok çözeltileri ve 1:1 hacim oranında metanol ve suyun oluşturduğu karışık bir çözücü kullanılarak altı referans asit hazırlamaktadır. Stok çözeltileri, yaklaşık 10 -3 M arasında bir konsantrasyonda olması gerekir </li><li> 1.5 ml Eppendorf tüp Katı peptid örneği, 1 mg, 3 CH, tartılır ve metanol ve su karışımı bir çözücü 1.0 ml ve bir vorteks ile karıştırın. </li><li> Difluoroasetik asit (DFAH), 1 mg tartılır ve metanol ve su karışımı bir çözücü 1.0 ml ve bir vorteks ile karıştırın. </li><li> Diğer beş referans asitler kloroasetik asit (MCAH), bromoasetik asit (Mbah), dikloroasetik asit (DCAH), dibromoacetic asit (DBAH) ve trifloroasetik asit (TFAH) için stok çözümler yapmak için aynı prosedürü kullanın. </li><li> 1.5 ml lik Eppendorf tüpüne peptid stok solüsyonu yaklaşık 50 ul sistemi ve sa içine DFAH arasında stok solüsyonu yaklaşık 50 ul çizmekBeni Eppendorf tüp. Yaklaşık 10 -4 M bir son konsantrasyon elde etmek için metanol ve su karışımı bir çözücü 900 ul ile karışık çözeltisi ile seyreltilir Bu seyreltilmiş çözelti kütle spektrometresi ölçümleri için numune çözeltisi olarak kullanılır. Referans asit yanı sıra örnek çözeltinin nihai konsantrasyona peptid gerçek oranı, kütle spektrometresi, iyon gözlenen sinyal miktarlara göre ayarlanacaktır. </li><li> Diğer beş referans asitler ile peptid numunesi çözeltilerin hazırlanması için aynı prosedürü kullanarak. </li></ol> 2. Kütle Spektrometre Ölçüm 1: Proton bağlı Küme İyon Oluşumu <ol><li> Kütle spektrometrisi ölçüm ilk adım, bir referans asit ile peptidin stabil proton bağlı küme iyonları üretmektir. </li><li> -4.5 KV ESI iğne voltajı ile negatif iyon modunda, MS, yaklaşık -35 V ve kapiler voltajı ve kurutma gazı sıcaklığı alet setinin150 ° C &#39;de muhafaza Q1 pik genişliği ve Q3 pik genişliğini ayarlamak hem kalibre ölçekli (en tepe genişliği doruklarına çözünürlüğünü ayarlamak için kullanılabilecek bir araç parametredir. &quot;Kalibre ölçeği&quot; ayarı iyi tepe ayrılması için dar zirveleri görüntülemenize olanak sağlar .) Kılcal voltaj ve kurutma gazı sıcaklığı gözlenen iyon bollukları geliştirmek için ayarlanabilir. </li><li> 1 ml Hamilton şırınga içine peptid-DFAH bir örnek solüsyon 0.5 ml aşılamak ve PEEK boru kullanarak ESI iğne girişine şırınga bağlayın. Daha sonra şırınga pompası üzerine şırınga. 10 ul / dak akış hızı ile ESI iğne içine örnek solüsyonu aşılamak için şırınga pompası açın. </li><li> ESI işlemi etkinleştirmek için ESI iğne gerilim açın. Dedektör açın. Bir kütle spektrum ekran profil modunda dikkat edilmelidir. Ekran ağırlık merkezi modunda ise, profil moduna geçin. Audiomonitoring tarafından proton bağlı küme iyon oluşumu izleng m / z 428 de zirve. Küme iyonu sinyal bolluğu ince ayar cihazı tarafından ayarlanabilir. Önemli bir parametre, kılcal gerilimidir. Bir el m / z 428 Â&#39;da doruk bolluğu en üst düzeye çıkarmak için (tipik olarak -20 ila -50 V aralığında) ve kapiler voltajı değiştirebilir. </li></ol> 3. Kütle Spektrometre Ölçüm 2: CID çıkışı Deneyleri <ol><li> Bir sonraki adım CID braketi deneme yapmaktır. </li><li> Küme iyon bolluğu istediğiniz değeri (100 mV civarında) ulaştığında, MS / MS moduna araç geçiş. Bu modda, kütle analizi olarak küme iyonu, çarpışma hücre olarak Q2 fonksiyonlar ve Q3 fonksiyonları izole etmek için bir filtre kütlesi olarak S1 fonksiyonları. </li><li> Çarpışma gaz (argon, bu durumda) 0.5 mTorr basınç ve 17 eV çarpışma enerji ayarlayın. Üç tepe kitle spektrumu ekran penceresinde dikkat edilmelidir. M / z 428 de zirve küme iyon, [karşılıkDFA • H • A 3 CS] ¯. M / z 332 ve m / z 95 ° C&#39;de iki tepe sırasıyla deprotone peptit (3 CS ¯) ile deprotone difluoroasetik asit (DFA ¯) karşılık gelir. M / z 298 ikincil tepe deprotone peptid ikincil bir fragmanıdır. 2 dk, Şekil 3a için CID spektrum edinin. </li><li> Benzer CID deneyler ve bromoasetik asit (mbah), Şekil 3b, bir peptide örnek solüsyonu için bir CID spektrumu kazanır. </li><li> Benzer CID deneyleri ve diğer tüm referans asitler ile peptid numunesi çözeltiler için CID spektrumu kazanır. Elde edilen CID spektrumu Şekiller 3a ve 3b, niteliksel olarak benzer olacaktır, ancak m / z değerleri ve nispi zirve yüksekliklerinin farklı olacaktır. </li></ol> 4. Kütle Spektrometre Ölçüm 3: Kinetik Yöntemi <ol><li> Son adım SRM spektrumları edinmektir. </li><li> Ağırlık merkezi için spektrum ekran geçiş ve seçilen reaksiyon izleme (SRM) moduna cihazı ayarlayın. Ilk dört kutuplu (Q1) tarafından izole iyon olarak m / z 428 tutmak ve üçüncü dört kutuplu (Q3) tarafından izlenecek dört kitleler (kütle-to-ücret oranları) doldurun. Dört kütleleri m / z 428 (küme iyonu), m / z 332 (peptid iyonu), m / z 298 (peptid iyonunun fragmanı), m / z 95 (DFA ¯ iyon) vardır. 0.5 mTorr de çarpışma gaz basıncı tutun. </li><li> 11.7 eV çarpışma enerji ayarlayın ve 5 dakika boyunca spektrumları elde. </li><li> 17.6 eV çarpışma enerji değiştirin ve 5 dakika boyunca spektrumları elde. </li><li> 23.4 eV ve 29.3 eV çarpışma enerji değiştirin ve 5 dakika boyunca çarpışma enerjileri hem de spektrumları elde. </li><li> Diğer tüm referans asitler, peptid için benzer ölçümlerle gerçekleştirin. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Al iyon yoğunluğu değerlerini kopyalaExcel çalışma sayfası üzerine l SRM spektrumları. </li><li> CID ürün iyon dallanma oranları hesaplayın, ln ([A ¯] / [A i ¯]), dört çarpışma enerjileri de altı proton bağlı kümeler için ölçülen. Örnek değerleri Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Ln değerleri arsa ([A ¯] / [A i ¯]) Δ asit H i değerlerine karşı - Δ asit H ort. Bu dört çarpışma enerjileri, Şekil 4a&#39;da verilere karşılık gelen dört araziler verecektir. </li><li> Dört araziler lineer regresyon tarafından yamaçları ve yakaladığını değerlerini ayıklayın. Bu durumda, eğimli pozitif değerler ve yakaladığını negatif değerler bulunmaktadır. Sembolü yamaçları &quot;X&quot; ve sembolü &quot;Y&quot; yakaladığını verin. Sonuçlar Tablo 2&#39;de gösterilmiştir. -1 Ile Y değerlerini çarpın ve (bu dis y ekseni sağlar pozitif değerleri temsil için sembol Y &#39;kullanın) pozitif değerler oynar. Not, bu dönüşümü karşılık gelen değerleri bir sonraki aşama için çizim yapmak için kullanılabilir olduğu sürece, isteğe bağlı olarak. </li><li> X, Şekil 4b değerlerine karşı Y &#39;değerleri çizilir. Arsa lineer regresyon 1.706 bir eğim ve -0,536 bir yolunu kesmek verir. Δ asit H ort - eğim Δ asit H karşılık gelir. Δ asit H avg değeri seçilen referans asit grubu tarafından belirlenir 330.5 kcal / mol olduğu bilinmektedir. Peptidin gaz-fazlı asitlik değeri, daha sonra eğiminden elde edilir: H Δ asit (A 3 CH) = 332.2 kcal / mol &#39;. </li></ol>

<ol>
	<li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins.">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li><li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide.">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li><li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin.">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li><li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity.">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li><li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli.">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li><li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate.">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li><li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+&#945;-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family.">Ionization of cysteine residues at the termini of model &#945;-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li><li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+&#945;-Helical+Turn+and+&#946;-Turn+in+a+Model+Depsipeptide.">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between &#945;-Helical Turn and &#946;-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li><li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry.">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins.">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li><li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method.">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li><li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations.">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li><li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation:+Entropy+Effects,+Proton+Affinities,+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides.">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li><li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Li+,+Na+,+and+K++Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers.">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li><li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations:+Advances+and+Applications.">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li><li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method:+a+Statistically+Meaningful+Approach.">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li><li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I:+A3,4CSH+and+HSCA3,4.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li><li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides:+The+Effect+of+the+Cysteine+Position.">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science. , (1999).</li><li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons.">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li><li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily.">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics &amp; Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li><li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method.">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li><li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li><li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid.">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li><li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction.">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li><li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids.">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li><li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method.">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li><li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides.">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li><li>Gutte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).</li><li>Barany, G., Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+peptide+synthesis.">Solid-phase peptide synthesis.</a> The Peptides. 2, 1-284 (1979).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey.

Bir peptidin gaz-fazlı asit başarılı bir ölçüm büyük ölçüde uygun bir referans asitlerin seçimi dayanır. İdeal referans asitler köklü bir gaz-fazı asidite değeri olan yapısal olarak benzer bir organik bileşiklerdir. Referans asitler birbirinden yapısına benzer bir yapıya sahip olmalıdır. Bu dizi, referans asitlerin her biri için, deprotonasyon benzer bir entropi sağlayacaktır. Referans asit peptidlerin kişilerce yakın asit değerlerine sahip olmalıdır. Amidatlanmış C-terminali ile kıs...

Amino asit kalıntılarının asitliğe yapıları etkileyen en önemli özellikleri termokimyasal, reaktiflik ve protein 9,19 arasında katlama açılımı işlemler arasında bulunmaktadır. Tek tek amino asit kalıntıları, genellikle protein konumlarını bağlı olarak farklı etkin asitliğe göstermektedir. Özellikle, aktif siteler bulunan artıkları, çoğu zaman önemli ölçüde sergileyen asitliğe tedirgin. Böyle bir örnek, enzimler 20,21 tioredoksin süper-ailesinin aktif yerleri bulunan sistein kalıntısıdır. Aktif bölge sistin proteinleri 3-5 katlanmamış kıyasla alışılmadık asidiktir. Bu sarmal yapı olağandışı asitlik önemli bir katkı olabileceği öne sürülmüştür. Özellikle sulu çözeltiler 2,6-8 yılında, çözümler yürütülen peptidlerin asit-baz özellikleri hakkında kapsamlı deneysel çalışmalar vardır. Sonuçlar genellikle çözücü etkisi ile komplike edildi7. Aslında, protein, aktif siteye çözücü etkisi en aza indirilmiştir 9,10 İç bölge yakınında bulunmaktadır. Peptidlerin ve proteinlerin içsel asit-baz özelliklerini anlamak için, bir solvent içermeyen bir ortamda çalışmaları yürütmek için önemlidir. Burada gaz-fazlı asitlik belirlenmesi için kütle spektrometri tabanlı bir yöntemi geliştirmektir. Bu yaklaşım, genişletilmiş Aşçılar kinetik yöntemi olarak adlandırılır. Bu yöntem, başarılı bir şekilde, örneğin, gaz-fazı asitliği, proton afinitesi, metal iyon afinite, elektron afinite ile bağlanır ve iyonizasyon enerjisi 11-15 gibi çeşitli termokimyasal özellikleri, belirlenmesi için kimyasal sistemleri geniş bir uygulanmış 22-26. Biz, Oligo sistein polialanin ve sistein polyglycine peptidler 17,18,27 bir dizi gaz-fazlı asitliğe belirlemek için bu yöntemi uyguladık. Bu çalışmalar, N-terminal sistein peptidi olduğunu göstermektedirES karşılık gelen C-terminal olanlardan önemli ölçüde daha fazla asidik. Birincisinin yüksek asitliğe olasılıkla tiyolat anyonu güçlü bir sarmal makro-dipol ile etkileşimi tarafından stabilize edildiği sarmal konformasyon etkilerine bağlıdır. Çünkü peptidlerin uçucu olmayan ve termal kararsız doğanın, kinetik yöntemi peptidler 28 makul doğru asit-baz termokimyasal miktarlarda üretmek için şu anda mevcut en pratik yaklaşımdır. Genel şeması ve kinetik yöntemi ile ilişkili denklemi Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bir peptidin gaz-fazlı asit belirlenmesi (AH) proton bağlı küme anyonlar, bir dizi oluşumu ile başlar, [A • H • A i] ¯ (veya [A ¯ • H + • Bir alıstırma] ¯), kütle spektrometresi, iyon kaynağı bölgede, burada A ve A, ¯ alıstırma peptidin deprotone formları vesırasıyla referans asitleri içerir. Referans asitler bilinen gaz-fazı asitliğe sahip organik bileşiklerdir. Referans asitler (ancak, bir peptidin edilene benzer zorunlu değildir) birbirine benzer yapılara sahip olmalıdır. Referans asitler arasındaki yapıların benzerlik aralarında deprotanasyon entropileri benzerlik sağlar. Proton bağlı küme anyon karşılık gelen monomerik anyon elde etmek için çarpışma indüklenen ayrışma (CID) deneyleri kullanılarak kitle seçilir ve çarpışmalar ile aktive edilir ve daha sonra ayrışmış, A ve A, ¯ alıstırma, k ve k hız sabitleri i, sırasıyla, Şekil 1a&#39;da gösterilen ile. İkinci fragmentasyon ihmal edilebilir düzeyde ise, CID fragmanı iyonların bolluk oranı, [A ¯] / [A i ¯], hız sabiti k / k i oranı yaklaşık bir yaklaşımı temsil eder. Hiçbir ters aktive olduğunu varsayımı altındaHer iki kanal ayrışma, oranlar dallanma CID ürün iyon iyon engeller, ln [¯] / [A i ¯], doğrusal gaz-fazlı peptid asit (Δ asit H) ve kişilerce ilişkili olacaktır referans asitleri (Δ asit H I), Şekil 1B&#39;de gösterilmiştir. Bu denklemde, Δ asit H ort referans asitlerin ortalama gaz fazı asitliği olan, Δ (Δ S) entropi terimi (referans asitler yapısal olarak birbirine benzer ise sabit kabul edilebilir olan), R evrensel gaz sabitidir ve T eff sisteminin etkili bir şekilde sıcaklığıdır. Etkin sıcaklık çarpışma enerjisi de dahil olmak üzere bir çok deneysel değişkenlere bağlıdır, ampirik bir parametredir. Gaz-fazlı asitlik değeri, termo-kinetik araziler iki set yapımında tarafından belirlenir. Ilk seti ob olanLN işaretlenmesiyle tained ([A ¯] / [A i ¯]) Δ asit H I karşı - Δ asit H ort, Şekil 4a&#39;da gösterildiği. Doğrusal regresyon Y X = 1 / RT eff ve yakaladığını eteklerinde düz çizgiler bir dizi verecektir = - [Δ asit H - Δ asit H ort] / RT eff - Δ (Δ S) / R. Parsellerin ikinci seti, Şekil 4b&#39;de gösterildiği gibi, karşılık gelen eğimli karşı ilk grubu (X) &#39;dan elde edilen yakalar (E) çizilmesi ile elde edilir. Δ asit H avg ve Δ (Δ S) / R bir yolunu kesmek - Doğrusal regresyon Δ asit H bir eğimle yeni bir satır üretir. Δ asit H değeri, daha sonra eğiminden elde edilir ve entropi terimi, Δ (Δ S) elde edilirkesmek. Deneyler, bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyonu kaynağı ile ara-yüzeyi üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir. Kütle spektrometresinin şematik diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir. CID deneyler ilk kuadruple kitle birimi ile proton bağlı küme anyonlar seçilmesini ve yaklaşık 0.5 mTorr basıncında tutulur çarpışma odasının içine sızan argon atomu ile çarpışmaları geçmesi için izin vererek gerçekleştirilir. Ayrışma ürün iyonları kütle üçüncü kuadrupol ünitesi ile analiz edilmiştir. CID spektrumları tüm olası ikincil parçaları kapsayacak kadar geniş m / z aralığı ile çeşitli çarpışma enerjileri kaydedilir. CID ürün iyon yoğunlukları tarama seçilen ürünün iyonları odaklı olduğu seçilen reaksiyon izleme (SRM) modunda cihaz ayarı ile ölçülür. CID deneylere tekabül, dört farklı çarpışma enerjileri gerçekleştirilirsırasıyla 1.0, 1.5, 2.0, ve 2.5 eV, merkezi-of-kütle enerji (E cm). Merkezi bölgesinin kütle enerjisi denklem kullanılarak hesaplanır: E = E cm laboratuar [m / san (M + m)], D laboratuar laboratuar çerçeve içinde çarpışma enerjisi, m argon kütlesi ve M Proton bağlı küme iyon kütlesi. Bu yazıda, model bileşik olarak oligopeptid Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) kullanın. C-terminali amide edilen ve sistein tortusuna ait tiol grubu (SH), asidik sitesi olacaktır. Uygun bir referans asitlerin seçimi gaz-fazlı asitlik başarılı bir ölçüm için çok önemlidir. İdeal referans asit yapısal olarak benzer olan (birbirlerine) köklü bir gaz-fazı asidite değeri, organik bileşikler. Referans asit peptidler olduğu kadar yakın asit değerlerine sahip olmalıdır. Peptid, bir 3 CH için, altı carboxyli halojenlenmişC asitler, referans asitler olarak seçilmiştir. Altı referans asitler kloroasetik asit (MCAH), bromoasetik asit (mbah), difluoroasetik asit (DFAH), dikloroasetik asit (DCAH), dibromoacetic asit (DBAH) ve trifluoroasetik (TFAH) vardır. Bunlardan ikisi, DFAH ve mbah, protokol göstermek için kullanılacaktır.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Katlanmış proteinler farklı pozisyonlarda bulunan amino asit kalıntılarının çoğu asitliğe farklı derecelerde gösterirler. Örneğin, bir helezon N-ucunda veya yakınında bulunan bir sistein kalıntısı genellikle C-terminaline 1-6 ya da yakınında daha fazla asidiktir. Peptidlerin asit-baz özellikleri hakkında kapsamlı deneysel çalışmalar sulu çözeltiler 6-8 özellikle yoğunlaştırılmış aşamasında, yürütülen olmasına rağmen, sonuçlar genellikle çözücü etkisi 7 tarafından karmaşıktır. Aslında, protein aktif bölgelerin en çözücü etkisi 9,10 kısılmış iç bölümü yakınında bulunmaktadır. Peptidlerin ve proteinlerin içsel asit-baz özelliklerini anlamak için, bir solvent içermeyen bir ortamda çalışmalar yapmak için önemlidir. Bu gaz-fazında oligopeptidlerin asitliğe ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bir sistein ihtiva eden oligopeptid Ala, 3 CysNH kullanmak 3 CH). Ölçümler köklü uzatılmış Aşçılar kinetik yöntem (Şekil 1) 11-16 dayanmaktadır. Deneyler, bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iyonu kaynağı (Şekil 2) ile ara yüzey bağlantısı bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi ile gerçekleştirilmektedir. Her bir peptid örneği için, birçok referans asit seçilir. Referans asitler bilinen gaz-fazı asitliğe sahip yapısal olarak benzer organik bileşiklerdir. Peptid ve bir referans asit karışımı içindeki bir çözeltisi, kütle spektrometresi içine dahil edilir ve peptid-referans asidin bir gaz fazlı proton-bağlı anyonik kümesi oluşturulur. Proton bağlı küme kitle izole ve daha sonra çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) deney ile parçalanır. Ortaya çıkan parça iyon bolluğu asitliğe ve küme iyon ayrışma kinetik arasında bir ilişki kullanılarak analiz edilmektedir. Peptidin gaz fazı asitliği sonra obtai olduğutermo-kinetik araziler 17,18 doğrusal regresyonu ile Ned. Yöntem, organik bileşikler, amino asitler ve bunların türevleri, oligonükleotitler ve oligopeptitler gibi moleküler sistemlerin, çeşitli uygulanabilir. Farklı düzenleyicilerin için hesaplanan bu değerlere ile deneysel olarak ölçülen gaz-fazlı asitliğe karşılaştırarak, asitliğe ilgili yapısal etkileri değerlendirilebilir.

<ol><li> CID braketi deneyler seçilen referans asitlere göre peptid göreli asitliğe hakkında bilgi verir. Iki referans asitler, DFAH ve mbah ile peptit (3 CH) iki temsilci CID spektrumu, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Şekil 3A&#39;da peptid iyonunun iyon bolluk (tepe yükseklik) DFA bu ¯ ve Şekil 3b&#39;de, peptid iyon, iyon bolluğu MBA ¯ göre daha güçlü olan daha zayıftır. İki tayf peptidin gaz-fazlı asit, bu iki referans asitlerin asitliğe aralığında oldu?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides at JoVE.com

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Sistein içeren oligopeptidlerin gaz-fazlı asitliğe belirlenmesi açıklanmaktadır. Deneyler, bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir. Peptidlerin göreli asitliğe çarpışma ile indüklenen ayrışma deneyleri kullanılarak ölçülür ve kantitatif asitliğe genişletilmiş Aşçılar kinetik yöntem kullanılarak belirlenir.

Oligopeptidlerin Gaz fazlı asitliğe belirlenmesi

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

determination-of-the-gas-phase-acidities-of-oligopeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.0K Görüntüleme.  University of the Pacific. Sistein içeren oligopeptidlerin gaz-fazlı asitliğe belirlenmesi açıklanmaktadır. Deneyler, bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilir. Peptidlerin göreli asitliğe çarpışma ile indüklenen ayrışma deneyleri kullanılarak ölçülür ve kantitatif asitliğe genişletilmiş Aşçılar kinetik yöntem kullanılarak belirlenir.

Video: Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

Freeze Kurutulmuş Patates Yumru Örnekleri Hızlı Yüksek Verimli Amilozlu Belirlenmesi

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

Kimya

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

From Constructs to Crystals &amp;#8211; Towards Structure Determination of &amp;#946;-barrel Outer Membrane Proteins

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls cause an increase in viscosity (often referred to as &#39;aging&#39;) during storage of bio-oils. As such, carbonyl content has previously been used as a method of tracking bio-oil aging and condensation reactions with less variability than viscosity measurements. Additionally, carbonyls are also responsible for coke formation in bio-oil upgrading processes. Given the importance of carbonyls in bio-oils, accurate analytical methods for their quantification are very important for the bio-oil community. Potentiometric titration methods based on carbonyl oximation have long been used for the determination of carbonyl content in pyrolysis bio-oils. Here, we present a modification of the traditional carbonyl oximation procedures that results in less reaction time, smaller sample size, higher precision, and more accurate carbonyl determinations. While traditional carbonyl oximation methods occur at room temperature, the Faix method presented here occurs at an elevated temperature of 80 &#176;C.

Here we present a potentiometric titration technique for accurately quantifying carbonyl compounds in pyrolysis bio-oils.

Faix Yöntemi: Potansiyometrik Titrasyon tarafından Bio-yağlar Karbonil Fonksiyonel Grupların belirlenmesi

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline earth-liquid metal alloys as functions of both composition and temperature in order to acquire thermodynamic data. The cell consists of a chemically stable solid-state CaF2-AF2 electrolyte (where A is the alkaline-earth element such as Ca, Sr, or Ba), with binary A-B alloy (where B is the liquid metal such as Bi or Sb) working electrodes, and a pure A metal reference electrode. Emf data are collected over a temperature range of 723 K to 1,123 K in 25 K increments for multiple alloy compositions per experiment and the results are analyzed to yield activity values, phase transition temperatures, and partial molar entropies/enthalpies for each composition.

This protocol describes the measurement of the electromotive force of alkaline-earth elements in liquid metal alloys at high temperatures (723-1,123 K) to determine their thermodynamic properties, including activity, partial molar entropy, partial molar enthalpy, and phase transition temperatures, over a wide composition range.

Alkali toprak-sıvı Metal alaşımlar Elektromotor kuvvet tekniği kullanılarak termodinamik özelliklerinin belirlenmesi

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Disentangling yüksek mukavemetli kopolimer Aramid Elyaf mekanik özelliklerinin belirlenmesi etkinleştirmek için

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Synthesis and Structure Determination of &amp;#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, metal-binding interactions, and conformational shape. Coupling ESI with ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an instrumental technique that allows for simultaneous measurement of a peptide&#8217;s mass-to-charge (m/z) and collision cross section (CCS) that relate to its stoichiometry, protonation state, and conformational shape. The overall charge of a peptide complex is controlled by the protonation of 1) the peptide&#8217;s acidic and basic sites and 2) the oxidation state of the metal ion(s). Therefore, the overall charge state of a complex is a function of the pH of the solution that affects the peptides metal ion binding affinity. For ESI-IM-MS analyses, peptide and metal ions solutions are prepared from aqueous-only solutions, with the pH adjusted with dilute aqueous acetic acid or ammonium hydroxide. This allows for pH dependence and metal ion selectivity to be determined for a specific peptide. Furthermore, the m/z and CCS of a peptide complex can be used with B3LYP/LanL2DZ molecular modeling to discern binding sites of the metal ion coordination and tertiary structure of the complex. The results show how ESI-IM-MS can characterize the selective chelating performance of a set of alternative methanobactin peptides and compare them to the copper-binding peptide methanobactin.

Ion mobility-mass spectrometry and molecular modeling techniques can characterize the selective metal chelating performance of designed metal-binding peptides and the copper-binding peptide methanobactin. Developing new classes of metal chelating peptides will help lead to therapeutics for diseases associated with metal ion misbalance.

Metal Bağlama Oligopeptidlerinin Yapısı ve Mekanizmalarının Belirlenmesinde Iyon Hareketliliği-Kütle Spektrometresi Teknikleri ve Metal Bağlayıcı Oligopeptidlerin Redoks Aktivitesi

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Determination of the Photoisomerization Quantum Yield of a Hydrazone Photoswitch

Photoswitching organic molecules that undergo light-driven structural transformations are key components to construct adaptive molecular systems, and they are utilized in a wide variety of applications. In most studies employing photoswitches, several important photophysical properties such as maximum wavelengths of absorption and emission, molar attenuation coefficient, fluorescence lifetime, and photoisomerization quantum yield are carefully determined to investigate their electronic states and transition processes. However, measurement of the photoisomerization quantum yield, the efficiency of photoisomerization with respect to the absorbed photons, in a typical laboratory setting is often complicated and prone to error because it requires the implementation of rigorous spectroscopic measurements and calculations based on an appropriate integration method. This article introduces a set of procedures to measure the photoisomerization quantum yield of a bistable photoswitch using a photochromic hydrazone. We anticipate that this article will be a useful guide for the investigation of bistable photoswitches that are being increasingly developed.

Photoisomerization quantum yield is a fundamental photophysical property that should be accurately determined in the investigation of newly developed photoswitches. Here, we describe a set of procedures to measure the photoisomerization quantum yield of a photochromic hydrazone as a model bistable photoswitch.

Bir Hidrazon Fotoşalterinin Fotoizomerizasyon Kuantum Veriminin Belirlenmesi

Photoswitching organic molecules that undergo light-driven structural transformations are key components to construct adaptive molecular systems, and they ...

Avokadodaki Pestisitlerin QuEChERS Yöntemi ve CG-MS/MS Kullanılarak Analiz Edilmesi

Determination of 45 Pesticides in Avocado Varieties by the QuEChERS Method and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Gas chromatography (GC) tandem mass spectrometry (MS/MS) stands as a preeminent analytical instrument extensively employed for the surveillance of pesticide residues in food. Nevertheless, these methods are vulnerable to matrix effects (MEs), which can potentially affect accurate quantification depending on the specific combination of analyte and matrix. Among the various strategies to mitigate MEs, matrix-matched calibration represents the prevailing approach in pesticide residue applications due to its cost-effectiveness and straightforward implementation. In this study, a total of 45 representative pesticides were analyzed in three different varieties of avocado (i.e., Criollo, Hass, and Lorena) using the Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) method with ammonium formate and GC-MS/MS. 
For this purpose, 5 g of the avocado sample was extracted with 10 mL of acetonitrile, and then 2.5 g of ammonium formate was added to induce phase separation. Subsequently, the supernatant underwent a cleanup process via dispersive solid-phase extraction employing 150 mg of anhydrous MgSO4, 50 mg of primary-secondary amine, 50 mg of octadecylsilane, 10 mg of graphitized carbon black, and 60 mg of a zirconium oxide-based sorbent (Z-Sep+). The GC-MS/MS analysis was successfully performed in less than 25 min. Rigorous validation experiments were carried out to assess the performance of the method. The examination of a matrix-matched calibration curve for each variety of avocado revealed that the ME remained relatively consistent and less than 20% (considered as a soft ME) for most pesticide/variety combinations. Furthermore, the method&#180;s limits of quantification were lower than 5 &#181;g/kg for all three varieties. Finally, the recovery values for most pesticides fell within the acceptable range of 70-120%, with relative standard deviation values below 20%.

Pestisit Analizi için Amonyum Format ile QuEChERS Yöntemi Kullanılarak Avokado Numunesi Hazırlama

The present protocol describes the analysis of multiclass pesticide residues in avocado varieties using the Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) method with ammonium formate, followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry.