Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage forment la New York University. Nous remercions Maitreya Dunham et Matt Brauer qui a initialement développé l&#39;utilisation de bioréacteurs Sixfors comme chémostats.

Le principe de la culture en continu en utilisant un chemostat peut être réalisée dans une variété de mises en œuvre. Dans tous les chémostats il est essentiel d&#39;avoir une) méthodes pour maintenir la stérilité de tous les composants, 2) une culture bien mélangé, 3) l&#39;aération appropriée du récipient de culture et 4) un moyen fiable de plus de médias et l&#39;élimination de la culture. Ici, nous décrivons l&#39;utilisation d&#39;un bioréacteur Sixfors (Infors Inc) en chemostat en utilisant des procédés qui peuvent être facilement adaptés à d&#39;autres configurations. Une. Assemblage des navires Chemostat <ol><li> Allumez les Sixfors l&#39;aide de l&#39;interrupteur principal. </li><li> Bien rincer le récipient chimiostatique, Ensemble agitateur, et le tube attaché avec (DI) de l&#39;eau déminéralisée. Vérifiez tous les tuyaux et les joints toriques et remplacer les pièces usées à la recherche. </li><li> Assurez-vous que la base de support d&#39;arbre d&#39;entraînement est tourné vers le haut dans le récipient en verre et que la partie supérieure de l&#39;arbre d&#39;entraînement est remis dans son logement sur l&#39;ensemble de l&#39;agitateur. Réglez le stirrer ensemble dans le récipient de verre assurant le bas de l&#39;arbre d&#39;entraînement est logé dans le support d&#39;arbre d&#39;entraînement. Utiliser la pince pour fixer l&#39;ensemble de l&#39;agitateur dans la cuve de verre. </li><li> Remplissez le réservoir avec environ 300 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Retirez les bouchons d&#39;un oxygène dissous (DO 2) sonde et vérifier le niveau d&#39;électrolyte en dévissant le boîtier en bas et en veillant à ce que le boîtier de fond est à moitié rempli avec une solution d&#39;électrolyte. Replacer le boîtier en bas et l&#39;insérer dans le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer. </li><li> Prenez une sonde de pH et la retirer de son tampon de stockage (3 M de KCl). Retirez le capuchon de la sonde de pH et le joindre à fermenteur 1. Utilisation de l&#39;écran de contrôle Sixfors, accédez au menu des paramètres de fermentation et sélectionnez &quot;calibrer pH&quot;. Placer la sonde de pH dans un tampon à pH 7 standard et fiche de lecture en tant que Haut Lire. Répéter l&#39;opération avec tampon à pH 4 et enregistrer la lecture en bas Lire. Détacher la sonde de pH de fermentation, laver avec de l&#39;eau DI et insérer la sonde into le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer. </li><li> Placer le récipient chimiostatique dans le rack. Remarque sur le navire qui fermenteur (1-6) de la sonde de pH a été connecté et calibré. Placez la sonde de pH bouchon sur la sonde de pH. Utilisant une feuille couvre bien le haut de la sonde à oxygène 2. </li><li> Plier la feuille sur les extrémités de la tubulure attachée au récipient chimiostatique. </li><li> Répétez les étapes 1.2 à 1.8 pour tous les navires. </li><li> Stériliser les navires en leur autoclavage pendant 15 min sur un cycle liquide. </li></ol> 2. Préparation des supports <ol><li> Établir la gamme de limitation des concentrations de nutriments par la croissance des cultures en lots de différentes concentrations d&#39;éléments nutritifs. Le nutriment est limitant dans la plage où la densité cellulaire finale est une fonction linéaire de la concentration des éléments nutritifs initiale (figure 4). Sélectionnez une concentration des éléments nutritifs dans la fourchette de limitation. Des exemples de composition de médias standard pour les études avec Saccharomyces cerevisiae sont disponibles en 11.7. </li><li> Autoclave une bonbonne vide qui est coiffé d&#39;un bouchon de caoutchouc contenant une entrée d&#39;air et une sortie de média après la première assurant que l&#39;extrémité du tube de support est recouvert d&#39;une feuille. </li><li> Dans un récipient séparé préparer 10 litres de médias. </li><li> Fixer un filtre de 500 ml tasse à une bouteille de 100 ml de médias. Retirez le filtre de coton avec des pinces stérilisées dans de l&#39;éthanol et joindre immédiatement au port de filtration sur la bonbonne de médias. </li><li> Fixez la bonbonne de médias à une source de vide et filtre stériliser les médias en l&#39;ajoutant à la coupe du filtre. </li><li> Lorsque la filtration des médias est terminée, fermer le port de filtration avec une pince métallique. </li></ol> 3. Calibrage faire 2 sondes et Configuration Chemostat <ol><li> Après les vaisseaux chémostat ont été autoclave et laisser refroidir endroit du navire dans son enveloppe de chaleur correspondant. Connectez la sonde de température, sonde de pH et DO 2 sonde. Laissez lenavire s&#39;asseoir avec le pouvoir pendant au moins 6 heures pour permettre aux DO 2 sondes à polariser. </li><li> Placez l&#39;extrémité de chaque tube effluents dans un récipient de collecte séparée. Connectez l&#39;alimentation en air via un filtre autoclave et tourner sur la circulation d&#39;air. L&#39;eau dans chaque récipient doit s&#39;écouler des tubes des effluents, ce qui indique que tous les joints sont correctement formés. </li><li> Ajuster la hauteur du tube d&#39;effluent en fonction du volume de travail désirée (par exemple, 300 ml). Nous utilisons une règle qui est marqué avec des stages de tubes calibrés pour différents volumes de travail. </li><li> Connectez la bonbonne de médias dans le récipient de chemostat. Utiliser de l&#39;éthanol afin de maintenir les extrémités des tubes aussi stérile que possible. Enfiler le tuyau de la pompe à travers la pompe et la pince ouverte. Appuyer manuellement sur la pompe jusqu&#39;à ce que les médias commencent à s&#39;écouler dans le récipient chimiostatique. Relâchez tube de la pompe, les médias doivent circuler librement dans le récipient chemostat. Lorsque le support atteint le tube effluent, rattacher tube à la pompe et serrer. </li><li> Lancer running le programme de base avec roue ensemble à 400 tours par minute et la température réglée à 30 ° C. </li><li> Pour calibrer faire 2 sondes, couper l&#39;arrivée d&#39;air et passer au gaz d&#39;azote. Attendez au moins une heure et enregistrer la valeur de mesure comme «faible en lecture&quot;. Revenez à alimentation d&#39;air (c&#39;est à dire contenant la concentration en oxygène ambiante), attendez au moins une heure supplémentaire et la mesure d&#39;enregistrement comme &quot;une grande lecture». </li><li> Lancer l&#39;enregistrement de données en utilisant le logiciel Iris. </li></ol> 4. Inoculation <ol><li> Utiliser 70% d&#39;éthanol pour stériliser la partie supérieure de la cuve de culture. </li><li> Retirez la vis sur le dessus de la cuve et pipette 1 ml d&#39;une culture de la nuit dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis. </li><li> Indiquer le moment de l&#39;inoculation dans Iris. </li><li> Attendez environ 24 h pour les cultures d&#39;atteindre la phase stationnaire précoce. Comme la culture se développe, l&#39;oxygène dissous et le pH diminue. Dans le cas des milieux de glucose limitatif, l&#39;oxygène dissous va revenir à ~ 100% en pha stationnairese. Pour les autres restrictions de nutriments oxygène dissous restera &lt;100% en phase stationnaire. </li></ol> 5. Lancement de pompes et d&#39;atteindre l&#39;état d&#39;équilibre <ol><li> Le taux de dilution est calculé en divisant le débit (la quantité de support s&#39;écoule dans la cuve par heure) par le volume de la culture. Par exemple, en utilisant un volume de 300 ml, un taux de dilution de 0,1 signifie que 30 ml de milieu est ajouté à la culture par heure. Parce que le système est sous pression positive le même volume est retirée de la cuve en sorte que la culture est diluée de manière continue. Une gamme de taux de dilution (D) peut être utilisé qui ne dépasse pas la vitesse maximale de croissance (μ max) des cellules, les cellules ci-dessus, qui seront éliminés par lavage du chemostat. </li><li> Choisissez réglages de la pompe, qui précisent le nombre de secondes, la pompe est sur et en dehors, pour établir le débit souhaité. La pompe délivre médias à un taux d&#39;environ 0,11 ml / sec. </li><li> Définir un programme utilisant l&#39;int Sixforserface qui spécifie le calage de la pompe, la température et la vitesse de la turbine. Démarrez le programme. </li><li> Videz les récipients collecteurs de liquide et enregistrer le temps. </li><li> Après au moins deux heures, utiliser un cylindre gradué pour mesurer combien les médias a été retiré de la cuve. Ce sera égal au volume qui a été ajoutée au récipient de chemostat. Calculer le taux (D = V effluents / V culture / heure) dilution. Réglez les paramètres de la pompe si le taux de dilution calculé ne correspond pas à taux de dilution désiré. </li><li> A l&#39;état d&#39;équilibre, la densité des cellules dans le chemostat ne change pas au fil du temps. Ceci peut être mesuré sans perturber la culture en échantillonnant la sortie. Nous définissons opérationnel atteindre l&#39;état d&#39;équilibre que les mesures de densité de cellules identiques qui sont séparés par au moins un doublement de la population. Atteindre l&#39;état d&#39;équilibre prendra environ huit générations de la culture après le début de la culture dilution. A l&#39;état d&#39;équilibre, les cellules se développent de façon exponentielle (i.e. taux de croissance constant au cours du temps) dans des conditions nutritives limitée. Le temps de doublement de la population (temps de génération) est ln (2) / D. </li><li> Continuer à mesurer périodiquement le volume des effluents pour la durée de l&#39;expérience pour s&#39;assurer que le taux de dilution constant est maintenu. </li></ol> 6. Application 1: étude des cellules en croissance à des taux différents dans l&#39;état d&#39;équilibre <ol><li> A l&#39;état d&#39;équilibre dans le chemostat, le taux de la population de cellules de croissance est égal au taux de dilution. En modifiant systématiquement le taux de dilution, il est possible de cultiver des cellules à des vitesses différentes. Ceci permet l&#39;étude systématique des paramètres physiologiques qui varient avec le taux de croissance y compris le volume des cellules, l&#39;étape du cycle cellulaire et de la résistance au stress. En outre, les profils état d&#39;équilibre de l&#39;ARNm mondiale, les protéines et les niveaux de métabolites peuvent être testés dans des cellules en croissance à des taux différents. Il ya deux façons d&#39;acquérir des échantillons: </li><li> Petits échantillons peuvent être passivement obmaintenue en plaçant l&#39;extrémité du tube d&#39;effluent dans un tube de 1,5 ml ou de 15 ml. Un échantillon de 5.1 ml peuvent être obtenus en quelques minutes (en fonction de la vitesse d&#39;écoulement). De nombreux paramètres physiologiques peuvent être mesurées à partir de ces échantillons. </li><li> expression des gènes, ou de métabolites analyses nécessitent des échantillons plus larges qui doivent être obtenus le plus rapidement possible. Placer l&#39;extrémité du tube d&#39;effluent dans un tube conique de 15 ml. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement. A ~ 10 ml d&#39;échantillon remplira rapidement votre tube. Garder à l&#39;esprit que le volume dans le récipient chimiostatique a changé. Si plusieurs échantillons consécutifs sont prises, il peut être nécessaire de réduire le débit pour maintenir un taux de dilution constant. </li></ol> 7. Application 2: la mesure précise des différences de taux de croissance entre les génotypes dans des environnements contrôlés en utilisant des analyses de la concurrence fondée sur cytométrie de flux <ol><li> Chémostats peuvent être utilisés pour quantifier avec précision l&#39;effet de la concentration en éléments nutritifssur les différences de taux de croissance (c&#39;est à dire de remise en forme) entre différents fonds génétiques. Par des souches de co-culture marquées avec différentes protéines fluorescentes de la vitesse de variation de l&#39;abondance relative pendant la croissance exponentielle est déterminée. Réalisation de ce test à différents taux de dilution (D) permet l&#39;étude des effets de la concentration (s) nutriment sur ​​les différences de remise en forme. </li><li> Établir les cultures des deux souches dans les vaisseaux chémostat séparées avec des taux de dilution identiques et un volume de 300 ml état d&#39;équilibre. </li><li> Passivement échantillon de 1 ml de chaque navire. Spin bas cellules, remettre en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS) et le lieu à 4 ° C. Ces échantillons contiennent des échantillons de cellules homogènes, qui sont des commandes pour l&#39;analyse de cytométrie de flux subséquente. </li><li> Placer le tube effluent d&#39;un navire dans une éprouvette graduée autoclave. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement vers le bas pour expulser les cellules du chemostat. Quandle volume atteint 150 ml, retourner l&#39;extrémité métallique du tube effluent à sa position initiale (300 ml). Répéter l&#39;opération avec le second navire, en utilisant une éprouvette graduée différente. </li><li> Utilisation éthanol à 70% pour maintenir la stérilité tout en enlevant les vis sur la partie supérieure du récipient chimiostatique. Placez l&#39;entonnoir dans l&#39;ouverture et versez 150 ml de l&#39;autre culture dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis. Répéter l&#39;opération avec le second navire, en utilisant le second entonnoir. Chaque récipient chimiostatique contient maintenant un mélange des deux souches. </li><li> Obtenir un échantillon de 1 ml de chaque navire par échantillonnage passif chaque 2-6 h. Isoler les cellules, remettre en suspension dans du PBS et conserver à 4 ° C. Continuez à prendre des échantillons pour l&#39;enregistrement 2-3 jours soigneusement le temps de chaque échantillon a été prélevé. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, traitement par ultrasons et diluer les échantillons à ~ 2 x 10 6 cellules / ml. En utilisant la cytométrie en flux, de mesurer la proportion des deux souches dans chaque échantillon. Comme les deux souches sont en croissance exponentielle, la différence de taux de croissance relative estdéterminé par régression linéaire de ln (strain1/strain2) en fonction du temps (mesuré dans les générations). La pente de la régression est proportionnelle à la différence dans le taux de croissance (c&#39;est à dire l&#39;avantage de gym) d&#39;une souche par rapport à l&#39;autre. </li><li> Comme la culture mixte peut prendre un certain temps pour atteindre un nouvel état d&#39;équilibre, des points de temps au début peuvent s&#39;adapter mal à la régression. Ce problème est résolu meilleur en permettant 2-3 générations s&#39;écouler avant le début de l&#39;échantillonnage ou de retirer début points qui sont aberrantes claires. Inversement, une fois une souche a surpassés l&#39;autre, les données ne sont plus utiles et ces points doivent être exclus. </li></ol> 8. Application 3: Evolution expérimentale <ol><li> Évolution expérimentale effectuée dans chémostats sélectionne des mutants qui augmentent dans la forme physique dans l&#39;environnement des éléments nutritifs limités. La sélection est généralement effectuée sur des centaines de générations. </li><li> Établir une culture chimiostatique l&#39;état d&#39;équilibre en utilisant une souchegénotype connu (et la séquence du génome de préférence connu) et un nutriment limitation définie. </li><li> Pour maintenir un «fossiles» de la population d&#39;adaptation passive échantillon chemostat tous les 2-3 jours et stocker l&#39;échantillon dans 15% de glycérol à -80 ° C. </li><li> Surveiller le réservoir de médias et de reconstituer des milieux frais comme nécessaires. </li><li> Maintenir la culture en croissance exponentielle pour plusieurs centaines de générations. </li><li> Après l&#39;achèvement de la plaque de sélection d&#39;un échantillon de cellules sur des plaques de gélose solide. Après que les cellules ont grandi dans les colonies, choisir un échantillon biaisé de colonies à l&#39;aide de cure-dents et inoculer clones dans les puits individuels d&#39;une plaque de 96 puits contenant 100 pi de milieu. Permettre aux échantillons de clones de croître pendant la nuit, ajouter 100 ul de 30% de glycérol et en magasin -80 ° C. </li><li> Caractériser clones par séquençage du génome entier et effectuer des dosages phénotypiques y compris l&#39;évaluation de la condition physique, en utilisant une souche de référence marqué par fluorescence commun, tel que décrit dans la demande 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+hopf+bifurcation+in+a+live+predator-prey+system.">Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system.</a> Science. 290, 1358-1360 (2000).</li><li>Cohen, E. P., Eagle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+chemostat+for+the+growth+of+mammalian+cells:+characteristics+of+cell+growth+in+continuous+culture.">A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture.</a> J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Chémostats permettent la culture de microbes dans des conditions stables de croissance contrôlée. Les cellules se développent en continu à un débit constant résulte en un environnement externe invariant. Ceci est en contraste aux méthodes de culture du lot dans lequel l&#39;environnement extérieur est en constante évolution et le taux de croissance des cellules est déterminé par l&#39;interaction complexe de l&#39;environnement et le génotype. Ainsi, un avantage majeur de la mise en culture des microbes dan...

La croissance des cellules est régulée par des réseaux complexes d&#39;interaction des facteurs génétiques et environnementaux 1,2. Le règlement multifactorielle de la croissance cellulaire nécessite une approche au niveau du système à son étude. Cependant, l&#39;étude rigoureuse de la croissance cellulaire régulée est contestée par la difficulté de contrôler expérimentalement la vitesse à laquelle les cellules se développent. En outre, même dans les expériences les plus simples conditions extracellulaires sont souvent dynamique et complexe que les cellules modifient en permanence leur environnement comme ils prolifèrent. Une solution à ces problèmes est proposée par le chemostat: un procédé de culture de cellules qui permet un contrôle expérimental des taux de croissance de cellules dans des milieux définis, invariantes et contrôlées. La méthode de culture en continu en utilisant un chemostat a été décrite de façon indépendante par Monod 3 et Novick et Szilard 4 en 1950. Conçu à l&#39;origine, les cellules sont cultivées dans un volume fixe de médias qui est concontinuellement dilué par ajout de nouveaux médias et l&#39;élimination simultanée des médias traditionnels et des cellules (Figure 1). Équations différentielles ordinaires couplées (figure 2) décrivent la vitesse de variation de la densité de cellules (x) et la concentration d&#39;un nutriment (s) limitant la croissance dans le récipient chimiostatique. Surtout, ce système d&#39;équations prédit un seul (non nul) stable à l&#39;état d&#39;équilibre (figure 3) avec l&#39;implication remarquable à l&#39;état d&#39;équilibre, le taux de croissance spécifique des cellules (c&#39;est à dire la constante de taux de croissance exponentiel) est égal au taux au cours de laquelle la culture est diluée (D). En faisant varier le taux de dilution, il est possible d&#39;établir des populations à l&#39;état stable de cellules à différents taux de croissance et dans différentes conditions de limitation en nutriments. Le contrôle expérimental des taux de croissance à l&#39;aide chémostats était essentielle pour le développement d&#39;une compréhension de la façon dont les changements de la physiologie cellulaireavec des taux de croissance de 5,6. Cependant, cet ancien pilier de méthodes microbiologiques est devenu de plus en plus obscure lors de l&#39;explosion dans la recherche en biologie moléculaire au cours de la fin du XXe siècle. Aujourd&#39;hui, un regain d&#39;intérêt dans le contrôle de la croissance dans les deux microbes et les organismes multicellulaires et l&#39;avènement de méthodes échelle du génome pour l&#39;analyse au niveau des systèmes a renouvelé motivation pour l&#39;utilisation de chémostats. Ici, nous décrivons trois applications qui tirent sur le contrôle précis des taux de croissance de cellules et l&#39;environnement extérieur qui sont uniquement possible en utilisant chémostats. Tout d&#39;abord, nous décrivons l&#39;utilisation de chémostats d&#39;étudier comment l&#39;abondance de milliers de biomolécules - tels que les transcriptions et des métabolites - sont réglementés de manière coordonnée avec les taux de croissance. Deuxièmement, nous décrivons comment chémostats peuvent être utilisées pour obtenir des estimations précises des écarts de taux de croissance entre les différents génotypes dans des environnements peu fertiles en utilisant des expériences de compétition. Troisièmement, nous décrivons comment peut chémostatsêtre utilisé pour étudier l&#39;évolution adaptative des cellules en croissance dans des environnements pauvres en éléments nutritifs constants. Ces exemples illustrent la façon dont les chémostats activez enquêtes au niveau des systèmes de régulation de la croissance cellulaire, génique par des interactions de l&#39;environnement et l&#39;évolution adaptative.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td>
			<td>Appropriate Technical Resources, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottle 9.5 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-887-1</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinchcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-867</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopper, Size 12, Green Neoprene</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-62991-42</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Connector</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-30703-02</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General purpose ties 4 in</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9557052</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone Rubber</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>B000FMWTDE</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 3/8 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Silicone, 7/32 in OD</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-587-1E</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K164</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>6100K161</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook Connectors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-66-18Q</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ratchet Clamp</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-06403-11</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Female</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45512-34</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer, Male</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-45513-04</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MTGR05010</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 &mu;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9131037</td>
			<td>For Media Vessel and Hosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Air</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32047-77</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-Reading Flowtube for Nitrogen</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-32048-63</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Proportioner Multitube Frames</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-50</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator, Two-Stage Analytical</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y12-N145D580</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Adaptor, Stainless Steel</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Y99-26450</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose Male Adaptor</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>WES544</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norprene Tubing</td>
			<td>US Plastics</td>
			<td>57280</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripod Base</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03218-58</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Cartridges</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-03217-92</td>
			<td>For Nitrogen Gas Setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboy 10 L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-963-2A</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP-T10-RE</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB-800-100</td>
			<td>For Media Preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride&middot;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424205000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423400010</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate&middot;5H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209198</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60400</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ferric chloride&middot;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>I88-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese sulfate&middot;H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium molybdate&middot;2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc sulfate&middot;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium pantothenate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC24330-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>folic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7876</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inositol (aka myo-inositol)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC12226-1000</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>niacin (aka nicotinic acid)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N4126</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-aminobenzoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC14621-2500</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyridoxine HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9755</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>riboflavin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R4500-25G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP892-100</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L8000-100G</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0155-08-5</td>
			<td>Media Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of chemostats in microbial systems biology

Les cellules régulent leur taux de croissance en réponse à des signaux provenant du monde extérieur. Comme la cellule se développe, divers processus cellulaires doivent être coordonnés y compris la synthèse macromoléculaire, le métabolisme et, finalement, de l&#39;engagement avec le cycle de la division cellulaire. Le chemostat, une méthode de contrôle expérimentalement le taux de croissance de la cellule, fournit un puissant moyen d&#39;étudier systématiquement la façon dont les impacts des taux de croissance les processus cellulaires - y compris l&#39;expression des gènes et le métabolisme - et les réseaux de régulation qui contrôlent le taux de croissance des cellules. Lorsque maintenue pendant des centaines de générations chémostats peut être utilisé pour étudier l&#39;évolution adaptative des microbes dans des conditions environnementales qui limitent la croissance des cellules. Nous décrivons le principe des cultures chémostat, démontrer leur fonctionnement et de fournir des exemples de leurs diverses applications. Après une période de désuétude après leur introduction dans le milieu du XXe siècle, la convergence des méthodologies échelle du génome d&#39;un renouvellement enintérêt dans la régulation de la croissance cellulaire et la base moléculaire de l&#39;évolution adaptative est de stimuler une renaissance de l&#39;utilisation des chémostats dans la recherche biologique.

Un avantage majeur de chémostats est la capacité de contrôler le taux de croissance des cellules expérimentalement en faisant varier le taux de dilution. Chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, la morphologie d&#39;une cellule est informative de la phase dans le cycle de la division cellulaire. Populations avec des taux de croissance plus élevés contiennent une proportion plus élevée de division active des cellules tel que déterminé par la mesure de la fraction de cellules unbudded (figu...

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The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l&#39;étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

the-use-of-chemostats-in-microbial-systems-biology

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K vues.  New York University.  taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l'étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules. 

Vidéo: The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

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Enquêter la communauté microbienne dans l&#39;intestin postérieur des termites - Interview

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

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The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life activities. Its high prevalence in general population and the severe limitations it causes, point out the necessity to find new efficient strategies to treat it. Together with the cognitive-behavioral treatments, relaxation represents a useful approach for the treatment of GAD, but it has the limitation that it is hard to be learned. The INTREPID project is aimed to implement a new instrument to treat anxiety-related disorders and to test its clinical efficacy in reducing anxiety-related symptoms. The innovation of this approach is the combination of virtual reality and biofeedback, so that the first one is directly modified by the output of the second one. In this way, the patient is made aware of his or her reactions through the modification of some features of the VR environment in real time. Using mental exercises the patient learns to control these physiological parameters and using the feedback provided by the virtual environment is able to gauge his or her success. The supplemental use of portable devices, such as PDA or smart-phones, allows the patient to perform at home, individually and autonomously, the same exercises experienced in therapist's office. The goal is to anchor the learned protocol in a real life context, so enhancing the patients' ability to deal with their symptoms. The expected result is a better and faster learning of relaxation techniques, and thus an increased effectiveness of the treatment if compared with traditional clinical protocols.

The Project on Virtual Reality Intelligent Multi-sensor System for the Treatment of Anxiety-related Disorders (INTREPID) is aimed at developing a multi-sensor context-aware virtual reality system for the treatment of anxiety-related disorders.

L&#39;utilisation du biofeedback dans la Réalité Virtuelle clinique: Le projet INTREPID

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in the environment, as well as directly for the transmission of pathogens to drinking water supplies. Natural porous media is composed of an intricate physical topology, varied surface chemistries, dynamic gradients of nutrients and electron acceptors, and a patchy distribution of microbes. These features vary substantially over a length scale of microns, making the results of macro-scale investigations of microbial transport difficult to interpret, and the validation of mechanistic models challenging. Here we demonstrate how simple microfluidic devices can be used to visualize microbial interactions with micro-structured habitats, to identify key processes influencing the observed phenomena, and to systematically validate predictive models. Simple, easy-to-use flow cells were constructed out of the transparent, biocompatible and oxygen-permeable material poly(dimethyl siloxane). Standard methods of photolithography were used to make micro-structured masters, and replica molding was used to cast micro-structured flow cells from the masters. The physical design of the flow cell chamber is adaptable to the experimental requirements: microchannels can vary from simple linear connections to complex topologies with feature sizes as small as 2 &mu;m. Our modular EcoChip flow cell array features dozens of identical chambers and flow control by a gravity-driven flow module. We demonstrate that through use of EcoChip devices, physical structures and pressure heads can be held constant or varied systematically while the influence of surface chemistry, fluid properties, or the characteristics of the microbial population is investigated. Through transport experiments using a non-pathogenic, green fluorescent protein-expressing Vibrio bacterial strain, we illustrate the importance of habitat structure, flow conditions, and inoculums size on fundamental transport phenomena, and with real-time particle-scale observations, demonstrate that microfluidics offer a compelling view of a hidden world.

Microfluidic devices can be used to visualize complex natural processes in real time and at the appropriate physical scales. We have developed a simple microfluidic device that mimics key features of natural porous media for studying growth and transport of bacteria in the subsurface.

Fenêtre sur un micromonde: Simple systèmes microfluidiques pour l&#39;étude de Transports microbienne dans les milieux poreux

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Détermination de la contribution des systèmes d&#39;énergie pendant l&#39;exercice

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil determines the rate of decomposition by microbial communities as well as recycle rates of nitrogen (N) and carbon (C) sequestration1,2. Plant litter comprises the majority of detritus3, and so it is assumed that decomposition is only marginally influenced by biomass inputs from animals such as herbivores and carnivores4,5. However, carnivores may influence microbial decomposition of plant litter via a chain of interactions in which predation risk alters the physiology of their herbivore prey that in turn alters soil microbial functioning when the herbivore carcasses are decomposed6. A physiological stress response by herbivores to the risk of predation can change the C:N elemental composition of herbivore biomass7,8,9 because stress from predation risk increases herbivore basal energy demands that in nutrient-limited systems forces herbivores to shift their consumption from N-rich resources to support growth and reproduction to C-rich carbohydrate resources to support heightened metabolism6. Herbivores have limited ability to store excess nutrients, so stressed herbivores excrete N as they increase carbohydrate-C consumption7. Ultimately, prey stressed by predation risk increase their body C:N ratio7,10, making them poorer quality resources for the soil microbial pool likely due to lower availability of labile N for microbial enzyme production6. Thus, decomposition of carcasses of stressed herbivores has a priming effect on the functioning of microbial communities that decreases subsequent ability to of microbes to decompose plant litter6,10,11.
We present the methodology to evaluate linkages between predation risk and litter decomposition by soil microbes. We describe how to: induce stress in herbivores from predation risk; measure those stress responses, and measure the consequences on microbial decomposition. We use insights from a model grassland ecosystem comprising the hunting spider predator (Pisuarina mira), a dominant grasshopper herbivore (Melanoplus femurrubrum),and a variety of grass and forb plants9.

We present methods to evaluate how predation risk can alter the chemical quality of herbivore prey by inducing dietary changes to meet demands of heightened stress, and how the decomposition of carcasses from these stressed herbivores slows subsequent plant litter decomposition by soil microbes.

Lier le risque de prédation, stress physiologique et Herbivore décomposition microbienne de la litière végétale

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Conception et analyse du comportement de préférence de température et de son rythme circadien chez la drosophile

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...