Video Yaratılış Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (5P41RR011823-17) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Sağlık Bilimleri Ulusal Enstitüsü (8 P41 GM103533-17) hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda NSF hibe 1120425 tarafından desteklenmiştir. MJD Bir Rita Allen Vakfı Akademik olduğunu. AWM NIH T32 HG00035 tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz protokolleri geliştirmek için yardım Anna Sunshine ederim. Ayrıca, ministats erken kullanıcıları olarak Sara DiRienzi, Celia Payen ve Amy Sirr kabul.

Protokol boyunca uygun steril tekniği kullanın. 1. Parçaları Montaj ve Ministat Array hazırlanması <ol><li> Tüm parçaları sipariş edin. </li><li> Cam tüpler temizleyin. 20 ml hacimli tüpler işaretleyin. </li><li> Mantar hava ile meclisleri, medya ve atık limanlar olun ve temizlenmiş cam kültürü tüplerinin üstünde koyun. </li><li> Nemlendirme odaları hazırlayın ve tüm non-otoklavlanmış parçaları düzenlemek. </li><li> Yeterli boru uzunlukları ve uyumlu kaplinler kullanarak hava, atık ve medya tüp olun. </li><li> Mantar meclisleri ve folyo filtreleri ve medya otoklav için onları hazırlamak için hızlı bağlantı. Tüpün her türü (hava, ortam ve deşarj) bağlayın </li><li> Steril kemostat orta yapımında kullanılmak üzere bir damacana hazırlayın. </li><li> Uygun bağlantı parçaları ile iki delikli lastik tıpa takarak kültürü örnekleme şişeleri hazırlayın. Otoklav için onları hazırlamak için her filtreyi Folyo. </li><li> Fit düzgünce bir veya daha fazla otoklav tepsilerine dizi montajı ve tüm parçaları otoklavlamayın. </li><li> Yapmak ve otoklavlanmış bidonlarda içine kemostat medya filtre. </li></ol> 2. Deneme Oluşturma <ol><li> 700 ml GKD 2 O. ile her hidrasyon şişeyi doldurun </li><li> Istenen sıcaklıkta ısıtma bloğu seti içine otoklavlanmış ministats yerleştirin. </li><li> 4-port manifoldu içine havayolları yerleştirin ve hava pompasını açmak. </li><li> 100 ml toplama şişe atık hatları bağlayın. </li><li> Medya boru ve medya damacana sonundan folyoyu çıkartın ve iki hızlı bağlanır bağlayın. Bir peristaltik pompa kartuş aracılığıyla pompa hortumunu her uzunluğu geçirin ve yerine onlara tıklayın. Medya pompa açın. </li><li> Haznelerine edelim. Medya pompa kapatın. </li><li> % 70 etanol ile mantar derlemeler sprey ve bir şırınga kullanılarak kültürler inoküle. Donmuş bir gliserol stok olarak inokulum bir örnek katılımİstenirse. Kültürleri 30 saat için büyümek istiyorum. </li><li> Hava akışının kapatılması ile kültür hacmi 20 ml&#39;ye ayarlanır kadar atık iğne yüksekliğini ayarlar. Bu bir saat boyunca çeşitli ayarlamalar sürebilir. Ne zaman tekrar hava akışını açın tamamladı. </li><li> Üzerine medya pompası çevirin. </li><li> Ortam çalışma kültürü hacmi kurarken toplanan ve saati kaydedebilmek içeren atık örnekleme şişeleri, boşaltın. </li><li> Bir zaman sıfır ölçümü yer almak 15 dakika-2 saat (DNA analizi için örnek istediğimiz hacmine bağlı olarak) için steril toplama tüpleri içine atık hatları. İsterseniz aynı anda her iki kültür için bir gliserol dondurulmuş stok yapmak. </li></ol> 3. Günlük Ölçümler <ol><li> Buz üzerinde 15 dakika-2 saat (gibi deney için gerekli) için buz üzerinde zaman sıfır ölçüm, numune ile DNA ve dondurulmuş stok numune için numune zamanı kaydetmek gibi. </li><li> RNA örnekleri ya küçük vol toplamak içinkültür bir şırınga ve 22G 5 &quot;iğne kullanılarak ume ya da tüm kültür hasat etmek için her bir ministat atmak. Numuneler, filtrasyon ile toplandı, hızlı bir şekilde alınır ve hemen sıvı nitrojen içinde dondurulur. </li><li> Seyreltme oranı ölçmek için her ministat için son örnekleme yana toplanan atık ölçün. Pompa ayarı yeniden ayarlayarak gerekirse seyreltme oranları ayarlayın veya ince tekil pompa hatları ayarlayın ayarlama. </li><li> Boş bir koleksiyon şişelerde atık hatları değiştirin. </li><li> Hücre / ml yanı sıra diğer ilgi noktaları ölçmek ve gliserol dondurulmuş stok yapmak. </li></ol> 4. Post-deney Temizleme <ol><li> Ayrı tepsiler içinde tüm tüp yerleştirin ve GKD 2 O. ile aşırı yıkayın Bir akvaryum pompası ile Kuru tüp. </li><li> GKD 2 O ile mantar derlemeler temizleyin ve sırayla su aspirasyon ve dağıtım, iğneleri temizlemek için iğne ucu kullanın. Herhangi kaldırmak için iğne ve mantar dışını silinrezidüel medya. </li><li> Su ve etanol ile cam tüp temizleyin ve 3 ile fiziksel kirleri çıkarmak Kimwipes ve forseps kadar tıkıştırılmış. </li><li> Durulayın ve kullanmadan önce tekrar tüm parçaları kurulayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R&#233;cherches+sur+la+Croissance+des+Cultures+Bacteriennes.">R&#233;cherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes.</a> Ann. I. Pasteur. 79, 390-410 (1950).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+the+chemostat.">Description of the chemostat.</a> Science. 15, 715-716 (1950).</li><li>Daran-Lapujade, P., Daran, J. -. M., van Maris, A. J. A., de Winde, J. H., Pronk, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat-based+micro-array+analysis+in+baker's+yeast.">Chemostat-based micro-array analysis in baker's yeast.</a> Adv. Microb. Physiol. 54, 257-311 (2009).</li><li>ter Linde, J. J. M., Pronk, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181, 7409-7413 (1999).</li><li>Boer, V., de Winde, J., Pronk, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome-wide+transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisiae+grown+on+glucose+in+aerobic+chemostat+cultures+limited+for+carbon,+nitrogen,+phosphorus,+or+sulfur.">The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur.</a> J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).</li><li>Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K., Oliver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+nutrient+control+of+gene+expression+in+Saccharomyces+cerevisiae+during+growth+and+starvation.">Global analysis of nutrient control of gene expression in Saccharomyces cerevisiae during growth and starvation.</a> 101, 3148-3153 (2004).</li><li>Diderich, J. A., Kruckeberg, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Uptake+Kinetics+and+Transcription+of+HXT+Genes+in+Chemostat+Cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Glucose Uptake Kinetics and Transcription of HXT Genes in Chemostat Cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 274, 15350-15359 (1999).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li><li>Kubitschek, H. E., Bendigkeit, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+continuous+cultures.+I.+Dependence+of+mutational+response+upon+growth-limiting+factors.">Mutation in continuous cultures. I. Dependence of mutational response upon growth-limiting factors.</a> Mutation Res. 1, 113-120 (1964).</li><li>Gresham, D., Dunham, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Repertoire+and+Dynamics+of+Evolutionary+Adaptations+to+Controlled+Nutrient-Limited+Environments+in+Yeast.">The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast.</a> PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).</li><li>Kao, K. C., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+clonal+interference+during+adaptive+evolution+in+asexual+populations+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).</li><li>Kvitek, D. J., Sherlock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Sign+Epistasis+between+Frequently+Experimentally+Evolved+Adaptive+Mutations+Causes+a+Rugged+Fitness+Landscape.">Reciprocal Sign Epistasis between Frequently Experimentally Evolved Adaptive Mutations Causes a Rugged Fitness Landscape.</a> PLoS Genet. 7, e1002056 (2011).</li><li>Helling, R. B., Adams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+during+Growth+in+a+Constant+Environment.">Evolution of Escherichia coli during Growth in a Constant Environment.</a> Genetics. 116, 349-358 (1987).</li><li>Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evolution+in+Yeast:+A+Practical+Guide.">Experimental Evolution in Yeast: A Practical Guide.</a> Methods Enzymol. 470, (2010).</li><li>Hoskisson, P. A., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+-+making+a+comeback.">Continuous culture - making a comeback.</a> Microbiology. 151, 3153-3159 (2005).</li><li>Nanchen, A., Schicker, A., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+dependency+of+intracellular+fluxes+on+growth+rate+in+miniaturized+continuous+cultures+of+Escherichia+coli.">Nonlinear dependency of intracellular fluxes on growth rate in miniaturized continuous cultures of Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 1164-1172 (2006).</li><li>Klein, T., Schneider, K., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+miniaturized+stirred+bioreactors+for+parallel+continuous+cultivation+of+yeast+with+online+measurement+of+dissolved+oxygen+and+off-gas.">A system of miniaturized stirred bioreactors for parallel continuous cultivation of yeast with online measurement of dissolved oxygen and off-gas.</a> Biotechnol. and bioeng. , (2012).</li><li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat.">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li><li>Groisman, A., Lobo, C., Cho, H., Campbell, J. K., Dufour, Y. S., Stevens, A. M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells.">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Adjustment+and+Metabolic+Remodeling+in+Glucose-limited+Yeast+Cultures.">Homeostatic Adjustment and Metabolic Remodeling in Glucose-limited Yeast Cultures.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 2503-2517 (2005).</li><li>Torres, E. M., Amon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317, 916-924 (2007).</li><li>Regenberg, B., Nielsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth-rate+regulated+genes+have+profound+impact+on+interpretation+of+transcriptome+profiling+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Biology. 7, R107 (2006).</li><li>Castrillo, J. I., Oliver, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+of+the+eukaryote+cell:+a+systems+biology+study+in+yeast.">Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast.</a> Journal of Biology. 6, 4 (2007).</li><li>Brauer, M. J., Botstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+rate,+cell+cycle,+stress+response,+and+metabolic+activity+in+yeast.">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li><li>Ferenci, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+physiology,+regulation+and+mutational+adaptation+in+a+chemostat+environment.">Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment.</a> Adv. Microb. Physiol. 53, 169-229 (2008).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Herhangi kemostat olduğu gibi ministats içinde kemostat ekimi, ayrıntı ve sorun giderme dikkat gerektirir. Kontaminasyon sürekli kültür deneylerinde büyük bir endişe olduğu için, biz genellikle bakteri ve mantar aşılama sırasında kirlenme ve uzun vadeli evrim deneyleri sırasında her 50 nesiller için mikroskop üzerinden bakmak. Biz 300&#39;den yüksek nesiller (veriler gösterilmemiştir) 96 evrim deneyi üzerinde kontaminasyon tespit değil bugüne kadar. Ministats ve atık su hattı yoluyla kültür odası kolonize mikropların potansiyeli arasındaki çapraz kirlenme için test etmek için, her bir diğer ministat yukarıdaki gibi maya ve geri kalan herhangi bir kültürü ile inoküle değil ile inoküle edildiği gibi 16 ministats bitti. Kültürleri her gün boşaltılmış bir ortak atık kabına örneklenmiştir. Kirletici atık çizgisi üzerinden girmek için mümkün olsaydı Böylece biz büyük olasılıkla gözlenen olurdu bu experim içindeent. Üç hafta ve biz sigara inoküle ministat kültür tüpleri büyüme gözlemlemek vermedi inoküle ve non-inoküle kültürlerin bu dama tahtası deseni büyüme 100&#39;den büyük nesiller dışında maya ya da diğer mikroplar kontaminasyon deneylerinde olasl düşündüren sırasında benzer zaman dilimlerini. Ministats ticari chemostats benzer bir moda çalışmak üzere tasarlanmış olmasına rağmen, bu düzenlemenin modüler yapısı optimizasyonu için kullanıcıların ihtiyaçlarına ve bütçelerine uygun sağlar. Bu protokolde kullanılan peristaltik pompa 0.0186 vol / saat 3.6 hacim / saat (veriler gösterilmemiştir) arasındaki akış hızlarına ulaşabilirsiniz. Seyreltme oranları artmış kontrolü alternatif pompa modelleri ile elde edilebilir. Düşük seyreltme oranlarda işlem damlacık teslim aynı frekansı elde etmek için daha yüksek bir iğne arasında ikame gerektirebilir. Nüfus büyüklüğü evrim deneyleri uygun tasarımı için önemli bir husustur.Burada kullanılan standart dilüsyon oranı ve besin konsantrasyonu yayınlanan evrim çalışmaları olarak büyüklükte aynı düzenin nispeten büyük bir nüfus büyüklüğü (~ 10 9 hücreleri) içerir. 11. Büyük veya küçük kitlelerin çalışma hacmini değiştirerek veya besin konsantrasyonu sınırlayarak muhafaza edilebilir. Artan mutasyon kaynağı da yüksek mutasyon oranlarına sahip suşlar ile çalışarak elde edilebilir. Ministats da mevcut tasarımı üzerinde geliştirilebilir. Örneğin yoğuşma kültürü tüp duvarları üzerinde toplamak ve büyük derin su banyosunda, inkübatör veya sabit sıcaklık odasında kullanılarak azaltılabilir için. Topaklanma ve sülfat sınırlı kültürlerde duvar büyüme 300 nesiller (veriler gösterilmemiştir), yüzey çeşitli 5/48 evrim deneylerde ortaya çıkan, nispeten nadir görülür rağmen bu özelliği azalan veya geciktirmek yardımcı olabilir mevcuttur. Topaklanma uygun kültür müdahale durumundaKarışım, yüksek ajitasyon her bir hava pompası ayrılır yolu sayısını azaltarak ya da bir karıştırma aparatı ekleyerek elde edilebilir. Çözünmüş gaz konsantrasyonu, pH, ya da diğer parametreler için ek probları, aynı zamanda, bazı başka tasarımlarda olduğu gibi, dahil edilebilir. 17 Büyük hacimli ticari chemostats için bildirilen verilere bizim cihaz karşılaştırırken potansiyel değişim rağmen, bu protokolde belirtilen ministats kullanarak, biz son derece tutarlı deneysel parametreleri ve tekrarlanabilir sonuçlar gözlenmiştir. Bu 10-15 nesiller (Şekil 2A) içinde kararlı durum dengeye ulaşması ve denge benzeri kültür yoğunlukları elde aracılığıyla görüldüğü gibi hücresel fizyoloji tekrarlanabilirlik dahil. Gen ekspresyonu demir metabolizması genetik dışında, biyolojik üç ministats çoğaltır genelinde ve ministats ve ticari büyük hacimli platformlar (Şekil 2B) arasında tutarlıydı. Bu expdışarı yansıması farklılıklar muhtemelen iki aygıt veya medya maddeler kalitesinde iyileştirmeler metal içeriği değişikliklerden kaynaklanır. Bizim veri ministats tutarlı bir ortam gereklidir fizyoloji veya rekabet deneyler için yararlı olacağını düşündürmektedir. Ministat tasarımı biz 250 nesiller için sülfat sınırlaması altında kültürler gelişti ve SUL1 loküsündeki amplifikasyon karakterize etmek CGH kullanılan deneysel evrim uygulamalar için yeterli olup olmadığını test etmek için -. Daha büyük hacimli chemostats bu koşullar altında uzun-dönemli evrimi bir işaretidir 10 Biz gözlenen sülfat sınırlı medya 4/4 bağımsız bir evrim deneyleri (Şekil 2C) adlı klonlar SUL1 amplifikasyonu. Bir bütün olarak ele alındığında bu veriler, ministats geleneksel kemostat çeşitli uygulamalar için yararlı olabilecek güçlü bir platform olduğunu göstermektedir. Biz kültür tomurcuklanan maya kullanımı gözlenmekle birlikte, ministats gerekirAyrıca aslında kültür bakterileri ve diğer maya türleri için kullanılmış diğer organizmalar ve benzer tasarımları ile uyumlu olması. 16,17,25 Dahası küçük kültür düzeyi ve medya için korelasyon azalmıştır ihtiyaç gerektiren deneyler için ministats cazip bir alternatif hale getirebilir pahalı ve egzotik reaktifler olarak kimyasal ya da genetik ekranlarında söz konusu olabilir.

Mikrobiyal büyüme ve evrim dinamiği mikrobiyoloji, ekoloji, genetik ve biyoteknoloji için gereklidir. Kültür mikropların en yaygın yöntem hücrelerin besin açısından zengin suyu içine düşük yoğunluklu inoküle ve doygunluğunu yetiştirilen toplu, içinde. Standart laboratuar ekipmanları kullanarak gerçekleştirmek için basit olsa da, toplu kültürleri dalgalı bir kimyasal ortamda yaşamaya ve buna hücresel fizyoloji değişiyor. Bu heterojen büyüme ortamı ince fizyolojik farklılıklar maskeleyebilir ikincil büyüme ve stres etkilere neden olabilir. Seri toplu transferi Deneysel evrim belirli seçici koşullarına uyarlamaları bağlanmaya çalışırsa, komplike, büyüme fazına özel alt popülasyonlarının kompleks karışımlar için seçebilirsiniz. Kantitatif fenotipleri ölçümü gibi gecikme süresi gibi özellikleri kesin örnek zamanlama ve varyasyon gelen gürültü nedeniyle zor olabilir. Sürekli kültürlerin bir alternatif sağlamakbüyüme rejimi nereye hücreleri tekrarlanabilir fizyolojik bir kararlı duruma ulaşmak için tanımlanmış bir büyüme oranı bir kimyasal homojen bir ortamda yetiştirilebilir. Bu avantajları nedeniyle, hücresel devlet deneysel evrim ve karakterizasyon çalışmaları genellikle kemostat gibi sürekli kültürlerin kontrollü bir ortamda kullanmaktadır. 14. Bu avantajlardan Takdir kemostat kültürlerde ilgi bir canlanma yol açmıştır. 15 1950 yılındaki çıkışlarından bu yana, 1,2 kemostat sistemleri litreden mikrolitre değişen ölçeklerde çeşitli ve çeşitli uygulamalar için fonksiyon geliştirilmiştir. 16. Ticari olarak üretilen biyoreaktörler gelen özel mikroakışkanları platformlara glassblown gemilerin payı genel tasarım ilkeleri arasındadır -19 Bunlar çeşitli tasarımlar,. Bir kültür odası karıştırıldı havalanmış ve (genellikle hava yoluyla köpüren tarafından) ve burada yer alan mikroplar homojen tutulur edilirly her zaman kültür odası boyunca dağınık. Tanımlanan bileşimin sürekli olarak taze ortam ilave edildi ve ilave bir büyüme oranını kontrol eden ve kültür tarafından tecrübe kimyasal çevre etkiler. Bir taşma büyüme tüp içinde kültür hacim belirler ve bu taşma yoluyla kültür, taze ortam girdiği de aynı hızda numuneler alınacaktır. Bu şekilde kültürler hızla birçok biyolojik parametreler sabit kalır hangi bir fizyolojik kararlı bir duruma ulaşması. Chemostats ve literatürde bu çeşitli platformlarda raporlar avantajlara rağmen, yaygınlaşmasının bu sistemleri kurma ve işletme zorlukları ve ticari seçenekler getirdiği yüksek maliyetleri ile sınırlı kalmıştır. Ayrıca bu cihazlar yapmak ve nasıl kullanılacağını açıklamaları opak olabilir. Biz tasarımları ve düşük maliyetle hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizinin kullanım talimatlarını sunuyoruz. Biz atılbüyük hacimli ticari biyoreaktörlerde kültüre maya için bildirilen verilere bizim cihaz karşılaştırırken oldukça tutarlı deneysel parametreleri ve tekrarlanabilir sonuçlar Erve. Bu 10-15 nesiller içinde kararlı durum dengeye ulaşması ve denge benzeri kültür yoğunlukları elde aracılığıyla görüldüğü gibi hücresel fizyoloji tekrarlanabilirliği içerir. Ayrıca, gen ekspresyonu ministats ve bir ticari daha büyük hacimli bir platform ile tutarlı. Üç tekerrürlü kültürleri arasında seyreltme oranı, optik yoğunluk ve gen ekspresyon tekrarlanabilirliği kararlılığı bizim platformu sağlamlığını göstermek. Biz de aynı adaptif mutasyonların büyük hacimli chemostats ile benzer deneysel evrim zaman ölçeğinde ortaya olduğunu göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; silikon tüp </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Borulama: Sipariş: (50 &#39;bobin paketi) </td></tr><tr><td> 1/2 &quot;x 5/8&quot; silikon tüp (ekstra büyük) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Borulama: Sipariş: (50 &#39;bobin paketi) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; silikon hortum (orta) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Borulama: Sipariş: (50 &#39;bobin paketi) </td></tr><tr><td> Turuncu yeşil marprene pompa hortumunu </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Tubing: Oorder: 6x (6&#39;lı paket) </td></tr><tr><td> Erkek luer, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Bağlantı: Sipariş: 4x (25 paket) </td></tr><tr><td> Erkek luer kilit, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Bağlantı: Sipariş: 1x (25 paket) </td></tr><tr><td> PVDF, 1/4 &quot;1/8&quot;, konektör Azaltılması </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30703-50 </td><td> Bağlantı: Sipariş: 1x (10 paket) </td></tr><tr><td> Dikenli Y konektörü, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Bağlantı: Sipariş: 3x (10 paket) </td></tr><tr><td> Orta boru kelepçeleri </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Kelepçe: Sipariş: 1x (12 paket) </td></tr><tr><td> Gün Pinchcock (boru için metal kelepçe) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Kelepçe: Sipariş: 1x (10 paket) </td></tr><tr><td> 1/4 inç: hızlı konnektör valflı Erkek inline, tüp uyar </td><td> Balıkçı </td><td> 05-112-39 </td><td> Bağlantı: Sipariş: 1x (25 paket) </td></tr><tr><td> Kimlik, Polipropilen 1/4 inç: Bayan inline boru uyar, hızlı bağlantı valflı </td><td> Balıkçı </td><td> 05-112-37 </td><td> Bağlantı: Sipariş: 1x (5 paket) </td></tr><tr><td> Sessiz Hava Pompaları </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Akvaryum Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Hava Kaynağı: Sipariş: 4 pompaları </td></tr><tr><td> Hava filtrasyonu için PTFE filtre, 0.45 mikron, </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Hava Kaynağı: Sipariş: 1x (100 kutu) </td></tr><tr><td> Silahınız ile 1L Flask </td><td> Balıkçı </td><td> 10-181F </td><td> Hava Kaynağı: Sipariş: 2x (6 adet) </td></tr><tr><td> Silahınız şişeler için 8. silikon tıpa, delik 3/8, </td><td> Balıkçı </td><td> K953715-0801 </td><td> Hava Kaynağı: Sipariş: 8 stoper </td></tr><tr><td> 4-Port manifoldu </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Hava Kaynağı: Sipariş: 8 manifoldları </td></tr><tr><td> 55 ml&#39;lik vida kapaklı kültür tüpleri </td><td> Corning Yaşam Bilimleri </td><td> 9825-25 </td><td> Kültür Odası: Sipariş: 2x (48 paket) </td></tr><tr><td> Düzenli derialtı beyaz göbek iğne, 16G, 5 atık hattı uzunluğu inç </td&gt; <td> Balıkçı </td><td> 14-817-105 </td><td> Kültür Odası: Sipariş: 1x (100 paket) </td></tr><tr><td> Spinal tap iğne </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Kültür Odası: Sipariş: 4x (10 paket) </td></tr><tr><td> Düzenli derialtı pembe iğne </td><td> Balıkçı </td><td> 14-817-104 </td><td> Kültür Odası: Sipariş: 1x (100 paket) </td></tr><tr><td> Köpük Silikon durdurucu boyutu &quot;2&quot;, pembe </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Kültür Odası: Sipariş: 2x (20 paket) </td></tr><tr><td> 8-Peki tüpü Rack </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Kültür Odası: Sipariş: 4 raflar </td></tr><tr><td> Alt hortum çıkışı ile 10L Rezervuar şişe: Vakum kasası </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Medya: Sipariş: 2 veya daha fazla </td></tr><tr><td> Sarı köpük silikon tıpa, standart olmayan boyut 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Medya: Sipariş: 2 veya daha fazla </td></tr><tr><td> Damacana Havalandırma Filtresi </td><td> Balıkçı </td><td> 050 10 SLFG </td><td> Medya: Sipariş: 1x (10 paket) </td></tr><tr><td> Elektrik bandı, yeşil </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td> Medya: Sipariş 1 rulo. </td></tr><tr><td> Şişe üst filtre, 1L, .2 mikron, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Medya: Sipariş: (12 1 olgu) </td></tr><tr><td> Dipsavak ile 5000 ml Rezervuar şişe: vacuGüvenli um </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Medya: (İsteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Mavi Köpük Silikon stoper, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Medya: (İsteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 Kartuş pompası </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Medya Pompa: Sipariş: 1 </td></tr><tr><td> 16-kanal 205CA Uzatma pompa kafası </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Medya Pompa: Sipariş: 2 uzatma pompa başlıkları </td></tr><tr><td> Silikon akvaryum mühürleyen </td><td> Balıkçı </td><td> S18180B </td><td> Medya Pompa: Sipariş: 1 </td></tr><tr><td> 6-blok kuru banyo </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Sipariş: 2 32 ministats veya 16 için 1 için. </td></tr><tr><td> Blok başına drybath, 6 Blok x 25 mm test tüpü </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Sipariş: 16 için 32 ministats için 12 veya 6. </td></tr><tr><td> Naylon Membran Filtreler, 0.45 mikron Gözenek Boyutu; Çap: 25 mm. </td><td> Balıkçı </td><td> R04SP02500 </td><td> Hasat: Sipariş: 1x (100 paket) (opsiyonel) </td></tr><tr><td> Naylon Membran Filtreler, 0.45 mikron Gözenek Boyutu; 45 mm </td><td> Balıkçı </td><td> R04SP04700 </td><td> Hasat: Sipariş: 1x (100 paket) (opsiyonel) </td></tr><tr><td> 47 mm, büyük filtre cihazı </td><td> Balıkçı </td><td> Xx10 047 30 </td><td> Hasat: Sipariş: 1 (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Glass filtre tutucu, 25 mm, küçük filtre cihazı </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Hasat: Sipariş: 1 (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Sıvı Azot için 1L Dewar şişesi, </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Hasat: Sipariş: 1 (isteğe bağlı) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Chemostats hücreler kültür yoğunluğu belirli besinlerin sınırlandırılması ile kısıtlı bir sıkı kontrol, kimyasal sabit ortamda yetiştirilen olduğu sürekli kültür sistemleri vardır. Chemostats gelen 1,2 Veri onlar sabit bir büyüme hızı sağlamak gibi nicel fenotiplerinin ölçümü için son derece tekrarlanabilir Kararlı durumda ve çevre. Chemostats Bu sebeplerden dolayı, chemostats gen ekspresyonu 3-6 ve kararlı durum denge kültürlerin diğer özelliklerinin analizi yoluyla fizyolojisi ince ölçekli karakterizasyonu için yararlı araçlar haline gelmiştir. 7 Uzun süreli deneylerde mikrobiyal populasyonların benimsemesini belirli yörüngeleri vurgulayabilirsiniz kontrollü bir ortamda uyumsal evrimi sırasında. Aslında, chemostats onların icadından beri deneysel evrim için kullanılmaktadır. 8 evrim deneyleri yaygın bir sonuç her biyolojik çoğaltmak için mutasyonlar eşsiz bir repertuar elde etmek. 9-13 Bu çeşitlilik çok çok daha büyük throughput ile evrim deneyleri gerçekleştirerek orada keşfedilmeyi kaldığını göstermektedir. Biz burada minyatür chemostats-veya nispeten basit, düşük maliyetli dizi tasarımı ve işletimi sunmak ministats-ve fizyoloji belirlenmesinde ve maya ile evrim deneylerde kullanımlarına doğrulamak. Bu yaklaşım chemostats onlarca peristaltik pompa çoğaltılmış tek bir kaçıp büyümesini gerektirir. Kültürler çeşitli uygulamalar için kullanışlı olan bir 20 ml&#39;lik bir çalışma hacmi, tutulur. Bu, üretilen artan giderleri azalmakta ve detaylı bina ve çalıştırma talimatlarını veren de işlevsel suşları, türler, ve büyüme parametrelerini çok sayıda karakterize yanı sıra genetik için genel bir platform olarak bu tasarım araştırma ve endüstriyel uygulama motive edebilir umut ediyoruz veya uyuşturucu kütüphaneler.

Ministat dizisi üzerinde ve içinde (Şekil 1A, B) altında kültür tomurcuklanma maya bir haploid mata laboratuvar suşu (S288c) sülfat sınırlayıcı önce tarif edildiği gibi durumlar. 10. Ortak kemostat uygulamalar için etkinliğinin test fizyoloji belirlenmesi de dahil olmak üzere kullanıldı ve tanımlanmıştır Deneysel evrim. Ministats doğrulamak için, 10,20,21 ATR Sixfors fermentörler ministats on kat büyük bir hacim içinde, bir 300 ml çalışma hacmi çalıştırmak edildi. Önce endüstriyel fermentörler yapılan çeşitli deneyler kemostat kullanım için modifiye tekrarladı ve oldukça farklı mod var kültür havalandırma ve ajitasyon. Biz bu fermentörler elde ekipmanları kararlılık, devlet fizyoloji, deneysel evrim sonuçları ve gen ekspresyonu çoğaltmak için çalıştı. Seyreltme oranı ve havalandırma tekdüzelik kemostat tasarım önemli yönleri olduğundan, biz benibüyüme 15 kuşak sonra 32 ministats genelinde gerçek seyreltme oranı ölçülü ve 0.17 hacim / saat (4-5 damla / dak) bir hedef seyrelme oranı ile biz 32 üzerinde 0,0075 bir standart sapma ile 0,17208 arasında ortalama seyrelme oranı elde ettiklerini bulundu çoğaltır. Bu aralık, gen ekspresyonu büyük ölçekli değişimler gözlenmiştir ötesinde hedef belirleme, gelen + / -0.01 hacim / saat farkı bizim tipik hoşgörü içinde oldu. 22-23 Nisan ministats karşısında hava debisi 307.5 ml olarak belirlendi 9.57 ml / dak &#39;lık bir standart sapma ile / dak. Bu odalar içine hava-akış sağlamdır ve eşit 4 odacık arasında bölünmüştür göstermektedir ve endüstriyel fermentörler içinde havalandırma için tarif edilene benzer bir değerdir. 20 Biz daha önce maya 8/8 sülfat sınırlı evrim deneylerinde yüksek benzeşim kükürt-iyon taşıyıcı SUL1 tekrarlayan amplifikasyonu görülmüştür. 10. thi altında sonuçların tutarlılığı göz önüne alındığındas durumu bizim sistemde yeteneğini test etmek sülfat sınırlaması seçti. Kemostat kültürünün bir koşul öğesi sürekli kimyasal ortam sağlamak için ihtiyaç vardır. Ortam içinde bir sınırlayıcı besin ya da diğer değişiklikler bolluk dalgalanmalar, tipik olarak, belirli bir kültür içinde hücreleri sayısında bir değişiklik ile sonuçlanır. Biz 0.057 adet standart sapma ile büyüme ~ 15 kuşak sonra 1.12, ortalama A600 (~ 10 9 hücreleri) bulunması, 16 tekrarlı kültürler arasında hücre sayısı (Şekil 2A) ve ölçülen tekrarlanabilirlik için bir proxy olarak optik yoğunluk ölçülür, veya 5.1 %. Karşılaştırma için, endüstriyel fermentörler yetiştirilen 4 tekrarında kültürlerden alınan ölçümlerin% 2.5 standart sapma gösterdi. Hücreler büyüme odasında iyice karıştırılır edildi: OD ve atık parça alınan hücre sayısının ölçülmesi kültür tübüne (veriler gösterilmemiştir) tarafından doğrudan alınan numuneler için eşdeğer olmuştur. Bu sonuçlar bizim platform sağlamlığı bir göstermekendüstriyel fermentör benzer bir tolerans içinde sabit bir kimyasal ortamı sağlamak için d yeteneği. Fizyolojisinin daha duyarlı bir gösterge olarak, ministats ve endüstriyel fermentör sülfat sınırlaması altında yetiştirilen kültürler genom kararlı durum gen ekspresyonu karşılaştırıldı. Ministats gen ekspresyonu üç biyolojik (Şekil 2B) çoğaltır karşısında yüksek bir benzerlik derecesi göstermektedir. Biz daha önce RNA için iki tekrarında Sixfors chemostats türetilen ve bir mikroarray için co-melezleşmiştir kaydetti, genlerin% 99 ifadesi ampirik bir önemi kesim olarak 1.5x kullanımı sağlayan, 1,5 kat aralığında düştü. 21 Gen ekspresyonu üç tekerrürlü ministats karşılaştırıldığında, ikili, genlerin% 99 sanayi fermentörler sonuçları ile kıyaslanabilir bir 1.5-1.7 kat aralığında düştü gösterdi. Üç örnekleri Tek tek dizileri ve sonrasında hesaplanan ikili oranlarına hibridize edildi, böylece bu vafrengi biyolojik gürültü ek olarak arası bir dizi ses, potansiyel olarak yayınlanan, ortak melezleştirilmiş sonuçları ile karşılaştırıldığında çoğaltır arasında değişim abartmanin içerir. 138 genleri farklı açılardan her üç ministat&gt; 1.5 kat olarak endüstriyel fermentör yetişen bir eşleştirilmiş kültürden toplanan bir örnek ile karşılaştırıldığında tekerrürlü ifade edildi. Ministats ifade azalma Genler ağır demir metabolizması için zenginleştirilmiştir. Bu imza her cihazın konfigürasyonu farklı metal kompozisyonu yansıtıyor olabilir: Sixfors aparatı kültürü dalmış bir metal fan ve havalandırma düzeneği içerir ve önceden kullanılan ortam bidonlarda zamanda metal donanım gereklidir. Ministat paslanmaz çelik iğneler, ancak başka metal bileşenleri kullanır. Bu dernek biyolojik önemi açıklığa olsa artmış ekspresyonu ile Genler büyük ölçüde, hücre zarları ile ilişkili bulunmuştur. Son olarak, deneysel evrim unde testr bu koşullar. Dizi Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH, Şekil 2C) tarafından tespit edilen sülfat-sınırlı büyüme 250 nesil sonra 4 bağımsız gelişen nüfus testinden 4/4 klon SUL1 amplifikasyonu gösterdi. Bu sonuç, benzer zaman aralıkları boyunca büyük hacimli chemostats bulgularla tutarlıdır. 10 <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Kültür odası Şekil ministat dizisi 1. A. Tasarım ve düzenleme. B. Tasarım. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Şekil 2. A. experimeBu kültürler arası ntal veri büyüme on nesiller (n = 16) içinde dengeye ulaşması. biyolojik üç eşleşen bir sülfat sınırlı Sixfors kemostat yetişen yaygın bir referans ile karşılaştırıldığında sülfat sınırlaması altında kararlı durum sırasında örneklenen S1-3 çoğaltır B. İfade verileri . C. SUL1 amplifikasyonlar bir sülfat-sınırlı bir ortamda büyümenin 250 kuşak sonra ministats kurtarıldı. Tarif edildiği gibi her bir gelişti klon genomik DNA CGH ile ata DNA ile karşılaştırılmıştır. 21 kopya sayısı, her bir bölgenin amplifiye için hesaplandı ve her bir amplikon yanında gösterilmektedir hesaplandı. Tüm mikroarray veri üyelik GSE36691 altında GEO veritabanında depolanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays at JoVE.com

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Biz geliştirdi ve düşük maliyet için hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizi doğrulanmış. Fizyolojik ve deneysel evrim sonuçları büyük hacimli chemostats benzerdi. Ministat dizi geleneksel kemostat deneyler, fonksiyonel genomik ve kimyasal tarama uygulamaları için, kompakt, ucuz ve erişilebilir bir platform sağlar.

Multiplexed kemostat Diziler Tasarımı ve Kullanımı

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

design-and-use-of-multiplexed-chemostat-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K Görüntüleme.  University of Washington. Biz geliştirdi ve düşük maliyet için hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizi doğrulanmış. Fizyolojik ve deneysel evrim sonuçları büyük hacimli chemostats benzerdi. Ministat dizi geleneksel kemostat deneyler, fonksiyonel genomik ve kimyasal tarama uygulamaları için, kompakt, ucuz ve erişilebilir bir platform sağlar.

Video: Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays. Robust flow control and precise fluidic volumes are two critical requirements for these applications. We have developed microfluidic chips featuring elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS) microvalve arrays that: 1) need no extra energy source to close the fluidic path, hence the loaded device is highly portable; and 2) allow for microfabricating deep (up to 1 mm) channels with vertical sidewalls and resulting in very precise features.

The PDMS microvalves-based devices consist of three layers: a fluidic layer containing fluidic paths and microchambers of various sizes, a control layer containing the microchannels necessary to actuate the fluidic path with microvalves, and a middle thin PDMS membrane that is bound to the control layer. Fluidic layer and control layers are made by replica molding of PDMS from SU-8 photoresist masters, and the thin PDMS membrane is made by spinning PDMS at specified heights. The control layer is bonded to the thin PDMS membrane after oxygen activation of both, and then assembled with the fluidic layer. The microvalves are closed at rest and can be opened by applying negative pressure (e.g., house vacuum). Microvalve closure and opening are automated via solenoid valves controlled by computer software.

Here, we demonstrate two microvalve-based microfluidic chips for two different applications. The first chip allows for storing and mixing precise sub-nanoliter volumes of aqueous solutions at various mixing ratios. The second chip allows for computer-controlled perfusion of microfluidic cell cultures.

The devices are easy to fabricate and simple to control. Due to the biocompatibility of PDMS, these microchips could have broad applications in miniaturized diagnostic assays as well as basic cell biology studies.

We demonstrate protocols for manufacturing and automating elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS)-based microvalve arrays that need no extra energy to close and feature photolithographically defined precise volumes. A parallel subnanoliter-volume mixer and an integrated microfluidic perfusion system are presented.

Elastomerik Mikrovalf Diziler Kontrollü mikroakışkan Chips

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Biyoloji

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform routine activities, but prosthetic suspensions using traditional socket technology can prove to be cumbersome and uncomfortable for a person with limb loss.  Moreover, for those with high proximal amputations, limited residual limb length may prevent exoprosthesis attachment all together. Osseointegrated implant technology is a novel operative procedure which allows firm skeletal attachment between the host bone and an implant. Preliminary results in European amputees with osseointegrated implants have shown improved clinical outcomes by allowing direct transfer of loads to the bone-implant interface.  Despite the apparent advantages of osseointegration over socket technology, the current rehabilitation procedures require long periods of restrictive load bearing prior which may be reduced with expedited skeletal attachment via electrical stimulation.  The goal of the osseointegrated intelligent implant design (OIID) system is to make the implant part of an electrical system to accelerate skeletal attachment and help prevent periprosthetic infection. To determine optimal electrode size and placement, we initiated proof of concept with computational modeling of the electric fields and current densities that arise during electrical stimulation of amputee residual limbs.  In order to provide insure patient safety, subjects with retrospective computed tomography scans were selected and three dimensional reconstructions were created using customized software programs to ensure anatomical accuracy (Seg3D and SCIRun) in an IRB and HIPAA approved study.  These software packages supported the development of patient specific models and allowed for interactive manipulation of electrode position and size. Preliminary results indicate that electric fields and current densities can be generated at the implant interface to achieve the homogenous electric field distributions   required to induce osteoblast migration, enhance skeletal fixation and may help prevent periprosthetic infections.  Based on the electrode configurations experimented with in the model, an external two band configuration will be advocated in the future.

There is a need to develop alternative prosthesis attachment due to limb loss attributed to vascular occlusive diseases and trauma. The goal of the work is to introduce an osseointegrated intelligent implant design system to increase skeletal fixation and reduce periprosthetic infection rates for patients needing osseointegrated technology.

Ampüteler Osseointegrasyon Akıllı İmplant Tasarım Sistemi Biyoelektrik Analizleri

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Rekombinant çekirdek histon nükleozomal Diziler ve Nükleozom Konumlandırma DNA Meclisi

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Drosophila'da Sıcaklık Tercih Davranışının ve Sirkadiyen Ritminin Tasarımı ve Analizi

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...