ビデオの作成は、研究資源のためのナショナルセンター（5P41RR011823-17）と米国立衛生研究所（NIH）から一般医科学研究所（8 P41 GM103533-17）からの補助金によって支えられている。この作品はまた、NSFの助成金1120425によってサポートされていました。 MJDはリタ·アレン財団奨学生です。 AWMはNIH T32 HG00035によって部分的にサポートされています。我々は、改善のプロトコルと支援のためにアンナ·サンシャインに感謝します。さらに、当社はministatsの初期ユーザーとしてサラDiRienzi、セリアペイアン、とエイミーSirrを認める。

プロトコルを通して適切な滅菌技術を使用してください。 1。のための部品を組み立ててMinistatアレイを準備する<ol><li>すべての部品を注文してください。 </li><li>ガラス管を清掃してください。 20mlの音量でチューブをマークします。 </li><li>コルク空気とアセンブリ、メディア、および排水口を作り、洗浄したガラス培養管の最上部に置いてください。 </li><li>加湿チャンバーを用意し、すべての非オートクレーブした部品を配置します。 </li><li>十分なチューブの長さと互換性のあるカップリングを使用して空気、排水、およびメディア·チューブを作る。 </li><li>オートクレーブのためにそれらを準備するためにコルクアセンブリおよび箔フィルターやメディアクイック接続にチューブの各種類（空気、メディア、および廃液）を接続します。 </li><li>無菌ケモスタット培地を作る際に使用するためにカーボイを準備します。 </li><li>適切な金具を使用した2穴のゴム栓を挿入することにより、文化のサンプリングボトルを準備します。オートクレーブのためにそれらを準備するために、各フィルタをくじく。 </li><li>無線LANトンきちんと一つ以上のオートクレーブトレイに配列を組み立てて、すべての部品をオートクレーブ。 </li><li>オートクレーブしたガラス製にケモスタットメディアを作成し、フィルタリングします。 </li></ol> 2。実験のセットアップ<ol><li> 700ミリリットル蒸留H 2 Oでそれぞれ水和フラスコを埋める</li><li>所望の温度に設定した加熱ブロックにオートクレーブしministatsを置きます。 </li><li> 4ポートのマニホールドに航空会社を置き、空気ポンプの電源をオンにします。 </li><li> 100mlのコレクションボトルに廃液ラインを接続します。 </li><li>メディアチューブとメディアカーボイの端からホイルを外し、クイックコネクト2を接続してください。蠕動ポンプカートリッジにポンプチューブのそれぞれの長さを通し、所定の位置にそれらをクリックします。メディアポンプの電源をオンにします。 </li><li>チャンバが埋めるましょう。メディアポンプの電源を切ります。 </li><li> 70％エタノールでコルクアセンブリをスプレーし、シリンジを用いて培養を接種する。凍結グリセロールストックとして接種のサンプルを保存必要に応じて。培養は30時間のために成長しましょう​​。 </li><li>空気の流れをオフにして培養液量を20mlに設定されるまで、排水針の高さを調整します。これは、時間の経過とともに、いくつかの調整を取ることができる。するときは、背面の空気の流れを回し終えた。 </li><li>上のメディアポンプを回します。 </li><li>ワーキング培養液量を設定し、時間を記録しながら、収集したメディアを含む廃液サンプリングボトルを空にします。 </li><li>時間ゼロで測定場所を取るために15分-2時間（DNA分析のためにサンプルを取りたいどのボリュームに依存します）のための無菌採血管に排水ライン。必要に応じても、この時点でそれぞれの文化のためにグリセロール凍結ストックを作る。 </li></ol> 3。連日測定<ol><li>氷上で15分-2時間（あなたの実験のために必要）を氷上で自分の時間ゼロ測定は、試料とDNAおよび凍結ストックのサンプルのためにサンプリング時間を記録として。 </li><li> RNAサンプルのいずれか小さいvolを集めるために培養液からシリンジと22G 10 &quot;針を使用してUMEや文化全体を収穫するために、各ministatを抜く。サンプルを濾過によって集め、素早く取り出し、液体窒素中で直ちに凍結しなければなりません。 </li><li>希釈率を定量化するために、各ministatための最後のサンプリング以来収集した排水を測定します。ポンプの設定を再調整することにより、必要に応じて希釈倍率を調整するか、罰金は、個々のポンプラインで調整チューニング。 </li><li>空のコレクションボトルに廃液ラインを取り付けます。 </li><li>細胞/ mlを定量化するだけでなく、関心のある他のエンドポイントとグリセロール凍結ストックを作る。 </li></ol> 4。ポスト実験のクリーンアップ<ol><li>個別のトレイにすべてのチューブを置き、蒸留H 2 Oで過度にすすぎ水槽のポンプを用いたドライチューブ。 </li><li> ddH 2 Oでコルクアセンブリを清掃し、順番に水を吸引し、調剤、針をクリーニングするニードルインサートを使用しています。いずれかを削除するために針とコルクの外側を拭き残留メディア。 </li><li>水とエタノールでガラス管を清掃し、3で物理的な汚染物質を除去するには、キムワイプと鉗子を球状に。 </li><li>使用前に、もう一度すべての部品を洗浄し、乾燥させます。 </li></ol>

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著者らは、利害の対立がないことを宣言します。

任意ケモスタットと同様ministatsでケモスタット培養は、詳細およびトラブルシューティングに注意を払う必要があります。汚染が連続培養実験における大きな関心事であるので、我々は一般的に長期的な進化実験中に接種し、すべての50世代によって細菌および真菌汚染のために顕微鏡を介して見える。これまでに我々はより大きい300世代の96進化実験（データは示さず）にわたって汚染は確認されていません。 ministats、我々は他のすべてのministatが上記のように酵母を接種した、残りは任意の培養を接種していなかったような16 ministatsを走った廃液ラインを経由して、培養室にコロニーを形成する微生物の可能性との間のクロスコンタミネーションをテストします。培養物は、一日おきに空にされた共同体廃棄物容器に採取した。汚染物質が排水ラインを介して入力することが可能であった場合、このように我々は、おそらく認められていたであろうこのexperimでENT。我々が外の酵母または他の微生物からの汚染がの実験で発生する可能性が低いことを示唆し、非接種ministat培養管の成長を観察していない接種と非接種文化のこの市松模様の3週間と成長の100世代よりも大きい時に類似のタイムフレーム。 ministatsが商業ケモスタットに類似した方法で動作するように設計されていたが、この配置のモジュール性は、最適化のために、ユーザーのニーズと予算に合わせてすることができます。このプロトコルに使用される蠕動ポンプは0.0186体積/時間〜3.6体積/時間（データは示さず）との間の流量を達成することができます。希釈率の増加制御が代替ポンプモデルを達成できた。低い希釈率での動作が可能になり、液滴配達の同じ周波数を達成するために、より高いゲージの針の置換を必要とするかもしれないことに注意してください。人口規模では、進化実験を適切に設計するための重要な考慮事項です。ここで使用される標準的な希釈率と栄養塩濃度は、公開され進化の研究と同程度の大きさの比較的大きな人口規模（約10 9個の細胞）を提供しています11もっと大きくしたり、小さくしたり集団が作業容量を変更したり、栄養塩濃度を制限することによって維持することができた。増加した変異供給も上昇突然変異率を有する株を操作することで得ることができた。 ministatsはまた私達の現在の設計で改善することができた。インスタンスの縮合に関しては培養チューブの壁に収集することができ、大幅に深い水浴、インキュベーター、または恒温室を使用することで軽減することができます。凝集と硫酸限られた文化の壁の伸びは300世代（データは示さず）、界面活性剤の様々な方法によって48分の5進化実験に現れる、比較的まれであるように見えるけれども、この特性を減少または遅延させるのを助けることができることを提供しています。凝集が十分な文化を妨害した場合には混合、攪拌増加は、各空気ポンプが分割されている方法の数を減らすことによって、または攪拌装置を追加することで実現できます。溶存ガス濃度、pH、または他のパラメータの追加のプローブにもいくつかの他のデザインのように、含まれる可能性があります。17 大きい容積の商業ケモスタットための報告データに我々のデバイスを比較するときに、このプロトコルに記載されているようministatsを使用して潜在的な変更にもかかわらず、我々は非常に一貫性のある実験パラメータと再現性のある結果を観察した。これは10から15世代（ 図2A）内に定常状態平衡に達すると平衡状態で似たような文化の密度を得ることを通じて見られるように、細胞生理の再現性が含まれていた。遺伝子発現パターンは、3つの生物間で一貫していた鉄代謝遺伝子を除いて、ministatsとministatsや商業大容量のプラットフォーム（ 図2B）の間で複製されます。これらのEXPressionの違いはおそらく2つのデバイスまたはメディア食材の質の向上の金属含有量の変化によって引き起こされます。我々のデータはministatsが一貫した環境が必要とされる生理または競合実験に有用であろうことを示唆している。 ministatデザインは、我々は250の世代のために硫酸塩制限下の文化を発展し、SUL1座の増幅を特徴づけるために、CGH用いた実験進化の用途には十分であるかどうかをテストするために- 。大きなボリュームケモスタットでこれらの条件の下での長期的な進化の特徴10我々は観察硫酸限られたメディアで4月4日の独立した進化実験（ 図2C）からクローンにおけるSUL1の増幅。全体として見ると、これらのデータはministatsは、伝統的なケモスタットの様々なアプリケーションに有用であり得る堅牢なプラットフォームであることを示唆している。我々は培養出芽酵母におけるそれらの使用を実証していますが、ministatsはすべきまた、実際に培養細菌や他の酵母種のために使用されている他の生物と同じような設計と互換性がある。16,17,25さらに小さく培養容量とメディアのための必要性が減少した相関が必要な実験のためにministatsに魅力的な代替手段を行うことができる高価なまたはエキゾチック試薬は、化学的または遺伝子スクリーニングの場合することができます。

微生物の成長と進化の原動力は微生物学、生態学、遺伝学、バイオテクノロジーの基礎である。培養微生物の最も一般的な方法は、細胞が栄養豊富な培地に低密度で接種し、飽和状態に栽培されているバッチである。標準的な実験装置を使用して実行することは簡単だが、バッチ培養は、変動の化学的環境を体験し、それに応じて、細胞生理を変える。この異種の生育環境は、二次成長と微妙な生理的な違いを隠すことができるストレスの影響をもたらすことができます。シリアルバッチ転送による実験的進化は特定の選択条件に適応を接続しようとする試みを複雑にし、成長期特有の亜集団の複雑な混合物のために選択することができます。定量的な表現型の測定は、ラグタイムなどの機能で不正確なサンプルタイミングとバリエーションからノイズに起因する困難にな​​る可能性があります。連続培養は、代替手段を提供細胞が再現生理定常状態に到達するために定義された成長率で化学的に均質な環境で栽培することができる成長レジーム。これらの利点により、細胞の状態の実験的進化と特性評価の研究はしばしばケモスタットのように連続培養の制御された環境を利用しています14 これらの利点の増価はケモスタット文化への関心の復活につながっている。15 1950年の発売以来、1,2ケモスタットシステムはリットルからマイクロリットルに至るまで様々なスケールで、様々なアプリケーションを機能させるために開発されてきた16シェアは、商業的に生産バイオリアクターからglassblown船舶へのカスタムマイクロ流体プラットフォームへの一般的な設計原則の範囲-19これらの様々なデザイン、。培養室を攪拌し、通気し（通常はそれを介して空気をバブリングすることによって）、その中に含まれる微生物は均質保持されているLyはすべての回で、培養室全体に分散。定義された組成の新鮮な培地を継続的に追加され、添加速度は、成長率を制御し、文化が経験した化学的環境に影響を与えている。オーバーフローが成長チューブ内培養液量を設定し、このオーバーフローによって文化を新鮮な培地が入ったときと同じレートでサンプリングされます。このように文化はすぐに多くの生物学的パラメータが一定のままでいる生理定常状態に達する。ケモスタットや文学では、これらのさまざまなプラットフォームでのレポートの利点にもかかわらず、広範な普及は、これらのシステムの構築と運用の難しさ、および商用オプションに伴う高コストによって制限されています。さらに、これらのデバイスを作成し、使用する方法の説明が不透明であることができる。 私たちは、デザインと低コストで容易に入手できる部品から構築ミニチュアケモスタットのフットプリントの小さい配列の使用説明書を提示します。我OBS大きなボリュームの商用バイオリアクターで培養した酵母のための報告されたデータへの我々のデバイスを比較する際に非常に一貫性のある実験パラメータと再現性のある結果をerve。これは10から15世代以内定常状態平衡に達すると平衡状態で似たような文化の密度を得ることを通じて見られるように、細胞生理の再現性を備えている。さらに、遺伝子発現パターンはministatsや商業大音量のプラットフォーム間で一貫しています。 3複写文化間の希釈率、光学濃度および遺伝子発現の再現性の安定性は、当社のプラットフォームの堅牢性を実証している。また、同じ適応変異が大きく、ボリュームケモスタットと同様に同様の実験進化の時間スケールで起こることを示している。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;×7/32&quot;シリコンチューブ</td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td>チューブ：オーダー：（50 &#39;コイルパック） </td></tr><tr><td> 1/2 &quot;×5/8&quot;シリコンチューブ（特大） </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td>チューブ：オーダー：（50 &#39;コイルパック） </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;×3/8&quot;シリコンチューブ（ミディアム） </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td>チューブ：オーダー：（50 &#39;コイルパック） </td></tr><tr><td>オレンジ緑marpreneポンプチューブ</td><td>ワトソン·マーロー</td><td> 978.0038.00 + </td><td>チューブ：Order：6X（6個入） </td></tr><tr><td>雌型ルアー、1/8 &quot;バーブ</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> HV-45500から04 </td><td>コネクタ：注文：4倍（25本パック） </td></tr><tr><td>バーブオス型ルアーロック、1/8 &quot; </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> HV-45503から04 </td><td>コネクタ：オーダー：1倍（25パック） </td></tr><tr><td> &quot;1/8&quot;、1/4コネクタ、PVDFを削減</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-30703から50 </td><td>コネクタ：オーダー：1倍（10個） </td></tr><tr><td>バーブ付きYコネクタ、1/8 &quot;ID </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> HV-30703から92 </td><td>コネクタ：注文：3倍（10個） </td></tr><tr><td>ミディアムチューブクランプ</td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td>クランプ：注文：1倍（12個入り） </td></tr><tr><td>デイPinchcock（チューブ用金属クランプ） </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td>クランプ：注文：1倍（10個） </td></tr><tr><td> 1/4インチ：クイックコネクタバルブ付きオスのインラインは、チューブに適合</td><td>フィッシャー</td><td> 05-112-39 </td><td>コネクタ：オーダー：1倍（25パック） </td></tr><tr><td> ID、ポリプロピレンインチ1/4：女性インラインチューブに適合し、クイックコネクタをバルブ付き</td><td>フィッシャー</td><td> 05-112-37 </td><td>コネクタ：オーダー：1X（5個入） </td></tr><tr><td>サイレントエアポンプ</td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">水族館Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td>エア·サプライ：受注：4ポンプ</td></tr><tr><td>空気ろ過用PTFEフィルター、0.45μmで、 </td><td>コー​​ルPARMER </td><td> HV-02915から22 </td><td>エア·サプライ：オーダー：1倍（100箱） </td></tr><tr><td>サイドアーム付き1Lフラスコ</td><td>フィッシャー</td><td> 10-181F </td><td>エア·サプライ：オーダー：2X（6パック） </td></tr><tr><td> ＃8サイドアームフラスコ用シリコン栓、穴の中の3月8日、 </td><td>フィッシャー</td><td> K953715-0801 </td><td>エア·サプライ：オーダー：8ストッパー</td></tr><tr><td> 4ポートマニホールド</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06464から85 </td><td>エア·サプライ：オーダー：8マニホールド</td></tr><tr><td> 55ミリリットルねじキャップ培養管</td><td>コー​​ニングライフサイエンス</td><td> 9825から25 </td><td>培養室：オーダー：2倍（48本パック） </td></tr><tr><td>定期的な皮下注射白ハブ針、16G、排水ラインの長さは5インチ</td&gt; <td>フィッシャー</td><td> 14-817-105 </td><td>培養室：オーダー：1倍（100枚入りパック） </td></tr><tr><td>脊椎穿刺針</td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td>培養室：オーダー：4倍（10個） </td></tr><tr><td>定期的な皮下注射針ピンク</td><td>フィッシャー</td><td> 14-817-104 </td><td>培養室：オーダー：1倍（100枚入りパック） </td></tr><tr><td>発泡シリコーンストッパーサイズ &quot;2&quot;、ピンク</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06298から06 </td><td>培養室：オーダー：2倍（20パック） </td></tr><tr><td> 8まあ管ラック</td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td>培養室：注文：4ラック</td></tr><tr><td>ボトムホース出口と10Lリザーバーボトル：真空金庫</td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td>メディア：お取り寄せ：2以上</td></tr><tr><td>黄色の泡シリコンストッパー、非標準サイズ12 </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06298から22 </td><td>メディア：お取り寄せ：2以上</td></tr><tr><td>カーボイベントフィルター</td><td>フィッシャー</td><td> 050 10 SLFG </td><td>メディア：オーダー：1倍（10個） </td></tr><tr><td>電気テープ、緑</td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td>メディア：注文1ロール。 </td></tr><tr><td>ボトルトップフィルター、1L、0.2ミクロン、45ミリメートル</td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td>メディア：オーダー：（12の1ケース） </td></tr><tr><td>底部出口で5000 mlのリザーバボトル：vacuumの安全</td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td>メディア：（オプション） </td></tr><tr><td>青い泡シリコンストッパー、nonstandardsize 10 1/2 </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06298から18 </td><td>メディア：（オプション） </td></tr><tr><td> 205S/CA16、16カートリッジポンプ</td><td>ワトソン·マーロー</td><td> 020.3716.00A </td><td>メディアポンプ：注文：1 </td></tr><tr><td> 16チャンネル205CA拡張ポンプヘッド</td><td>ワトソン·マーロー</td><td> 023.1401.000 </td><td>メディアポンプ：オーダー：2拡張ポンプヘッド</td></tr><tr><td>シリコーン水族館シーラー</td><td>フィッシャー</td><td> S18180B </td><td>メディアポンプ：注文：1 </td></tr><tr><td> 6ブロック乾燥浴</td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock：お取り寄せ：2 32 ministatsまたは16のための1のために。 </td></tr><tr><td> drybath、ブロックあたり6×25 mm試験管用ブロック</td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock：お取り寄せ：32 ministatsのための12か6 16。 </td></tr><tr><td>ナイロンメンブレンフィルター、孔径0.45μm、直径：25ミリメートル。 </td><td>フィッシャー</td><td> R04SP02500 </td><td>収穫：オーダー：1倍（100枚入りパック）（オプション） </td></tr><tr><td>ナイロンメンブレンフィルター、孔径0.45μm、45ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> R04SP04700 </td><td>収穫：オーダー：1倍（100枚入りパック）（オプション） </td></tr><tr><td> 47ミリメートル、大型フィルター装置</td><td>フィッシャー</td><td> XX10 047 30 </td><td>収穫：注文：1（オプション） </td></tr><tr><td> GLASSフィルターホルダー、25mmの小さなフィルタ装置</td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td>収穫：注文：1（オプション） </td></tr><tr><td>デュワーフラスコ、液体窒素用1L </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td>収穫：注文：1（オプション） </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

ケモスタットは、細胞を培養密度は、特定の栄養素を制限することによって制約されて厳密に制御され、化学的に一定の環境に成長させた連続培養システムです。ケモスタットから1,2のデータは、それらが一定の成長率を提供するように定量的な表現型を測定するための非常に再現性がある定常状態で、環境。これらの理由から、ケモスタットは、遺伝子発現3-6および定常均衡における文化の他の特性の分析による生理機能の微細特性評価のために有用なツールとなっています。ケモスタット7長期実験は微生物集団が採用する特定の軌跡を強調表示することができます制御された環境での適応進化の過程。実際には、ケモスタットは、その発明以来、実験的な進化のために使用されている。8進化実験における一般的な結果は、されている各生物の複製のために突然変異のユニークなレパートリーを取得する。9-13は、この多様性は、はるかにはるかに大きなスループットと進化実験を行うことによって発見されるようにそこに残っていることを示唆している。 我々はここでミニチュアケモスタットまたは比較的単純な、低コストのアレイの設計と動作提示ministatsを、生理学の決定において、酵母による進化実験におけるそれらの使用を検証します。このアプローチは、ケモスタット数十単一の多重化蠕動ポンプをオフに実行の成長を伴います。文化は、様々な用途のために実用的である20ミリリットル作業容積に維持されています。これは、経費を減らし、スループットを向上させることを願っていますし、詳細な建物と操作指示を提供することにも機能的に株、種、成長パラメータの多数を特徴付けるための一般的なプラットフォームとして、このデザインの研究と産業応用のやる気を引き出すだけでなく、遺伝的なことがまたは薬物ライブラリ。

ministatアレイ（ 図1A、B）は、上記とで説明の下に文化に出芽酵母の一倍体マタ実験室株（S288C）を使用した硫酸制限前述のように条件を10我々は、生理学の決定を含む一般的なケモスタットアプリケーションのための有効性をテストし、実験的な進化。 ministatsを検証するために、我々は以前にケモスタット使用するために変更され、工業発酵槽で行われ、いくつかの実験を繰り返し10,20,21のATR Sixforsの発酵はministatsの10倍の体積の上、300ミリリットルの作業ボリュームで実行された、とかなり異なるモードを持っている文化通気や攪拌の。我々は、これらの発酵槽を用いて得られた機器の安定性、定常状態の生理学、実験的な進化の結果、遺伝子発現パターンを複製しようとしました。 希釈率と通気の均一性がケモスタット設計の重要な側面ですので、私成長の15代後32 ministats渡る実際の希釈率をasuredおよび0.17体積/ hrのターゲットの希釈率（4-5滴/分）で我々は32を越え0.0075、標準偏差は0.17208の平均希釈率を達成したことがわかった複製されます。この範囲は+ / -0.01の私たちの代表的な耐性遺伝子発現の大規模な変化が観察されているそれを超える目標設定から、体積/時間差の範囲内であった。4 ministatsアクロス22から23の空気流量は307.5ミリリットルであることが決定された9.57ミリリットル/分の標準偏差/分。これは、チャンバー内への空気の流れは、堅牢かつ均等に4室の間で分割され、工業発酵槽における曝気について説明したのと同様の値であることを示唆している。20 我々は以前に酵母で8月8日硫酸限られた進化実験における高親和性硫黄イオントランスポーターSUL1の再発増幅を観察した。10 THI下結果の一貫性を考えるの条件は、我々のシステムの能力をテストするために硫酸制限を選んだ。ケモスタット培養の必須要素は、一定の化学的環境を維持する必要があります。環境における制限栄養素あるいはその他の変化の存在量の変動は、一般的に与えられた培養中の細胞数の変化をもたらす。我々は、平均0.057単位の標準偏差で成長〜15世代後1.12 A600（〜10 9細胞）、または5.1を見つけ、16複写文化を越えて細胞数（ 図2A）、測定再現性のためのプロキシとして光学密度を測定％。比較のために、工業用発酵槽で増殖させた4反復培養から得られた測定値は、2.5％の標準偏差を示した。細胞が成長チャンバでよく混合した：ODおよび排水トラックから取ら細胞数の測定は、培養チューブ（データは示されていない）から直接採取された試料と同等であった。これらの結果は、我々のプラットフォームの堅牢性を実証工業用発酵槽と同様の許容範囲内で一定の化学的環境を維持するために開発能力。 生理学のより敏感な読み出しとして、我々はministatsや工業発酵槽で硫酸制限下で増殖させた培養からゲノムワイドな定常状態の遺伝子発現を比較した。 ministatsにおける遺伝子発現は、生物が複製3（ 図2B）の向こう側に高い類似性を示した。我々は以前にRNAを2つのレプリカSixforsのケモスタットに由来し、マイクロアレイに共同ハイブリダイズし、遺伝子の99％の発現が実証的有意性のカットオフとして1.5Xの使用を可能にする、1.5倍の範囲内であったことを指摘した。21遺伝子発現から3複写ministats、比べペアワイズは、遺伝子の99％が工業用発酵槽からの結果に匹敵する、1.5から1.7倍の範囲内に収まって示した。 3つのサンプルを個々のアレイおよびその後計算の対比にハイブリダイズさせたので、これらのVA梅毒は、潜在的に、公表、共同ハイブリダイズした結果と比較レプリケート間の変動を過大評価、生物学的なノイズに加えて、相互のアレイノイズが含まれています。 138遺伝子は差動で全3 ministatで&gt; 1.5倍発現していたなどの産業用発酵槽で栽培マッチ培養液から採取した試料と比較して複製します。 ministatsの式で減少する遺伝子は重く、鉄代謝のために濃縮した。このシグネチャは、各デバイスのコンフィギュレーションの異なる金属組成を反映している可能性があります。Sixfors装置は、文化に浸金属インペラと通気アセンブリが​​含まれており、以前に使用されたガラス製のメディアはまた、金属のハードウェアを必要とした。 ministatは、ステンレス製の針が、その他の金属部品を採用しています。この協会の生物学的意義は不明であるが発現増加した遺伝子は、主に、細胞膜と関連していた。 最後に、我々は実験的な進化の未定義をテストrは、これらの条件。アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH、 図2C）によって検出された硫酸塩が制限された成長の250世代後に、4つの独立した進化集団からテスト4月4日のクローンはSUL1の増幅を示した。この結果は、類似した時間間隔で大きなボリュームケモスタットでの知見と一致しています10 <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> 培養チャンバーの図 ministat配列の1。A.デザインと配置。B.デザイン 。 <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> 図2 A. Experime文化は成長の10代（n = 16）の内に平衡に達することを示すntalデータ。3生物学のためのBの式のデータが一致した硫酸限らSixforsのケモスタットで成長させ、共通の基準に比べて硫酸塩制限下で定常状態の間にサンプリングS1-3を複製硫酸限定された環境で成長の250世代後ministatsで回収℃ で SUL1増幅 。各進化クローンからのゲノムDNAは、記載されるようなCGHによって先祖のDNAを比較した図21平均コピー数は、各増幅領域について計算された、それぞれのアンプリコンの横に表示されます。すべてのマイクロアレイデータを加盟GSE36691下GEOデータベースに寄託されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

我々が開発し、低コストで容易に入手できる部品から構築ミニチュアケモスタットのフットプリントの小さい配列を検証されています。生理学的および実験的な進化の結果は、大きなボリュームケモスタットに類似していた。 ministatアレイは、従来のケモスタット実験、機能ゲノミクス、化学スクリーニングアプリケーションのため、コンパクトで安価、かつアクセス可能なプラットフォームを提供します。

多重ケモスタットアレイの設計および使用

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

design-and-use-of-multiplexed-chemostat-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K ビュー.  University of Washington. 我々が開発し、低コストで容易に入手できる部品から構築ミニチュアケモスタットのフットプリントの小さい配列を検証されています。生理学的および実験的な進化の結果は、大きなボリュームケモスタットに類似していた。 ministatアレイは、従来のケモスタット実験、機能ゲノミクス、化学スクリーニングアプリケーションのため、コンパクトで安価?...

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays. Robust flow control and precise fluidic volumes are two critical requirements for these applications. We have developed microfluidic chips featuring elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS) microvalve arrays that: 1) need no extra energy source to close the fluidic path, hence the loaded device is highly portable; and 2) allow for microfabricating deep (up to 1 mm) channels with vertical sidewalls and resulting in very precise features.

The PDMS microvalves-based devices consist of three layers: a fluidic layer containing fluidic paths and microchambers of various sizes, a control layer containing the microchannels necessary to actuate the fluidic path with microvalves, and a middle thin PDMS membrane that is bound to the control layer. Fluidic layer and control layers are made by replica molding of PDMS from SU-8 photoresist masters, and the thin PDMS membrane is made by spinning PDMS at specified heights. The control layer is bonded to the thin PDMS membrane after oxygen activation of both, and then assembled with the fluidic layer. The microvalves are closed at rest and can be opened by applying negative pressure (e.g., house vacuum). Microvalve closure and opening are automated via solenoid valves controlled by computer software.

Here, we demonstrate two microvalve-based microfluidic chips for two different applications. The first chip allows for storing and mixing precise sub-nanoliter volumes of aqueous solutions at various mixing ratios. The second chip allows for computer-controlled perfusion of microfluidic cell cultures.

The devices are easy to fabricate and simple to control. Due to the biocompatibility of PDMS, these microchips could have broad applications in miniaturized diagnostic assays as well as basic cell biology studies.

We demonstrate protocols for manufacturing and automating elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS)-based microvalve arrays that need no extra energy to close and feature photolithographically defined precise volumes. A parallel subnanoliter-volume mixer and an integrated microfluidic perfusion system are presented.

エラストマーのマイクロバルブの配列で制御マイクロ流体チップ

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

生物学

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform routine activities, but prosthetic suspensions using traditional socket technology can prove to be cumbersome and uncomfortable for a person with limb loss.  Moreover, for those with high proximal amputations, limited residual limb length may prevent exoprosthesis attachment all together. Osseointegrated implant technology is a novel operative procedure which allows firm skeletal attachment between the host bone and an implant. Preliminary results in European amputees with osseointegrated implants have shown improved clinical outcomes by allowing direct transfer of loads to the bone-implant interface.  Despite the apparent advantages of osseointegration over socket technology, the current rehabilitation procedures require long periods of restrictive load bearing prior which may be reduced with expedited skeletal attachment via electrical stimulation.  The goal of the osseointegrated intelligent implant design (OIID) system is to make the implant part of an electrical system to accelerate skeletal attachment and help prevent periprosthetic infection. To determine optimal electrode size and placement, we initiated proof of concept with computational modeling of the electric fields and current densities that arise during electrical stimulation of amputee residual limbs.  In order to provide insure patient safety, subjects with retrospective computed tomography scans were selected and three dimensional reconstructions were created using customized software programs to ensure anatomical accuracy (Seg3D and SCIRun) in an IRB and HIPAA approved study.  These software packages supported the development of patient specific models and allowed for interactive manipulation of electrode position and size. Preliminary results indicate that electric fields and current densities can be generated at the implant interface to achieve the homogenous electric field distributions   required to induce osteoblast migration, enhance skeletal fixation and may help prevent periprosthetic infections.  Based on the electrode configurations experimented with in the model, an external two band configuration will be advocated in the future.

There is a need to develop alternative prosthesis attachment due to limb loss attributed to vascular occlusive diseases and trauma. The goal of the work is to introduce an osseointegrated intelligent implant design system to increase skeletal fixation and reduce periprosthetic infection rates for patients needing osseointegrated technology.

切断者のためのOsseointegratedインテリジェントインプラント設計システムの生体電気分析

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングDNAからのヌクレオソーム配列の組み立て

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

ショウジョウバエにおける温度嗜好挙動とその概日リズムの設計と解析

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...