<p class="jove_content"&gt; 작품은 국립 과학 재단 (CHE-0749737)에 의해 지원되었다. 기기의 사용은 태평양의 대학에서 질량 분석 시설에 의해 제공되었다.</p

1. 샘플 솔루션의 준비 <ol><li> 먼저 펩타이드의 주식 솔루션과 1:1 부피비로 메탄올과 물의 혼합 용매를 사용하여 여섯 참조 지방산을 준비합니다. 주식 솔루션은 약 10 -3 M.의 농도가 있어야합니다 </li><li> 1.5 ML 에펜 도르프 튜브에 고체 펩타이드 샘플 1 MG, 3 CH를 밖으로 달아 메탄올과 물의 혼합 용매의 1.0 ML를 추가하고, 소용돌이를 사용하여 섞는다. </li><li> difluoroacetic 산 (DFAH) 1 밀리그램을 달아 메탄올과 물의 혼합 용매의 1.0 ML를 추가하고, 소용돌이를 사용하여 섞는다. </li><li> 다른 다섯 가지 기준 산 클로로 산 (MCAH), bromoacetic 산 (MBAH), 디클로로 산 (DCAH), dibromoacetic 산 (DBAH) 및 트리 플루오로 아세트산 (TFAH)에 대한 재고 솔루션을 만들기 위해 동일한 절차를 사용합니다. </li><li> 1.5 ML 에펜 도르프 튜브에 펩타이드 원액 50 μL를 그려 SA에 DFAH의 원액 50 μL를 그려나 에펜 도르프 튜브. 약 10 -4 M.의 최종 농도를 달성하기 위해 메탄올과 물의 혼합 용매의 900 μL와 혼합 용액을 희석 이 희석 용액은 질량 분석기 측정을위한 시료 용액으로 사용됩니다. 참고 산뿐만 아니라 시료 용액의 최종 농도 펩타이드의 실제 비율은 질량 분석기에서 관찰 된 이온 신호 농도에 따라 조정됩니다. </li><li> 다른 다섯 가지 기준 산과 펩타이드의 샘플 솔루션을 준비하는 동일한 절차를 사용합니다. </li></ol> 2. 질량 분석 측정 1 : 양성자 바인딩 클러스터 이온 형성 <ol><li> 질량 분석기 측정의 첫 번째 단계는 참조 산과 펩타이드의 안정적인 양자 바인딩 클러스터 이온을 생성하는 것입니다. </li><li> -4.5 kV의에서 ESI 바늘 전압 부정적인 이온 MS 모드, -35에 대한 V의 모세관 전압 및 건조 가스 온도에서 기기를 설정150 유지 ° C. Q1 피크 폭과 Q3 피​​크 너비를 설정 모두 보정 스케일 (에 최대 폭은 피크의 해상도를 조정하는 데 사용할 수있는 도구 매개 변수입니다. &quot;교정 규모&quot;설정이 더 피크 분리 좁은 피크를 표시 할 수 있습니다 ). 모세관 전압 및 건조 가스 온도는 관찰 이온 농도를 향상시키기 위해 조정할 수 있습니다. </li><li> 1 ML 해밀턴 주사기로 펩타이드 DFAH의 검액 0.5 mL를 주입하고 PEEK 튜빙을 사용하여 ESI 바늘 입구에 주사기를 연결합니다. 그런 다음 주사기 펌프 위에 주사기를 놓습니다. 10 μL / 분의 유량으로 ESI 바늘로 시료 용액을 주입하는 주사기 펌프를 켭니다. </li><li> ESI 과정을 활성화하기 위해 ESI 바늘 전압의 전원을 켭니다. 감지기의 전원을 켭니다. 질량 스펙트럼 디스플레이 프로필 모드에서 관찰되어야한다. 디스플레이가 중심 모드에있는 경우, 프로파일 모드로 전환합니다. monitori에 의해 양성자 바인딩 클러스터 이온 형성 시계NG M / Z 428의 최고. 클러스터 이온의 신호 풍요 로움은 미세 조정을 계기로 조정할 수 있습니다. 하나의 중요한 매개 변수는 모세관 전압이다. 하나는 수동 m / Z 428에서 피크의 풍요 로움을 극대화하기 위해 (일반적으로 -20 ~ -50 V의 범위에서) 모세관 전압을 변경할 수 있습니다. </li></ol> 3. 질량 분석기 측정 2 : CID 브라케팅 실험 <ol><li> 다음 단계는 CID 브라케팅 실험을 수행하는 것입니다. </li><li> 클러스터 이온의 풍부가 원하는 값 (mV에서 100 mV 정도)에 도달하면, MS / MS 모드로 기기를 전환합니다. 이 모드에서, 질량 분석기로 클러스터 이온 충돌 셀과 Q2 기능 및 Q3 기능을 분리 필터를 대량으로 Q1 기능을합니다. </li><li> 충돌 가스 (아르곤,이 경우) 0.5 mTorr의 압력에서 17 eV의시 충돌 에너지를 설정합니다. 세 개의 봉우리가 질량 스펙트럼 디스플레이 창에서 관찰되어야한다. M / Z 428의 피크 클러스터 이온 [에 대응DFA • H • 3 CS] ¯. M / Z 332 M / Z 95 개의 피크는 각각 탈수 소화 펩티드 (3 CS ¯) 및 탈수 소화 difluoroacetic 산 (DFA ¯)에 해당합니다. M / Z 298에서 작은 피크 탈수 소화 펩티드 보조 조각입니다. 2 분, 그림 3A를위한 CID 스펙트럼을 획득. </li><li> 유사한 CID 실험을 수행하고 bromoacetic 산 (MBAH), 그림 3b와 펩타이드의 샘플 솔루션에 대한 CID 스펙트럼을 획득. </li><li> 유사한 CID 실험을 수행하고 다른 모든 참조 산성 펩타이드의 샘플 솔루션 CID 스펙트럼을 획득. 결과 CID 스펙트럼은 그림의 3A 및 3B 질적으로 유사하지만, M / Z 값과 상대적인 피크 높이가 다릅니다. </li></ol> 4. 질량 분석기 측정 3 : 운동 방법 <ol><li> 마지막 단계는 SRM 스펙트럼을 획득하는 것입니다. </li><li> 중심에 스펙트럼 디스플레이를 전환하고 선택된 반응 모니터링 (SRM) 모드로 기기를 설정합니다. 첫 번째 사중 극자 (Q1)에 의해 분리 된 이온으로 m / Z 428을 유지하고 세 번째 사중 극자 (Q3)에 의해 모니터링 할 네 개의 질량 (질량 대 전하 비율)를 입력합니다. 네 개의 질량은 m / Z 428 (클러스터 이온), M / Z 332 (펩타이드 이온), M / Z 298 (펩타이드 이온의 조각), 및 M / Z 95 (DFA ¯ 이온)입니다. 0.5 mTorr의에서 충돌 가스 압력을 유지합니다. </li><li> 11.7 eV의에 충돌 에너지를 설정하고 5 분 동안 스펙트럼을 획득. </li><li> 17.6 eV의에 충돌 에너지를 변경하고 5 분 동안 스펙트럼을 획득. </li><li> 23.4 eV의, 그리고 29.3 eV의에 충돌 에너지를 변경하고, 5 분 동안 충돌 에너지 모두에서 스펙트럼을 획득. </li><li> 다른 모든 참조 산성 펩티드 유사한 측정을 수행합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 알에서 이온 농도의 값을 복사Excel 워크 시트 위에 내가 SRM 스펙트럼. </li><li> CID 제품 이온 분기 비율을 계산 LN ([A ¯] / [I ¯]), 네 개의 충돌 에너지의 모든 여섯 양성자 바인딩 클러스터에 대한 측정 하였다. 샘플 값은 표 1에 나타내었다. </li><li> LN의 값을 플롯 ([A ¯] / [I ¯]) Δ 산 H I의 값에 대하여 - Δ 산 H 평균. 이 네 개의 충돌 에너지, 그림 4A의 데이터에 해당하는 네 개의 플롯을 제공합니다. </li><li> 네 개의 그래프의 선형 회귀에 의해 슬로프와 차단의 값을 추출합니다. 이 경우, 슬로프 양의 값이며, 차단은 음수 값입니다. 심볼에 슬로프에 &quot;X&quot;와 상징 &quot;Y&quot;차단으로 제공합니다. 결과는 표 2에 나타내었다. -1 Y의 값을 곱하고 (이 표시를 y 축 수있는 양의 값을 나타내는 기호 Y &#39;를 사용) 양의 값을 재생할 수 있습니다. 참고이 변환은 해당 값이 다음 단계의 플롯을 만드는 데 사용되는만큼 사항입니다. </li><li> X, 그림 4b의 값에 대한 Y &#39;의 값을 플롯합니다. 음모의 선형 회귀는 1.706의 기울기와 -0.536의 절편을 얻을 수 있습니다. Δ 산 H 평균 - 기울기는 Δ 산 H에 해당합니다. Δ 산 H 평균의 값은 선택한 참조 지방산의 설정에 의해 결정됩니다 330.5 킬로 칼로리 / 몰, 것으로 알려져있다. 펩타이드의 기체 산도의 값은 다음의 기울기로부터 얻은 것입니다 : Δ 산 H를 (3 CH) = 332.2 킬로 칼로리 / 몰.에게 </li></ol>

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펩타이드의 기체 산도의 성공적인 측정은 주로 적절한 참조 지방산의 선택에 의존한다. 이상적인 레퍼런스 산 노포 기체 산도 값이 구조적으로 유사한 유기 화합물이다. 참고 지방산은 서로 유사한 구조를 가지고 있어야합니다. 이 세트의 참조 지방산 각각의 탈 양성자의 유사한 엔트로피를 보장합니다. 참고 아미노산은 펩티드의 그들에 가까운 산도 값이 있어야합니다. amidated C-말단에 짧은 시?...

아미노산 잔기의 산성도는 구조에 영향을 미치는 가장 중요한 열 화학적 성질, 반응성 단백질 9,19의 폴딩 전개 과정 중입니다. 각각의 아미노산 잔기들은 단백질에 자신의 위치에 따라 다른 효과 산성도를 보여줍니다. 특히, 활성 부위에있는 잔류 물은 종종 전시는 크게 산성도를 교란. 하나의 예는 효소 20,21의 티 오레 독신 슈퍼 가족의 활성 부위에 존재하는 시스테인 잔류 물이다. 활성 사이트 시스테인 단백질에게 3-5 펼쳐있는 사람에 비해 비정상적으로 산성이다. 그것은 나선형 형태가 특이한 산성에 상당한 기여가있을 수 있습니다 것을 제안했습니다. 특히 수용액 2,6-8에 솔루션을 수행 펩티드의 산 - 염기 특성에 대한 광범위한 실험 연구가있다. 결과는 종종 용매 효과에 의해 복잡하게되었다7. 사실, 단백질의 활성 사이트의 대부분은 용매 효과는 9,10를 최소화하는 내부 영역 근처에 위치하고 있습니다. 펩티드와 단백질의 고유 산 - 염기 특성을 이해하기 위해서는 용제가없는 환경에서 연구를 수행하는 것이 중요합니다. 여기서 우리는 기체 상 산도 측정을위한 질량 분석 기반 방법을 소개합니다. 접근 방식은 확장 요리사 운동 방법이라고합니다. 이 방법은 성공적으로 같은 기체 상 산도, 양성자 친화, 금속 이온 친 화성, 전자 친화, 그리고 이온화 에너지 11-15 등 다양한 열 화학적 특성의 측정을위한 화학 시스템의 넓은 범위에 적용되었습니다 22-26. 우리는 올리고 시스테인 polyalanine과 시스테인 polyglycine 펩티드 17,18,27 시리즈의 기체 상 산성도를 결정하기 위해이 방법을 적용했습니다. 이러한 연구는 N-말단 시스테인 펩타이드 보여ES는 해당 C-말단 것보다 훨씬 더 산성이다. 이전의 높은 산성도 가능성이 thiolate의 음이온이 강하게 나선 매크로 쌍극자와의 상호 작용에 의해 안정화되는 나선형 구조적인 효과 때문이다. 때문에 펩티드의 비 휘발성과 열적으로 불안정한 성격, 운동 방법은 펩티드 28의 비교적 정확한 산 - 염기 열화학 수량을 생산하기 위해 현재 사용할 수있는 가장 실용적인 방법입니다. 일반 체계 및 운동 방법과 관련된 방정식은 그림 1에 나타내었다. 펩타이드의 기체 상 산성의 결정은 (AH) 양성자 바인딩 클러스터 음이온의 일련의 형성으로 시작 [A • H • I] ¯ (또는 [A ¯ • H + • I ¯] ¯), 질량 분석기의 이온 소스 지역에서 어디 ¯와 나 ¯ 펩타이드의 탈수 소화 형태이며,각각 참조 지방산. 참고 지방산 알려진 기체의 산성도를 가진 유기 화합물이다. 참고 지방산 (그러나 펩타이드의 그것과 반드시​​ 유사하지) 서로 유사한 구조를 가지고 있어야합니다. 참고 지방산 사이의 구조의 유사성은 그 (것)들의 사이에서 탈 양성자의 엔트로피의 유사성을 보장합니다. 양성자 바인딩 클러스터 음이온은 해당 단량체 음이온을 산출하기 위해 충돌에 의한 해리 (CID) 실험을 사용하여 대량 선정 collisionally 활성화 이후 해리되어 ¯ 그리고 난 ¯, K와 K의 속도 상수 나, 각각 그림 1a와 같이와. 차 fragmentations가 무시할 경우, CID 조각 이온의 풍부한 비율 [A ¯] / [I ¯], 속도 상수, K / K I의 비율의 대략적인 측정을 나타냅니다. 어떤 역 activat가 없다는 가정하에모두 분리 채널 비율을 분기 CID 제품 이온 이온 장벽, LN [A ¯] / [I ¯], 선형 기체 상 펩타이드의 산도 (Δ 산 H)와 그 상관 관계가 될 것입니다 참조 지방산 (Δ 산 H I), 같은 그림 1b와 같이. 이 방정식에서, Δ 산 H 평균이 기준 지방산의 평균 기체 산도이며, Δ (Δ S)는 엔트로피 용어 (참조 지방산은 구조적으로 서로 유사하다 일정하게 가정 할 수있다)이며, R은 유니버설 가스 상수, 그리고 T EFF는 시스템의 유효 온도입니다. 유효 온도는 충돌 에너지를 포함한 여러 실험 변수에 따라 경험적 매개 변수입니다. 기체 산도의 값은 열 운동 플롯의 두 세트를 구성에 의해 결정됩니다. 첫 번째 세트는 OB입니다LN 음모를 꾸미고에 의한 것 ([A ¯] / [I ¯]) Δ 산 H 나에 대하여 - Δ 산 H 평균, 그림 4A에 표시. 선형 회귀는 Y의 X = 1 / RT EFF와 차단의 경사면과 직선의 집합을 얻을 것입니다 = - [Δ 산 H - Δ 산 H 평균] / RT EFF - Δ (Δ S) / R. 플롯의 두 번째 세트는 그림 4B에 표시된 해당 슬로프에 첫 번째 집합 (X)에서 발생 차단 (Y)를 플로팅하여 얻을 수 있습니다. Δ 산 H 평균과 Δ (Δ S) / R의 절편 - 선형 회귀 분석 Δ 산 H의 경사를 가진 새로운 라인을 생산하고 있습니다. Δ 산 H의 값은 다음의 기울기로부터 구할 때, 엔트로피 용어, Δ (Δ S는)에서 얻을 수있다차단. 실험은 전기 분무 이온화 (ESI) 이온 소스 인터페이스 삼중 사중 극자 질량 분석기를 사용하여 수행됩니다. 질량 분석기의 개략도는 그림 2에 표시됩니다. CID 실험은 질량이 첫 번째 사중 극자 기기와 양성자 바인딩 클러스터 음이온을 선택하고 그 주위에 0.5 mTorr의의 압력에서 개최되는 충돌 챔버로 유출 아르곤 원자와 충돌을받을 수 있도록하여 수행됩니다. 해리 제품 이온은 질량 번째 사중 극자 단위로 분석됩니다. CID 스펙트럼은 모든 가능한 보조 조각을 커버 할 수있을만큼 넓은 M / Z 범위를 여러 충돌 에너지에 기록됩니다. CID 제품 이온 농도는 검사가 선택한 제품 이온에 집중되는 선택된 반응 모니터링 (SRM) 모드로 기기를 설정하여 측정됩니다. CID 실험에 해당하는 네 가지 충돌 에너지에서 수행됩니다각각 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5 eV로의 중심의 질량 에너지 (E cm). 중심의 질량 에너지 방정식을 사용하여 계산됩니다 : E cm = E 실험실 [M / (M + m)은] E 실험실 실험실 프레임의 충돌 에너지이고, M은 아르곤의 질량이고, M은 양성자 바인딩 클러스터 이온의 질량. 이 문서에서는, 우리는 모델 화합물로 올리고 펩티드 알라모 3 CysNH 2 (3 CH)를 사용합니다. C-말단은 amidated과 시스테인 잔기의 티올 그룹 (SH)은 산성 사이트가 될 것입니다. 적절한 참조 지방산의 선택은 기체 상 산성의 성공적인 측정을 위해 매우 중요합니다. 이상적인 기준 지방산은 구조적으로 유사하다 (서로에게) 잘 확립 된 기체 산도 값을 가진 유기 화합물. 참고 아미노산은 펩티드의 가까운 산도 값이 있어야합니다. 펩타이드 3 CH 들어, 여섯 carboxyli 할로겐화C 지방산은 참조 지방산으로 선택됩니다. 여섯 참고 지방산 클로로 산 (MCAH), bromoacetic 산 (MBAH), difluoroacetic 산 (DFAH), 디클로로 산 (DCAH), dibromoacetic 산 (DBAH) 및 트리 플루오 (TFAH)입니다. 그 중 두 DFAH 및 MBAH이 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

접힌 단백질의 다른 위치에있는 아미노산 잔기들은 산성도의 다른 정도를 나타냅니다. 예를 들어, 나선의 N-말단에 또는 근처에있는 시스테인 잔류 물은 종종 C-말단 1-6로 인근보다 더 산성이다. 펩티드의 산 - 염기 특성에 대한 광범위한 실험 연구는 수용액 6-8 특히 응축 단계에서 실시되어 있지만, 결과는 종종 용매 효과 7에 의해 복잡하게된다. 사실, 단백질의 활성 사이트의 대부분은 용매 효과 9,10 최소화 된 내부 영역 근처에 위치하고 있습니다. 펩티드와 단백질의 고유 산 - 염기 특성을 이해하기 위해서는 용제가없는 환경에서 연구를 수행하는 것이 중요합니다. 우리는 가스 단계에 올리고 펩타이드의 산성도를 측정하는 방법을 제시한다. 우리는 시스테인 함유 올리고 펩티드, 알라모 3 CysNH를 사용 (3 CH). 측정은 잘 확립 확장 요리사 운동 방법 (그림 1) 11-16를 기준으로합니다. 실험은 전기 분무 이온화 (ESI) 이온 소스 (그림 2)와 인터페이스 트리플 사중 극자 질량 분석기를 사용하여 수행됩니다. 각 펩타이드 샘플은 여러 가지 기준 지방산이 선택됩니다. 참고 지방산 알려진 기체 상 산성도와 구조적으로 유사한 유기 화합물이다. 펩타이드 및 레퍼런스 산의 혼합 용액을 질량 분석기에 도입되고, 펩타이드 참조 산의 기체 상 수소 이온 바인딩 음이온 클러스터가 형성된다. 양성자 바인딩 클러스터 대량 고립 이후 충돌에 의한 해리 (CID) 실험을 통해 조각화되어 있습니다. 결과 조각 이온 농도는 산성도와 클러스터 이온 해리 반응 속도 사이의 관계를 사용하여 분석됩니다. 펩타이드의 기체 산도는 obtai입니다열 운동 플롯 17,18 선형 회귀 네드. 이 방법은 유기 화합물, 아미노산과 그들의 유도체, 올리고 뉴클레오티드 및 올리고 펩타이드 등의 분자 시스템의 다양한 적용 할 수 있습니다. 다른 conformers 계산하는 값을 실험적으로 측정 된 가스 단계 산성도를 비교하여, 산성도에 구조적 효과를 평가할 수 있습니다.

<ol><li> CID 브라케팅 실험은 선택된 참조 지방산에 비해 펩타이드의 상대적인 산성도에 대한 정보를 제공합니다. 두 개의 레퍼런스 산, DFAH 및 MBAH와 펩티드 (3 CH)의 두 가지 대표적인 CID 스펙트럼은 그림 3에 나와 있습니다. 그림 3A에서 펩타이드 이온의 이온 풍부 (최대 높이) DFA의 ¯, 그리고 그림 3b에서, 펩타이드 이온의 이온 풍부 MBA ¯보다 강한 것보다 약한 것입니다. ?...

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Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

시스테인 함유의 올리고 펩타이드의 가스 단계 산성도의 결정은 설명합니다. 실험은 트리플 사중 극자 질량 분석기를 사용하여 수행됩니다. 펩티드의 상대적인 산성도는 충돌에 의한 분리 실험을 사용하여 측정하고 있으며, 양적 산성도가 확장 요리사에게 운동 방법을 사용하여 결정됩니다.

올리고 펩타이드의 가스 단계 산성도의 결정

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

determination-of-the-gas-phase-acidities-of-oligopeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.0K 조회수.  University of the Pacific. 시스테인 함유의 올리고 펩타이드의 가스 단계 산성도의 결정은 설명합니다. 실험은 트리플 사중 극자 질량 분석기를 사용하여 수행됩니다. 펩티드의 상대적인 산성도는 충돌에 의한 분리 실험을 사용하여 측정하고 있으며, 양적 산성도가 확장 요리사에게 운동 방법을 사용하여 결정됩니다.

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Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

냉동 건조 된 감자 괴경 샘플의 신속한 높은 처리량 아밀로스 결정

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

연구

화학

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

짧은 펩타이드의 자기 조립에 의해 주문 생체 고분자 구조의 형성

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Determination of Carbonyl Functional Groups in Bio-oils by Potentiometric Titration: The Faix Method

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls cause an increase in viscosity (often referred to as &#39;aging&#39;) during storage of bio-oils. As such, carbonyl content has previously been used as a method of tracking bio-oil aging and condensation reactions with less variability than viscosity measurements. Additionally, carbonyls are also responsible for coke formation in bio-oil upgrading processes. Given the importance of carbonyls in bio-oils, accurate analytical methods for their quantification are very important for the bio-oil community. Potentiometric titration methods based on carbonyl oximation have long been used for the determination of carbonyl content in pyrolysis bio-oils. Here, we present a modification of the traditional carbonyl oximation procedures that results in less reaction time, smaller sample size, higher precision, and more accurate carbonyl determinations. While traditional carbonyl oximation methods occur at room temperature, the Faix method presented here occurs at an elevated temperature of 80 &#176;C.

Here we present a potentiometric titration technique for accurately quantifying carbonyl compounds in pyrolysis bio-oils.

Carbonyl compounds present in bio-oils are known to be responsible for bio-oil property changes upon storage and during upgrading. Specifically, carbonyls ...

Determination of Thermodynamic Properties of Alkaline Earth-liquid Metal Alloys Using the Electromotive Force Technique

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline earth-liquid metal alloys as functions of both composition and temperature in order to acquire thermodynamic data. The cell consists of a chemically stable solid-state CaF2-AF2 electrolyte (where A is the alkaline-earth element such as Ca, Sr, or Ba), with binary A-B alloy (where B is the liquid metal such as Bi or Sb) working electrodes, and a pure A metal reference electrode. Emf data are collected over a temperature range of 723 K to 1,123 K in 25 K increments for multiple alloy compositions per experiment and the results are analyzed to yield activity values, phase transition temperatures, and partial molar entropies/enthalpies for each composition.

This protocol describes the measurement of the electromotive force of alkaline-earth elements in liquid metal alloys at high temperatures (723-1,123 K) to determine their thermodynamic properties, including activity, partial molar entropy, partial molar enthalpy, and phase transition temperatures, over a wide composition range.

A novel electrochemical cell based on a CaF2 solid-state electrolyte has been developed to measure the electromotive force (emf) of binary alkaline ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

그들의 기계적 특성의 결정 수 있도록 고 강도 공중 합체 Aramid 섬유 disentangling

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...