Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos forman la Universidad de Nueva York. Agradecemos a Maitreya Dunham y Matt Brauer que inicialmente desarrolló el uso de biorreactores Sixfors como quimiostatos.

El principio de cultivo continuo utilizando un quimiostato se puede realizar en una variedad de implementaciones. En todos quimiostatos que es esencial contar con 1) los métodos para mantener la esterilidad de todos los componentes, 2) una cultura bien mezclado, 3) la aireación adecuada del recipiente de cultivo y 4) un medio fiable de adición de los medios y la cultura de eliminación. Aquí, se describe el uso de un biorreactor Sixfors (Infors Inc) como un quimiostato usando métodos que se pueden adaptar fácilmente a configuraciones alternativas. 1. Montaje de los buques Chemostat <ol><li> Encienda los Sixfors utilizando el interruptor principal. </li><li> Enjuague bien el recipiente quimiostato, montaje agitador y tubo conectado con agua desionizada (DI). Compruebe todos los tubos y las juntas tóricas y reemplace cualquier pieza desgastada buscando. </li><li> Asegúrese de que la base de soporte del eje de accionamiento está mirando hacia arriba en el recipiente de vidrio y que la parte superior del eje de accionamiento se encaja a presión en su alojamiento en el montaje de agitador. Ajuste el stirreconjunto de r en el recipiente de vidrio asegurar la parte inferior del árbol de accionamiento se asienta en el soporte del eje de accionamiento. Utilice la abrazadera para asegurar el conjunto agitador al recipiente de cristal. </li><li> Llenar el depósito con alrededor de 300 ml de agua DI. </li><li> Retire las tapas de un oxígeno disuelto (OD 2) sonda y controlar el nivel del electrolito desenroscando la carcasa inferior y asegurándose de que la carcasa inferior se llena hasta la mitad con la solución electrolítica. Atornillar la carcasa inferior y se insertan en el puerto en el buque quimiostato. Atornille hasta que quede apretado dedo. </li><li> Tome una sonda de pH y de sacarlo de su tampón de almacenamiento (3 M KCl). Retire la tapa de la sonda de pH y adjuntar a fermentador 1. El uso de la pantalla de control Sixfors, navegue hasta el menú de parámetros fermentador y seleccione &quot;Calibrar pH&quot;. Coloque la sonda de pH en un tampón estándar de pH 7 y registrar la lectura como Sumo Read. Repita con el tampón de pH 4 y registrar la lectura tan bajo Leer. Desconecte la sonda de pH del fermentador, lavar con agua DI e inserte la sonda into el puerto en el buque quimiostato. Atornille hasta que quede apretado dedo. </li><li> Colocar el recipiente quimiostato en el bastidor. Nota sobre el buque que fermentador (1-6) la sonda de pH fue conectado y calibrado. Coloque la tapa de la sonda de pH en la sonda de pH. El uso de papel de aluminio herméticamente cubre la parte superior del sensor de oxígeno 2. </li><li> Doble lámina sobre los extremos de la tubería conectada al recipiente de quimiostato. </li><li> Repita los pasos 1.2 a 1.8 para todos los buques. </li><li> Esterilizar los recipientes en autoclave durante 15 min en un ciclo de líquido. </li></ol> 2. Preparación de los Medios de Comunicación <ol><li> Establecer el rango límite de las concentraciones de nutrientes por el crecimiento de cultivos de lotes en diferentes concentraciones de nutrientes. El nutriente es limitante en el rango donde la densidad celular final es una función lineal de la concentración inicial de nutrientes (Figura 4). Seleccionar una concentración de nutrientes dentro del rango limitante. Ejemplos de composición de medios estándar para los estudios con Saccharomycess cerevisiae están disponibles en 7-11. </li><li> Autoclave una bombona vacía que se tapó con un tapón de goma que contiene una entrada de aire y la salida de los medios de comunicación después de asegurarse primero de que el extremo del tubo de los medios de comunicación está cubierta en papel de aluminio. </li><li> En un recipiente separado preparar 10 l de medio. </li><li> Coloque una taza de filtro 500 ml de una botella 100 ml de medio. Quite el filtro de algodón con pinzas esterilizadas en etanol y adjuntar inmediatamente al puerto de filtración en la bombona de medios. </li><li> Coloque la bombona medios a una fuente de vacío y filtro de esterilización de los medios de comunicación mediante la adición a la copa del filtro. </li><li> Cuando la filtración de los medios de comunicación se ha completado, cierre la terminal portuaria de filtración con una abrazadera de metal. </li></ol> 3. Calibración de haces 2 Sondas y configuración quimiostato <ol><li> Después de los vasos chemostat se han sometido a autoclave y se dejó enfriar lugar el buque en su chaqueta de calor correspondiente. Conecte la sonda de temperatura, sonda de pH y DO 2 de la sonda. Deje que elbuque se sientan con el poder durante al menos 6 horas para permitir que la DO 2 sondas para polarizar. </li><li> Coloque el extremo de cada tubo de efluente en un recipiente de recolección separada. Conecte el suministro de aire a través de un filtro esterilizado en autoclave y encienda el flujo de aire. El agua en cada recipiente debe fluir fuera de los tubos de efluentes, lo que indica que todas las juntas se forman correctamente. </li><li> Ajuste la altura del tubo de efluente de acuerdo con el volumen de trabajo deseada (por ejemplo 300 ml). Nosotros usamos una regla que está marcado con la colocación de tubos calibrados para diferentes volúmenes de trabajo. </li><li> Conecte la bombona media de la embarcación quimiostato. Utilice el etanol con el fin de mantener el tubo termina tan estéril como sea posible. Pase el tubo de la bomba a través de la bomba y la pinza abierta. Presione manualmente la bomba hasta que los medios de comunicación comienza a fluir dentro del recipiente de quimiostato. Soltar la tubería de la bomba, los medios de comunicación deben fluir libremente en el recipiente quimiostato. Cuando los medios de comunicación llega al tubo de efluente, vuelva a conectar la tubería a la bomba y la abrazadera. </li><li> Comience running el programa básico con el conjunto impulsor de 400 rpm y la temperatura ajustada a 30 ° C. </li><li> Para calibrar hacer 2 sondas, corte el suministro de aire y cambiar a gas nitrógeno. Espere al menos una hora y registro de valor medida como &quot;bajo de lectura&quot;. Cambie de nuevo al suministro de aire (es decir, que contiene la concentración de oxígeno del ambiente), espere por lo menos una hora adicional y medición expediente como &quot;de lectura es alto&quot;. </li><li> Iniciar el registro de datos utilizando el software Iris. </li></ol> 4. Inoculación <ol><li> Utilice etanol al 70% para esterilizar la parte superior del recipiente de cultivo. </li><li> Retire el tornillo en la parte superior del vaso y de la pipeta 1 ml de un cultivo de una noche en el vaso quimiostato. Vuelva a apretar el tornillo. </li><li> Indique el momento de la inoculación en Iris. </li><li> Espere aproximadamente 24 horas para que las culturas alcanzan la fase estacionaria temprana. A medida que la cultura crece, el oxígeno disuelto y pH disminuirá. En el caso de los medios de comunicación limitantes de glucosa, oxígeno disuelto volverá a ~ 100% en PHA estacionariaSE. Para otras limitaciones de nutrientes de oxígeno disuelto se mantendrá &lt;100% en la fase estacionaria. </li></ol> 5. Iniciando Bombas y alcance del estado continuo <ol><li> La velocidad de dilución se calcula dividiendo la velocidad de flujo (la cantidad de medios de comunicación fluye en el recipiente por hora) por el volumen de cultivo. Por ejemplo, con un volumen de 300 ml de una tasa de dilución de 0,1 significa que se añaden 30 ml de medio de cultivo cada hora. Debido a que el sistema está bajo presión positiva el mismo volumen se retira del recipiente asegurando que el cultivo se diluye continuamente. Una gama de tasas de dilución (D) se puede utilizar que no excedan la tasa máxima de crecimiento (μ max) de las células, por encima del cual las células se lavan fuera de la quimiostato. </li><li> Elija la configuración de la bomba, que especifican el número de segundos que la bomba esté encendido y apagado, para establecer el caudal deseado. La bomba suministra los medios de comunicación a una velocidad de ~ 0,11 ml / seg. </li><li> Definir un programa utilizando la int Sixforserface que especifica la sincronización de la bomba, la temperatura y la velocidad del impulsor. Inicie el programa. </li><li> Vacíe los recipientes de recolección de líquidos y registrar el tiempo. </li><li> Después de por lo menos dos horas, utilice un cilindro graduado para medir la cantidad de medios de comunicación ha sido retirado de la embarcación. Esta será igual el volumen que ha sido añadido al recipiente de quimiostato. Calcular la tasa de dilución (D = V efluentes / V cultura / tiempo). Ajuste la configuración de la bomba si la tasa de dilución calculada no coincide con la tasa de dilución deseado. </li><li> En el estado estacionario, la densidad celular en el quimiostato no cambia con el tiempo. Esto se puede medir sin perturbar la cultura mediante el muestreo de la salida. Nos operacionalmente definimos consecución de estado estacionario como mediciones de la densidad de células idénticas que están separadas por al menos una duplicación de la población. Alcanzar el estado de equilibrio tendrá una duración aproximada de ocho generaciones de cultivo después de la iniciación de la dilución de la cultura. En el estado estacionario, las células crecen de manera exponencial (es decire. tasa de crecimiento constante en el tiempo) en condiciones de nutrientes limitados. El tiempo de duplicación de la población (tiempo de generación) es ln (2) / D. </li><li> Continuar para medir periódicamente los volúmenes de efluentes durante la duración del experimento para asegurar que se mantiene una tasa de dilución constante. </li></ol> 6. Aplicación 1: El estudio de las células que crecen a ritmos diferentes en condiciones de estado estacionario <ol><li> En el estado estacionario en el quimiostato, la tasa de crecimiento de la población de células es igual a la tasa de dilución. Al alterar sistemáticamente la tasa de dilución que es posible cultivar células a diferentes velocidades. Esto permite que el estudio sistemático de los parámetros fisiológicos que varían con la tasa de crecimiento como el volumen celular, la fase del ciclo celular y la resistencia al estrés. Además, los perfiles en estado estacionario de ARNm global, la proteína y los niveles de metabolitos se pueden ensayar en células que crecen a tasas diferentes. Hay dos maneras de adquirir muestras: </li><li> Muestras pequeñas pueden ser pasivamente obcontenida colocando el extremo del tubo de efluente en un tubo de 1,5 ml o 15 ml. Una muestra de 1-5 ml se puede conseguir en unos pocos minutos (dependiendo de la tasa de flujo). Muchos de los parámetros fisiológicos pueden ser medidos de estas muestras. </li><li> La expresión de genes, o metabolitos análisis requieren muestras más grandes que se deben obtener lo más rápidamente posible. Coloque el extremo del tubo de efluente en un tubo cónico de 15 ml. Suelte el tornillo que sujeta el extremo metálico del tubo de efluentes y empuje suavemente hacia abajo. A ~ 10 ml de muestra será rápidamente llenar el tubo. Tenga en cuenta que el volumen en el recipiente quimiostato ha cambiado. Si se toman muchas muestras consecutivas puede ser necesario para reducir el flujo para mantener una tasa de dilución constante. </li></ol> 7. Aplicación 2: Medición precisa de diferencias en desarrollo las tasas entre los genotipos en ambientes controlados utilizando los ensayos de la competencia basada en Citometría de Flujo <ol><li> Quimiostatos se pueden utilizar para cuantificar con precisión el efecto de la concentración de nutrientessobre las diferencias en las tasas de crecimiento (es decir, la aptitud) entre los distintos fondos genéticos. Por cepas co-cultivo de la etiqueta con diferentes proteínas fluorescentes se determina la tasa de cambio en la abundancia relativa durante el crecimiento exponencial. La ejecución de este ensayo a diferentes tasas de dilución (D) permite el estudio de los efectos de la concentración de nutrientes (s) sobre las diferencias de condición física. </li><li> Establecer cultivos de estado estacionario de las dos cepas en los vasos chemostat separadas con tasas de dilución idénticas y un volumen de 300 ml. </li><li> Pasivamente muestra de 1 ml de cada buque. Decantar células, volver a suspender en tampón fosfato salino (PBS) y se pone a 4 ° C. Estas muestras contienen muestras de células homogéneas, que son controles para el análisis de citometría de flujo subsiguiente. </li><li> Colocar el tubo de efluente de un recipiente en un cilindro graduado en autoclave. Suelte el tornillo que sujeta el extremo metálico del tubo de efluentes y empuje suavemente hacia abajo para expulsar a las células del quimiostato. ¿Cuándoel volumen llega a 150 ml, de regreso el extremo metálico del tubo de efluente a su posición original (300 ml). Repita con el segundo recipiente, usando un cilindro graduado diferente. </li><li> Utilice etanol al 70% para mantener la esterilidad mientras se quita el tornillo en la parte superior del recipiente quimiostato. Coloque el embudo en la abertura y verter 150 ml de la otra cultura en el vaso quimiostato. Vuelva a apretar el tornillo. Repita con el segundo recipiente, usando el segundo embudo. Cada buque quimiostato ahora contiene una mezcla de las dos cepas. </li><li> Obtener una muestra de 1 ml de cada buque que utilice muestreo pasivo cada 2-6 horas. Centrifugar las células, resuspender en PBS y se almacena a 4 ° C. Siga tomando muestras para el registro de 2-3 días cuidadosamente el tiempo de cada muestra fue tomada. </li><li> Al final del experimento, se somete a ultrasonidos y diluir las muestras a ~ 2 x 10 6 células / ml. Usando citometría de flujo, medir la proporción de las dos cepas en cada muestra. Como ambas cepas están creciendo de manera exponencial, la diferencia de la tasa de crecimiento relativo esdeterminado por regresión lineal de ln (strain1/strain2) frente al tiempo (medido en generaciones). La pendiente de la regresión es la diferencia proporcional en la tasa de crecimiento (es decir, la ventaja de la aptitud) de una cepa con respecto al otro. </li><li> A medida que el cultivo mixto puede tomar algún tiempo para alcanzar un nuevo estado de equilibrio, los momentos oportunos pueden adaptarse mal a la regresión. Este problema se resuelve mejor permitiendo 2-3 generaciones que transcurran antes de comenzar el muestreo o eliminar puntos tempranos que son los valores extremos claros. Por el contrario, una vez que una cepa ha outcompeted la otra los datos ya no son útiles y estos puntos deben ser excluidos. </li></ol> 8. Aplicación 3: Evolución Experimental <ol><li> Evolución Experimental realizado en quimiostatos selecciona para los mutantes que se incrementan en la aptitud en el entorno limitado de nutrientes. La selección se realiza generalmente a través de cientos de generaciones. </li><li> Establecer una cultura quimiostato en estado estacionario utilizando una cepagenotipo conocido (y secuencia del genoma de preferencia se conocen) y un nutriente limitación definida. </li><li> Para mantener un &quot;registro fósil&quot; de la población que se adapta pasivamente muestrear quimiostato cada 2-3 días y almacenar la muestra en 15% de glicerol a -80 ° C. </li><li> Supervisar el depósito de medio y reponer con medio fresco como sea necesario. </li><li> Mantener la cultura de crecimiento exponencial para varios cientos de generaciones. </li><li> Después de la terminación de la placa de selección de una muestra de células en placas de agar sólido. Después las células se han convertido en colonias, recoger una muestra no sesgada de las colonias utilizando palillos de dientes e inocular clones en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos que contiene 100 l de los medios de comunicación. Permita que las muestras clonales crezcan durante la noche, añadir 100 ml de glicerol al 30% y guárdelo en -80 ° C. </li><li> Caracterizar los clones mediante secuenciación de todo el genoma y la realización de ensayos fenotípicos, incluyendo la evaluación de la aptitud, utilizando una cepa de referencia marcado con fluorescencia común, tal como se describe en la Solicitud de 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Quimiostatos permiten el cultivo de microbios en condiciones de estado estacionario de crecimiento controlado. Las células crecen continuamente a una velocidad constante que resulta en un ambiente externo invariante. Esto es en contraste con los métodos de cultivo por lotes en el que el entorno externo está cambiando continuamente y la tasa de crecimiento de las células se determina por la interacción compleja de medio ambiente y genotipo. Por lo tanto, una ventaja importante de cultivo de microbios en quimiostatos...

El crecimiento de las células está regulada por complejas redes de interacción de factores genéticos y ambientales 1,2. La regulación multifactorial del crecimiento celular requiere un enfoque a nivel de sistema para su estudio. Sin embargo, el estudio riguroso de crecimiento celular regulada se ve desafiada por la dificultad de controlar experimentalmente la velocidad a la que crecen las células. Por otra parte, incluso en los experimentos simples condiciones extracelulares son con frecuencia dinámico y complejo como células alteran continuamente su entorno ya que proliferan. Una solución a estos problemas es proporcionada por el quimiostato: un método de cultivo de células que permite el control experimental de las tasas de crecimiento de células en entornos definidos, invariantes y controlados. El método de cultivo continuo utilizando un quimiostato fue descrita independientemente por Monod 3 y Novick y Szilard 4 en 1950. Tal como se concibió originalmente, las células se cultivan en un volumen fijo de los medios de comunicación que es CONcontinuamente se diluye mediante la adición de los nuevos medios y la eliminación simultánea de los viejos medios de comunicación y las células (Figura 1). Acoplados ecuaciones diferenciales ordinarias (Figura 2) describen la tasa de cambio en la densidad de células (x) y la concentración de un nutriente (s) que limita el crecimiento en el recipiente de quimiostato. Es importante destacar que este sistema de ecuaciones predice un único (distinto de cero) estable en estado estacionario (Figura 3) con la notable implicación de que en el estado estacionario, la tasa de crecimiento específico de las células (es decir, la constante de velocidad de crecimiento exponencial) es igual a la tasa en el que el cultivo se diluye (D). Mediante la variación de la tasa de dilución es posible establecer poblaciones en estado estacionario de las células a diferentes tasas de crecimiento y en diferentes condiciones de limitación de nutrientes. El control experimental de la tasa de crecimiento utilizando quimiostatos fue fundamental para el desarrollo de una comprensión de cómo los cambios de la fisiología celularcon tasas de crecimiento de 5,6. Sin embargo, este antiguo pilar de métodos microbiológicos hizo cada vez más oscura durante la explosión en la investigación de la biología molecular a finales del siglo XX. Hoy en día, el renovado interés en el control de crecimiento en ambos microbios y organismos multicelulares y el advenimiento de los métodos a escala del genoma de análisis a nivel de sistemas, ha renovado la motivación para el uso de quimiostatos. A continuación, describimos tres aplicaciones que aprovechan el control preciso de las tasas de crecimiento de células y el medio externo que son únicamente posibles con quimiostatos. En primer lugar, se describe el uso de quimiostatos para investigar cómo la abundancia de miles de biomoléculas - tales como transcripciones y metabolitos - están regulados coordinadamente con la tasa de crecimiento. En segundo lugar, se describe la forma quimiostatos pueden utilizarse para obtener estimaciones precisas de las diferencias de tasas de crecimiento entre los diferentes genotipos en ambientes con nutrientes limitados utilizando experimentos de competición. En tercer lugar, se describe cómo se puede quimiostatosser utilizado para estudiar la evolución adaptativa de las células que crecen en entornos pobres en nutrientes constantes. Estos ejemplos ilustran la forma en que quimiostatos están permitiendo a las investigaciones a nivel de los sistemas de regulación del crecimiento celular, génica mediante interacciones ambientales y la evolución adaptativa.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td>
			<td>Appropriate Technical Resources, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle 9.5 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-887-1</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinchcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-867</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopper, Size 12, Green Neoprene</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-62991-42</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connector</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-30703-02</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General purpose ties 4 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9557052</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone Rubber</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>B000FMWTDE</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 3/8 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 7/32 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1E</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K164</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K161</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook Connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-66-18Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratchet Clamp</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-06403-11</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Female</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45512-34</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Male</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45513-04</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MTGR05010</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9131037</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Air</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32047-77</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Nitrogen</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32048-63</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Proportioner Multitube Frames</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-50</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator, Two-Stage Analytical</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12-N145D580</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Adaptor, Stainless Steel</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y99-26450</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Male Adaptor</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>WES544</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norprene Tubing</td>
			<td>US Plastics</td>
			<td>57280</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod Base</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-58</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Cartridges</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03217-92</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboy 10 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-963-2A</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP-T10-RE</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-800-100</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride&middot;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424205000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423400010</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate&middot;5H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209198</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60400</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferric chloride&middot;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>I88-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate&middot;H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium molybdate&middot;2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC24330-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>folic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inositol (aka myo-inositol)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC12226-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>niacin (aka nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-aminobenzoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC14621-2500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9755</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>riboflavin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4500-25G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP892-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000-100G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0155-08-5</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of chemostats in microbial systems biology

Las células regulan su tasa de crecimiento en respuesta a señales desde el mundo exterior. A medida que la célula crece, diversos procesos celulares deben estar coordinados incluyendo la síntesis macromolecular, metabolismo y en última instancia, el compromiso con el ciclo de división celular. El quimiostato, un método de controlar experimentalmente tasa de crecimiento celular, proporciona un medio poderoso para estudiar sistemáticamente cómo afecta la tasa de crecimiento de los procesos celulares - incluyendo la expresión génica y el metabolismo - y las redes reguladoras que controlan la tasa de crecimiento de las células. Cuando mantenido por cientos de generaciones quimiostatos se puede utilizar para estudiar la evolución de adaptación de microbios en las condiciones ambientales que limitan el crecimiento celular. Se describe el principio de las culturas chemostat, demostrar su funcionamiento y ofrecer ejemplos de sus diversas aplicaciones. Tras un período de inactividad después de su introducción en el medio del siglo XX, la convergencia de las metodologías a escala del genoma con un renovado enterés en la regulación del crecimiento celular y la base molecular de la evolución adaptativa es estimular un renacimiento en el uso de quimiostatos en la investigación biológica.

Una ventaja importante de quimiostatos es la capacidad de controlar la tasa de crecimiento de las células experimentalmente mediante la variación de la tasa de dilución. En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, la morfología de una célula es informativo de su fase en el ciclo de división celular. Las poblaciones con tasas de crecimiento más altas contienen una mayor proporción de división activa las células según se determina mediante la medición de la fracción de células unbudded (Fig...

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The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Tasa de crecimiento celular es un proceso regulado y un determinante principal de la fisiología celular. Cultivo continuo usando quimiostatos permite el control extrínseca de la tasa de crecimiento de las células por la limitación de nutrientes facilitar el estudio de las redes moleculares que controlan el crecimiento celular y cómo estas redes evolucionan para optimizar el crecimiento celular.

El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.5K vistas.  New York University.  Tasa de crecimiento celular es un proceso regulado y un determinante principal de la fisiología celular. Cultivo continuo usando quimiostatos permite el control extrínseca de la tasa de crecimiento de las células por la limitación de nutrientes facilitar el estudio de las redes moleculares que controlan el crecimiento celular y cómo estas redes evolucionan para optimizar el crecimiento celular. 

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Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

La investigación de la comunidad microbiana en el intestino de termitas - Entrevista

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Investigación

Biología

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Comunidades microbianas en la naturaleza y de laboratorio - Entrevista

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biología de las comunidades microbianas - Entrevista

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desarrollar herramientas de diagnóstico

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life activities. Its high prevalence in general population and the severe limitations it causes, point out the necessity to find new efficient strategies to treat it. Together with the cognitive-behavioral treatments, relaxation represents a useful approach for the treatment of GAD, but it has the limitation that it is hard to be learned. The INTREPID project is aimed to implement a new instrument to treat anxiety-related disorders and to test its clinical efficacy in reducing anxiety-related symptoms. The innovation of this approach is the combination of virtual reality and biofeedback, so that the first one is directly modified by the output of the second one. In this way, the patient is made aware of his or her reactions through the modification of some features of the VR environment in real time. Using mental exercises the patient learns to control these physiological parameters and using the feedback provided by the virtual environment is able to gauge his or her success. The supplemental use of portable devices, such as PDA or smart-phones, allows the patient to perform at home, individually and autonomously, the same exercises experienced in therapist's office. The goal is to anchor the learned protocol in a real life context, so enhancing the patients' ability to deal with their symptoms. The expected result is a better and faster learning of relaxation techniques, and thus an increased effectiveness of the treatment if compared with traditional clinical protocols.

The Project on Virtual Reality Intelligent Multi-sensor System for the Treatment of Anxiety-related Disorders (INTREPID) is aimed at developing a multi-sensor context-aware virtual reality system for the treatment of anxiety-related disorders.

El uso de la biorretroalimentación en Realidad Virtual Clínica: El Proyecto de INTREPID

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in the environment, as well as directly for the transmission of pathogens to drinking water supplies. Natural porous media is composed of an intricate physical topology, varied surface chemistries, dynamic gradients of nutrients and electron acceptors, and a patchy distribution of microbes. These features vary substantially over a length scale of microns, making the results of macro-scale investigations of microbial transport difficult to interpret, and the validation of mechanistic models challenging. Here we demonstrate how simple microfluidic devices can be used to visualize microbial interactions with micro-structured habitats, to identify key processes influencing the observed phenomena, and to systematically validate predictive models. Simple, easy-to-use flow cells were constructed out of the transparent, biocompatible and oxygen-permeable material poly(dimethyl siloxane). Standard methods of photolithography were used to make micro-structured masters, and replica molding was used to cast micro-structured flow cells from the masters. The physical design of the flow cell chamber is adaptable to the experimental requirements: microchannels can vary from simple linear connections to complex topologies with feature sizes as small as 2 &mu;m. Our modular EcoChip flow cell array features dozens of identical chambers and flow control by a gravity-driven flow module. We demonstrate that through use of EcoChip devices, physical structures and pressure heads can be held constant or varied systematically while the influence of surface chemistry, fluid properties, or the characteristics of the microbial population is investigated. Through transport experiments using a non-pathogenic, green fluorescent protein-expressing Vibrio bacterial strain, we illustrate the importance of habitat structure, flow conditions, and inoculums size on fundamental transport phenomena, and with real-time particle-scale observations, demonstrate that microfluidics offer a compelling view of a hidden world.

Microfluidic devices can be used to visualize complex natural processes in real time and at the appropriate physical scales. We have developed a simple microfluidic device that mimics key features of natural porous media for studying growth and transport of bacteria in the subsurface.

Ventana en un micromundo: Sistemas sencillos de microfluidos para el estudio de transporte de microbios en medios porosos

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Determinación de la Contribución de los Sistemas de energía durante el ejercicio

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil determines the rate of decomposition by microbial communities as well as recycle rates of nitrogen (N) and carbon (C) sequestration1,2. Plant litter comprises the majority of detritus3, and so it is assumed that decomposition is only marginally influenced by biomass inputs from animals such as herbivores and carnivores4,5. However, carnivores may influence microbial decomposition of plant litter via a chain of interactions in which predation risk alters the physiology of their herbivore prey that in turn alters soil microbial functioning when the herbivore carcasses are decomposed6. A physiological stress response by herbivores to the risk of predation can change the C:N elemental composition of herbivore biomass7,8,9 because stress from predation risk increases herbivore basal energy demands that in nutrient-limited systems forces herbivores to shift their consumption from N-rich resources to support growth and reproduction to C-rich carbohydrate resources to support heightened metabolism6. Herbivores have limited ability to store excess nutrients, so stressed herbivores excrete N as they increase carbohydrate-C consumption7. Ultimately, prey stressed by predation risk increase their body C:N ratio7,10, making them poorer quality resources for the soil microbial pool likely due to lower availability of labile N for microbial enzyme production6. Thus, decomposition of carcasses of stressed herbivores has a priming effect on the functioning of microbial communities that decreases subsequent ability to of microbes to decompose plant litter6,10,11.
We present the methodology to evaluate linkages between predation risk and litter decomposition by soil microbes. We describe how to: induce stress in herbivores from predation risk; measure those stress responses, and measure the consequences on microbial decomposition. We use insights from a model grassland ecosystem comprising the hunting spider predator (Pisuarina mira), a dominant grasshopper herbivore (Melanoplus femurrubrum),and a variety of grass and forb plants9.

We present methods to evaluate how predation risk can alter the chemical quality of herbivore prey by inducing dietary changes to meet demands of heightened stress, and how the decomposition of carcasses from these stressed herbivores slows subsequent plant litter decomposition by soil microbes.

Vinculación de riesgo de depredación, Estrés Fisiológico herbívoro y descomposición microbiana de los desechos de las plantas

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Diseño y Análisis Del Comportamiento De Preferencia De Temperatura Y Su Ritmo Circadiano En Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...