Creación del video fue apoyado por becas del Centro Nacional para Recursos de Investigación (5P41RR011823-17) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (8 GM103533 P41-17) de los Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo también fue apoyado por NSF subvención 1120425. MJD es una Fundación Rita Allen Scholar. AWM es apoyado en parte por el NIH T32 HG00035. Damos las gracias a Anna Sunshine para obtener ayuda con la mejora de los protocolos. Además, reconocemos Sara DiRienzi, Payen Celia, y Sirr Amy como los primeros usuarios de los ministats.

Utilice una técnica estéril apropiada durante todo el protocolo. 1. Montaje de piezas y preparación para la matriz Ministat <ol><li> Encargar todas partes. </li><li> Limpiar los tubos de vidrio. Marque los tubos con un volumen de 20 ml. </li><li> Hacer asambleas de corcho con aire, medios de comunicación y los puertos de efluentes y colocarlos en la parte superior de los tubos de cultivo de vidrio limpios. </li><li> Preparar cámaras de humidificación y organizar todas las piezas no tratadas en autoclave. </li><li> Hacer aire, efluentes, y los tubos de medios con longitudes suficientes tubos y acoplamientos compatible. </li><li> Conecte cada tipo de tubería (aire, medios de comunicación y efluente) a los conjuntos de corcho y los filtros de papel de aluminio y los medios de comunicación. Conexión rápida a fin de prepararlos para el autoclave </li><li> Preparar una bombona para su uso en la fabricación de chemostat medio estéril. </li><li> Prepare las botellas de muestreo de cultivo mediante la inserción de un tapón de goma con dos orificios con los accesorios adecuados. Frustrar cada filtro para prepararlos para la autoclave. </li><li> Fit la matriz montado fácilmente en una o más bandejas autoclave y dejar todas las partes. </li><li> Marca y filtrar los medios de comunicación chemostat en bombonas autoclave. </li></ol> 2. Configuración de una prueba <ol><li> Llena cada frasco con 700 ml hidratación ddH 2 O. </li><li> Coloque los ministats autoclave en el conjunto de bloque de calentamiento a la temperatura deseada. </li><li> Coloque las compañías aéreas en el múltiple de 4 puertos y encienda la bomba de aire. </li><li> Conecte los conductos de evacuación a las 100 botellas de la colección ml. </li><li> Retirar la lámina desde el extremo de la tubería de medios de comunicación y medios de bombona y conectar el rápido de dos conecta. Pase cada uno de longitud de tubo de la bomba a través de un cartucho de bomba peristáltica y haga clic en su lugar. Encienda la bomba de medios de comunicación. </li><li> Vamos a llenar las cámaras. Apague la bomba de medios de comunicación. </li><li> Pulverizar los conjuntos de corcho con 70% de etanol y inocular los cultivos utilizando una jeringa. Guardar una muestra del inóculo como un stock de glicerol congeladosi se desea. Vamos culturas crecer durante 30 horas. </li><li> Ajustar la altura de la aguja efluente hasta que el volumen de cultivo se ajusta a 20 ml con el flujo de aire apagado. Esto puede tardar varios ajustes en el transcurso de una hora. Cuando termine su vez el flujo de aire de nuevo. </li><li> Encienda la bomba multimedia en. </li><li> Vaciar las botellas de muestreo de efluentes, que contienen los medios de comunicación recogieron durante el ajuste del volumen de cultivo de trabajo, y registrar el tiempo. </li><li> Para tomar un lugar medición del tiempo de cero a los conductos de evacuación en tubos de recolección estériles durante 15 minutos-2 horas (dependiendo de qué volumen desea muestrear para análisis de ADN). También hacer una reserva de glicerol congelado para cada cultura en este momento si lo desea. </li></ol> 3. Las mediciones diarias <ol><li> Al igual que con el tiempo-cero de medición, la muestra en hielo durante 15 min-2 h (como se requiere para la prueba) en hielo y registrar el tiempo de muestreo para el ADN y las muestras congeladas de stock. </li><li> Para las muestras de ARN o bien recoger una pequeña volbio mediante una jeringa y una aguja 22G 5 &quot;de la cultura o descorchar cada Ministat para cosechar toda la cultura. Las muestras deben ser tomadas rápidamente, recogió por filtración y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. </li><li> Mida el efluente retenido desde la última toma de muestras para cada Ministat para cuantificar la tasa de dilución. Ajuste de dilución si es necesario por el reajuste de la configuración de la bomba o el ajuste del ajuste fino en las líneas individuales de la bomba. </li><li> Vuelva a colocar los conductos de evacuación en botellas de colección vacía. </li><li> Cuantificar células / ml, así como criterios de valoración de interés y hacer una reserva de glicerol congelado. </li></ol> 4. Post-experimento limpieza <ol><li> Coloque todos los tubos en bandejas separadas y enjuagar excesivamente con ddH 2 O. Tubería seca con una bomba de acuario. </li><li> Limpie los conjuntos de corcho con ddH 2 O y usar inserto la aguja para limpiar las agujas, aspirar y dispensar agua a su vez. Limpiar el exterior de las agujas y de corcho para eliminar cualquiermedios residuales. </li><li> Limpiar el tubo de vidrio con agua y etanol, y eliminar los contaminantes físicos con 3 bola con Kimwipes y fórceps. </li><li> Enjuague y seque todas las partes de nuevo antes de su uso. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen conflictos de interés.

Cultivo en chemostat los ministats, como con cualquier chemostat, requiere atención al detalle y la resolución de problemas. Dado que la contaminación es de gran preocupación en experimentos con cultivos continuos, se suelen mirar a través de microscopio en busca de contaminación bacteriana y fúngica tras la inoculación y cada 50 generaciones durante experimentos de evolución a largo plazo. Hasta la fecha no hemos observado contaminación a través de 96 experimentos de evolución de más de 300 generaciones (datos no mostrados). Para la prueba de contaminación cruzada entre ministats y el potencial de microbios para colonizar la cámara de cultivo por medio de la línea de efluente que corrió 16 ministats tales que cada Ministat otro se inoculó con la levadura como anteriormente y el resto no se inocularon con cualquier cultura. Los cultivos se recogen en un contenedor de residuos comunales, que se vació cada dos días. Así, si fuera posible que los contaminantes para entrar a través de la línea de efluente que probablemente han observado que en este experiment. Durante tres semanas y más de 100 generaciones de crecimiento en este patrón de tablero de ajedrez de los cultivos inoculados y no inoculadas No se observó crecimiento en no inoculadas tubos de cultivo MINISTAT, lo que sugiere que la contaminación de la levadura u otros microbios exterior es poco probable que ocurra en los experimentos de marcos de tiempo similares. Aunque los ministats fueron diseñadas para operar en un modo análogo a quimiostatos comerciales, la naturaleza modular de esta disposición permite la optimización para adaptarse a las necesidades del usuario y el presupuesto. La bomba peristáltica utilizada en este protocolo pueden lograr tasas de flujo entre 0,0186 vol / hora a 3,6 vol / h (datos no mostrados). Mayor control de las tasas de dilución se podría lograr con modelos de bombas alternativos. Tenga en cuenta que la operación a tasas de dilución inferiores pueden requerir la sustitución de una aguja de calibre más alto para lograr la misma frecuencia de entrega de las gotitas. Tamaño de la población es un factor importante para el diseño adecuado de los experimentos de evolución.La tasa de dilución estándar y la concentración de nutriente utilizado aquí proporciona un tamaño de población relativamente grande (~ 10 9 células) del mismo orden de magnitud que los estudios publicados evolución. 11 poblaciones más grandes o más pequeñas podría ser mantenida por cambiar el volumen de trabajo o limitar la concentración de nutrientes. Aumento en el suministro mutación también podría obtenerse trabajando con cepas con elevadas tasas de mutación. Los ministats también podría ser mejorado en nuestro diseño actual. Por ejemplo, la condensación puede acumularse en las paredes del tubo de cultivo y se puede reducir considerablemente mediante el uso de un baño de agua profunda, incubadora, o sala a temperatura constante. Aunque aglutinación y crecimiento de la pared en sulfato de cultivos limitados parece ser relativamente poco frecuente, apareciendo en experimentos de evolución 5/48 por 300 generaciones (datos no mostrados), una variedad de tensioactivos están disponibles que pueden ayudar a disminuir o retrasar este rasgo. En el caso de que interfiere con la formación de grumos cultivo adecuadola mezcla y agitación, aumento se puede lograr mediante la reducción de la cantidad de formas se divide cada bomba de aire, o mediante la adición de un aparato de agitación. Sondas adicionales para la concentración de gas disuelto, pH, u otros parámetros también pueden ser incluidos, como en algunos otros diseños. 17 A pesar de las modificaciones posibles, utilizando los ministats como se describe en este protocolo, se observó parámetros experimentales altamente consistentes y reproducibles resultados al comparar nuestro dispositivo con los datos reportados por quimiostatos de mayor volumen comercial. Esto incluyó la reproducibilidad de la fisiología celular como se ve a través de alcanzar el estado estacionario de equilibrio dentro de 10-15 generaciones (Figura 2A) y la obtención de densidades similares de cultivo en el equilibrio. Patrones de expresión génica fueron consistentes entre los tres repeticiones biológica en ministats y entre ministats y comerciales de gran volumen plataformas (Figura 2B), con la excepción de los genes del metabolismo de hierro. Estos expresión diferencias son causados ​​probablemente por los cambios en el contenido de metal de los dos dispositivos o mejoras en la calidad de los ingredientes de los medios. Nuestros datos sugieren que ministats será útil para experimentos de fisiología o competición donde se requiere un ambiente consistente. Para probar si el diseño Ministat es suficiente para aplicaciones evolución experimental que se desarrollaron culturas con limitación sulfato para 250 generaciones y CGH utilizado para caracterizar la amplificación del locus SUL1 -. Un sello de evolución a largo plazo en estas condiciones en quimiostatos mayor volumen 10 Observamos amplificación de SUL1 en clones de 4/4 experimentos de evolución independientes en sulfato limitados medios de comunicación (Figura 2C). Tomados en su conjunto estos datos sugieren que ministats son una plataforma robusta que puede ser útil para una variedad de aplicaciones chemostat tradicionales. A pesar de que ha demostrado su uso en el cultivo de levadura en ciernes, los ministats deberíatambién ser compatible con otros organismos y diseños similares, de hecho, han sido utilizados para el cultivo de bacterias y otras especies de levadura. 16,17,25 Además, el volumen menor cultura y la necesidad de una correlación disminuyó para los medios de comunicación pueden hacer ministats una alternativa atractiva para experimentos que requieren costosos o exóticos reactivos como puede ser el caso en química o cribados genéticos.

La dinámica del crecimiento microbiano y la evolución son fundamentales para la microbiología, la ecología, la genética y la biotecnología. El método más común de los microbios de cultivo es en lotes, donde las células se inoculan a baja densidad en caldo rico en nutrientes y se cultivaron hasta saturación. Aunque fácil de realizar utilizando un equipo estándar de laboratorio, cultivos discontinuos experimentar un ambiente químico fluctuante y en consecuencia cambiar la fisiología celular. Este entorno de crecimiento heterogéneo puede resultar en efectos secundarios de crecimiento y estrés que pueden enmascarar sutiles diferencias fisiológicas. Evolución experimental mediante transferencia por lotes de serie puede seleccionar para mezclas complejas de subpoblaciones fase de crecimiento específicos, lo que complica los intentos de conexión adaptaciones específicas para condiciones selectivas. Medición de caracteres cuantitativos puede ser difícil debido al ruido de sincronización de la muestra imprecisa y la variación en las características tales como tiempo de retraso. Cultivos continuos proporcionan una alternativarégimen de crecimiento donde las células puede ser reproducible cultivada en un medio químicamente homogénea a una tasa de crecimiento definido para alcanzar un estado de equilibrio fisiológico. Debido a estas ventajas, los estudios de evolución experimental y caracterización del estado celular utilizan a menudo el ambiente controlado de cultivos continuos como el quimiostato. 14 Valoración de estas ventajas ha llevado a un resurgimiento del interés en chemostat culturas. 15 Desde su introducción en 1950, 1,2 chemostat sistemas han sido desarrollados para funcionar en una variedad de escalas que van desde litros a microlitros y para una variedad de aplicaciones. 16 -19 Estos diseños diferentes, que van desde biorreactores producidos comercialmente a los buques glassblown a las plataformas de microfluidos personalizados, comparte los principios generales de diseño. Una cámara de cultivo se agita y se airea (generalmente por burbujeo de aire a través de él) y los microbios contenidos en el mismo se mantiene homogéneaLy dispersado por toda la cámara de cultivo en todo momento. Medio fresco de la composición definida se añade continuamente y la velocidad de adición controla la tasa de crecimiento y la influencia del entorno químico experimentado por el cultivo. Un desbordamiento establece el volumen de cultivo en el tubo de crecimiento, y a través de este desbordamiento de la cultura se muestrea a la misma velocidad a la que entra en medio fresco. De esta manera las culturas alcanzan rápidamente un estado fisiológico estable en el que muchos parámetros biológicos se mantienen constantes. A pesar de las ventajas de quimiostatos e informes de estas plataformas diferentes en la literatura, la adopción generalizada se ha visto limitado por dificultades en la construcción y operación de estos sistemas, y los altos costos asociados con las opciones comerciales. Además las descripciones de cómo realizar y utilizar estos dispositivos pueden ser opacas. Se presentan diseños e instrucciones de uso de una matriz de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidos a partir de piezas fácilmente disponibles a bajo costo. Nos obsErve parámetros experimentales altamente consistentes y reproducibles resultados al comparar nuestro dispositivo con los datos reportados por levaduras cultivadas en biorreactores de mayor volumen comercial. Esto incluye la reproducibilidad de la fisiología celular como se ve a través de alcanzar el estado estacionario de equilibrio dentro de 10-15 generaciones y la obtención de densidades similares de cultivo en el equilibrio. Además, los patrones de expresión génica son consistentes entre ministats y una plataforma comercial de mayor volumen. Estabilidad de la tasa de dilución, la densidad óptica y la reproducibilidad de la expresión génica entre tres cultivos replicados demostrar la robustez de nuestra plataforma. También muestran que las mutaciones de adaptación surgen las mismas sobre escalas de tiempo similares evolución experimental como con quimiostatos de mayor volumen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; tubo de silicona </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Tubería: Orden: (50 &#39;pack de bobina) </td></tr><tr><td> 1/2 &quot;x 5/8&quot; tubo de silicona (extra grande) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Tubería: Orden: (50 &#39;pack de bobina) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; tubo de silicona (medio) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Tubería: Orden: (50 &#39;pack de bobina) </td></tr><tr><td> Orange verde Marprene tubería de la bomba </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Tobogán: Order: 6x (paquete de 6) </td></tr><tr><td> Luer hembra, 1/8 &quot;púa </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Conectores: Orden: 4x (paquete de 25) </td></tr><tr><td> Hombre de bloqueo luer, 1/8 &quot;púa </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Conectores: Orden: 1x (paquete de 25) </td></tr><tr><td> La reducción de conector, PVDF, 1/4 &quot;a 1/8&quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30.703-50 </td><td> Conectores: Orden: 1x (paquete de 10) </td></tr><tr><td> Barbed conector en Y, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Conectores: Orden: 3x (paquete de 10) </td></tr><tr><td> Abrazaderas de tubos Medio </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Abrazaderas: Orden: 1x (paquete de 12) </td></tr><tr><td> Día abrazadera (clamp metálico para tubos) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Abrazaderas: Orden: 1x (paquete de 10) </td></tr><tr><td> En línea con válvula macho de conexión rápida, se ajusta a tubería: 1/4 pulg </td><td> Pescador </td><td> 05-112-39 </td><td> Conectores: Orden: 1x (paquete de 25) </td></tr><tr><td> Mujer en línea con válvulas de conexión rápida, se ajusta a tubería: 1/4 pulg ID, Polipropileno </td><td> Pescador </td><td> 05-112-37 </td><td> Conectores: Orden: 1x (paquete de 5) </td></tr><tr><td> Bombas Silent Air </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Acuario Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Air Supply: Orden: 4 bombas </td></tr><tr><td> PTFE filtros, 0,45 m, para la filtración de aire </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Air Supply: Pedido: 1 x (caja de 100) </td></tr><tr><td> Frasco de 1L con arma </td><td> Pescador </td><td> 10-181F </td><td> Air Supply: Orden: 2x (paquete de 6) </td></tr><tr><td> # 8 tapón de silicona, 3/8 en el agujero, para matraces sidearm </td><td> Pescador </td><td> K953715-0801 </td><td> Air Supply: Orden: 8 tapones </td></tr><tr><td> 4-Port colector </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Air Supply: Orden: 8 colectores </td></tr><tr><td> 55 ml tubos con tapa de rosca de cultivo </td><td> Corning Ciencias de la Vida </td><td> 9825-25 </td><td> Sala de Cultura: Orden: 2x (paquete de 48) </td></tr><tr><td> Hipodérmica Regular blanco cubo de la aguja, 16G, 5 pulgadas de longitud para la línea de efluentes </td&gt; <td> Pescador </td><td> 14-817-105 </td><td> Sala de Cultura: Pedido: 1 x (paquete de 100) </td></tr><tr><td> Aguja de punción espinal </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Sala de Cultura: Orden: 4x (paquete de 10) </td></tr><tr><td> Aguja hipodérmica rosa Regular </td><td> Pescador </td><td> 14-817-104 </td><td> Sala de Cultura: Pedido: 1 x (paquete de 100) </td></tr><tr><td> Espuma de silicona tapón de tamaño &quot;2&quot;, de color rosa </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Sala de Cultura: Orden: 2x (paquete de 20) </td></tr><tr><td> 8-Bueno Gradilla </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Sala de Cultura: Orden: 4 bastidores </td></tr><tr><td> Botella Reservoir 10L con manguera de desagüe inferior: seguro vacío </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Medios: Solicitar: 2 o más </td></tr><tr><td> Espuma amarilla tapón de silicona, no estándar tamaño 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Medios: Solicitar: 2 o más </td></tr><tr><td> Bombona filtro de ventilación </td><td> Pescador </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Medios: Solicitar: 1x (paquete de 10) </td></tr><tr><td> Cinta aislante, verde </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td> Medios: Solicitar un rollo. </td></tr><tr><td> Botella superior del filtro, 1L, 0,2 m, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Medios: Solicitar: (1 caso de 12) </td></tr><tr><td> 5000 ml botella depósito con salida inferior: Vacuum seguro </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Medios: (Opcional) </td></tr><tr><td> Tapón azul de silicona Espuma, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Medios: (Opcional) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 cartucho de la bomba </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Bomba de medio: Orden: 1 </td></tr><tr><td> 16-canal Extensión 205CA cabezal de la bomba </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Bomba de medio: Orden: 2 cabezales de bomba de extensión </td></tr><tr><td> Silicona acuario sellador </td><td> Pescador </td><td> S18180B </td><td> Bomba de medio: Orden: 1 </td></tr><tr><td> 6 cuadras baño seco </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Orden: 2 para 32 ministats o 1 para 16. </td></tr><tr><td> Bloque para drybath, 6 x 25 mm tubo de ensayo por bloque </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Orden: 12 por 32 ministats o 6 para 16. </td></tr><tr><td> Los filtros de membrana de nylon de 0,45 micras de tamaño de poro; Diámetro: 25 mm. </td><td> Pescador </td><td> R04SP02500 </td><td> Cosecha: Pedido: 1 x (paquete de 100) (opcional) </td></tr><tr><td> Filtros de membrana de nylon, tamaño de poro 0,45 micras; 45 mm </td><td> Pescador </td><td> R04SP04700 </td><td> Cosecha: Pedido: 1 x (paquete de 100) (opcional) </td></tr><tr><td> 47 aparato mm, filtro grande </td><td> Pescador </td><td> XX10 047 30 </td><td> Cosecha: Pedido: 1 (opcional) </td></tr><tr><td> Glass soporte del filtro, 25 mm, aparato de filtro pequeña </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Cosecha: Pedido: 1 (opcional) </td></tr><tr><td> Frasco Dewar, 1L para nitrógeno líquido </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Cosecha: Pedido: 1 (opcional) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Quimiostatos son sistemas de cultivo continuo en el que las células se cultivan en un muy controlado, ambiente químicamente constante donde está limitada la densidad de cultivo mediante la limitación de nutrientes específicos. 1,2 Datos de quimiostatos son altamente reproducibles para la medición de caracteres cuantitativos, ya que proporcionan una tasa de crecimiento constante y el medio ambiente en estado estacionario. Por estas razones, quimiostatos se han convertido en herramientas útiles para la caracterización a escala fina de la fisiología a través del análisis de la expresión génica 3-6 y otras características de los cultivos en equilibrio de estado estacionario. 7 experimentos a largo plazo en quimiostatos puede resaltar trayectorias específicas que las poblaciones microbianas adopten durante la evolución adaptativa en un entorno controlado. De hecho, quimiostatos se han utilizado para la evolución experimental desde su invención. 8 Un resultado común en experimentos de evolución está para cada réplica biológica para adquirir un repertorio único de mutaciones9-13. Esta diversidad indica que aún queda mucho por descubrir mediante la realización de experimentos de evolución con un rendimiento mucho mayor. Se presenta aquí el diseño y operación de una relativamente simple, de bajo costo de matriz quimiostatos-o miniatura ministats-y validar su uso en la determinación de la fisiología y en experimentos de evolución con levadura. Este enfoque implica el crecimiento de decenas de quimiostatos funcionan con una sola multiplexado bomba peristáltica. Los cultivos se mantienen en un volumen de 20 ml de trabajo, que es práctico para una variedad de aplicaciones. Tenemos la esperanza de que el aumento de rendimiento, disminución de gastos, y la disponibilidad para la construcción detallada e instrucciones de operación también pueden motivar la investigación y la aplicación industrial de este diseño como una plataforma general para caracterizar funcionalmente gran número de cepas, las especies y los parámetros de crecimiento, así como la genética o bibliotecas de medicamentos.

La matriz Ministat descrito anteriormente y en la (Figura 1A, B) fue usado para cultivar una cepa de laboratorio MATa haploide de levadura de gemación (S288c) bajo condiciones limitantes de sulfato como se describe anteriormente. 10 Hemos probado la eficacia para aplicaciones chemostat comunes incluyendo la determinación de la fisiología y evolución experimental. Para validar los ministats, se repitió varios experimentos realizados anteriormente en fermentadores industriales modificados para uso quimiostato. 10,20,21 Sixfors ATR fermentadores se llevaron a cabo en un volumen de 300 ml de trabajo, más de diez veces el volumen de los ministats, y tienen modos considerablemente diferentes cultura de la aireación y agitación. Hemos intentado replicar estabilidad equipo, fisiología estado estacionario, los resultados experimentales evolución, y patrones de expresión génica obtenidos con estos fermentadores. Dado que la uniformidad de la tasa de dilución y la aireación son aspectos importantes del diseño de quimiostato, que measured la tasa de dilución real a través de 32 ministats después de 15 generaciones de crecimiento y se ha encontrado que con una tasa de dilución objetivo de 0,17 vol / hr (4-5 gotas / min) se alcanzó una tasa de dilución promedio de 0,17208 con una desviación estándar de 0,0075 a través de 32 se replica. Esta gama estaba dentro de nuestro tolerancia típica de + / -0,01 vol / hr diferencia de la fijación de objetivos, más allá de que cambios a gran escala en la expresión génica se han observado. 22-23 Across 4 ministats la tasa de flujo de aire se determinó que era 307,5 ​​ml / min con una desviación estándar de 9,57 ml / min. Esto sugiere que el flujo de aire dentro de las cámaras es robusto y divide por igual entre las 4 cámaras y es un valor similar a la descrita para la aireación en fermentadores industriales. 20 Hemos observado anteriormente amplificación recurrente de la SUL1 transportador de alta afinidad de iones de azufre en 8.8 experimentos de evolución sulfato limitados en la levadura. 10 Teniendo en cuenta la coherencia de los resultados de acuerdo con thicondición s elegimos sulfato de limitación para poner a prueba la capacidad de nuestro sistema. Un elemento necesario de la cultura chemostat es la necesidad de mantener un ambiente químico constante. Las fluctuaciones en la abundancia de una limitación de nutrientes o cambios de otro tipo en el medio ambiente suelen dar lugar a un cambio en el número de células en un cultivo dado. Se midió la densidad óptica tal como un proxy para el número de células (Figura 2A) y la reproducibilidad medido a través de 16 cultivos replicados, encontrar un promedio A600 de 1,12 (~ 10 9 células) después de ~ 15 generaciones de crecimiento con una desviación estándar de 0,057 unidades, o 5,1 %. Para la comparación, las medidas tomadas de 4 cultivos replicados cultivadas en los fermentadores industriales mostraron una desviación estándar de 2,5%. Las células fueron bien mezclados en la cámara de crecimiento: mediciones de OD y recuento de células tomadas de la pista efluente eran equivalentes a las muestras tomadas directamente desde el tubo de cultivo (datos no mostrados). Estos resultados demuestran la solidez de nuestra plataforma de und capacidad para mantener un ambiente químico constante con una tolerancia similar a la del fermentador industrial. En una lectura más sensible de la fisiología, se comparó el genoma expresión estable del gen estado de los cultivos que crecen bajo limitación sulfato en las ministats y en el fermentador industrial. La expresión génica en las ministats mostraron un alto grado de similitud a través de tres réplicas biológicas (Figura 2B). Hemos observado anteriormente que para el ARN derivado de dos quimiostatos Sixfors repetidos y de co-hibridizada a un microarray, la expresión de genes de 99% cayó dentro de un rango de 1,5-veces, lo que permite el uso de 1,5 X como un corte de significación empírica. 21 la expresión génica desde ministats tres replicados, por parejas, en comparación mostró 99% de los genes cayó dentro de un rango de 1.5-1.7 veces, comparable a los resultados de los fermentadores industriales. Las tres muestras se hibridó con los conjuntos individuales y las relaciones de pares calculados después, por lo que estos VAlues incluyen inter-array ruido además de ruido biológico, potencialmente sobreestimar la variación entre las réplicas en comparación con los publicados, co-hibridados resultados. 138 genes fueron expresados ​​diferencialmente&gt; 1,5-veces en todos los Ministat tres repeticiones en comparación con una muestra obtenida de un cultivo crecido emparejado en el fermentador industrial. Genes disminución en la expresión en las ministats se enriquecieron en gran medida por el metabolismo del hierro. Esta firma puede reflejar la composición del metal diferente de cada configuración de dispositivos: el aparato Sixfors incluye un impulsor de metal y ensamble aireación inmerso en la cultura, los medios de comunicación y la garrafones utilizado anteriormente también se requiere hardware metal. El Ministat utiliza agujas de acero inoxidable, pero ningún componente metálico. Los genes con una mayor expresión se asocia en gran medida con las membranas celulares, aunque la importancia biológica de esta asociación no está claro. Por último, hemos probado unde evolución experimentalr estas condiciones. Después de 250 generaciones de sulfato limitado crecimiento, 4/4 clones ensayados de 4 poblaciones independientes evolución mostraron amplificación de SUL1 como se detecta por hibridación genómica comparada (CGH, Figura 2C). Este resultado es consistente con los hallazgos en quimiostatos de mayor volumen en intervalos de tiempo similares. 10 <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> 1. A. Diseño y disposición de la matriz Ministat. Figura B. Diseño de la cámara de cultivo. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figura 2. A. ExperimeNTAL datos que muestran que los cultivos alcancen el equilibrio dentro de diez generaciones de crecimiento (n = 16). B. Datos de expresión para tres repeticiones biológica S1-3 muestreadas durante el estado estacionario bajo limitación de sulfato en comparación con una referencia común crecido en un conjunto combinado de sulfato limitado chemostat Sixfors C. amplificaciones. SUL1 recuperado en ministats después de 250 generaciones de crecimiento en un entorno de sulfato limitado. El ADN genómico de cada clon evolucionado se comparó con el ADN ancestral por CGH como se describe. 21 La media de número de copia se calculó para cada región amplificada y se muestra junto a cada uno de amplificación. Todos los datos de microarrays se depositan en la base de datos GEO bajo adhesión GSE36691. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la figura.</a>

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Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Hemos desarrollado y validado una serie de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidas con piezas fácilmente disponibles por un costo bajo. Resultados de la evolución fisiológica y experimental fueron similares a quimiostatos de mayor volumen. La matriz Ministat proporciona una plataforma compacta, barata, y accesible para los experimentos chemostat tradicionales, genómica funcional, y aplicaciones químicas de detección.

Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.1K vistas.  University of Washington. Hemos desarrollado y validado una serie de pequeñas dimensiones, de quimiostatos miniatura construidas con piezas fácilmente disponibles por un costo bajo. Resultados de la evolución fisiológica y experimental fueron similares a quimiostatos de mayor volumen. La matriz Ministat proporciona una plataforma compacta, barata, y accesible para los experimentos chemostat tradicionales, genómica funcional, y aplicaciones químicas de detección.

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays. Robust flow control and precise fluidic volumes are two critical requirements for these applications. We have developed microfluidic chips featuring elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS) microvalve arrays that: 1) need no extra energy source to close the fluidic path, hence the loaded device is highly portable; and 2) allow for microfabricating deep (up to 1 mm) channels with vertical sidewalls and resulting in very precise features.

The PDMS microvalves-based devices consist of three layers: a fluidic layer containing fluidic paths and microchambers of various sizes, a control layer containing the microchannels necessary to actuate the fluidic path with microvalves, and a middle thin PDMS membrane that is bound to the control layer. Fluidic layer and control layers are made by replica molding of PDMS from SU-8 photoresist masters, and the thin PDMS membrane is made by spinning PDMS at specified heights. The control layer is bonded to the thin PDMS membrane after oxygen activation of both, and then assembled with the fluidic layer. The microvalves are closed at rest and can be opened by applying negative pressure (e.g., house vacuum). Microvalve closure and opening are automated via solenoid valves controlled by computer software.

Here, we demonstrate two microvalve-based microfluidic chips for two different applications. The first chip allows for storing and mixing precise sub-nanoliter volumes of aqueous solutions at various mixing ratios. The second chip allows for computer-controlled perfusion of microfluidic cell cultures.

The devices are easy to fabricate and simple to control. Due to the biocompatibility of PDMS, these microchips could have broad applications in miniaturized diagnostic assays as well as basic cell biology studies.

We demonstrate protocols for manufacturing and automating elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS)-based microvalve arrays that need no extra energy to close and feature photolithographically defined precise volumes. A parallel subnanoliter-volume mixer and an integrated microfluidic perfusion system are presented.

Los chips de microfluidos controlado con matrices elastoméricas microválvula

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Investigación

Biología

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfiles de Pre-micro ARN y microRNAs utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Asamblea de Nucleosomal Arrays de recombinantes Core histonas y el ADN posicionamiento de nucleosomas

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Diseño y Análisis Del Comportamiento De Preferencia De Temperatura Y Su Ritmo Circadiano En Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...