Criação do vídeo foi suportado por concessões do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (5P41RR011823-17) e do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (8 P41 GM103533-17) do National Institutes of Health. Este trabalho também foi apoiado pela concessão do NSF 1120425. MJD é uma Rita Allen Foundation Scholar. AWM é apoiado em parte pelo NIH T32 HG00035. Agradecemos a luz do sol Anna de assistência com a melhoria protocolos. Além disso, reconhecemos Sara DiRienzi, Celia Payen, e Amy Sirr como usuários iniciais dos ministats.

Use a técnica estéril adequada durante o protocolo. 1. Montagem de peças e Preparação para a matriz Ministat <ol><li> Ordenar todas as peças. </li><li> Limpar os tubos de vidro. Marcar tubos de 20 ml de volume. </li><li> Fazer montagens de cortiça com ar, a mídia, e as portas de efluentes e colocá-los no topo dos tubos de cultura limpas de vidro. </li><li> Prepare câmaras de umidificação e organizar todas as partes não autoclavados. </li><li> Fazer o ar, efluentes e tubos de mídia usando de tubagens suficientes e acoplamentos compatíveis. </li><li> Conecte cada tipo de tubo (ar, mídia e efluentes) para as assembleias de cortiça e filtros de alumínio e os meios de comunicação de conexão rápida para prepará-los para a autoclave. </li><li> Preparar um garrafão para utilização na fabricação de meio estéril quimiostato. </li><li> Preparar as garrafas de colheita de amostras de cultura através da inserção de uma rolha de borracha de dois furos, com acessórios apropriados. Folha cada filtro para prepará-los para a autoclave. </li><li> Fit da matriz montada perfeitamente em uma ou mais bandejas autoclave e manter todas as partes. </li><li> Faça e filtrar mídia quemostato em garrafões autoclavada. </li></ol> 2. Configurando uma experiência <ol><li> Encha cada frasco de 700 ml hidratação com DDH 2 O. </li><li> Coloque as ministats autoclavados no conjunto do bloco de aquecimento a uma temperatura desejada. </li><li> Coloque as companhias aéreas para o colector de 4 portas e ligar a bomba de ar. </li><li> Ligue as linhas de efluentes para as 100 garrafas de coleta ml. </li><li> Remover a película a partir da extremidade da tubagem de media e media garrafão e ligar o rápido conecta dois. Passe cada pedaço de tubo de bomba através de um cartucho de bomba peristáltica e clique-los no lugar. Ligue a bomba de mídia. </li><li> Vamos encher as câmaras. Desligar a bomba de mídia. </li><li> Pulverizar os conjuntos de cortiça com etanol a 70% e inocular as culturas, utilizando uma seringa. Guardar uma amostra do inoculo como um estoque de glicerol congeladose desejado. Deixe as culturas crescer durante 30 h. </li><li> Ajustar a altura da agulha até que o volume de efluente da cultura é ajustado para 20 ml com o fluxo de ar desligado. Isto pode demorar vários ajustamentos ao longo de uma hora. Quando terminar desligar o fluxo de ar em volta. </li><li> Ligue a bomba de mídia em. </li><li> Esvazie as garrafas de amostragem de efluentes, que contêm mídia coletados durante a definição do volume de cultura de trabalho, e registrar o tempo. </li><li> A ocupar um lugar de medição de tempo zero das linhas de efluentes em tubos de coleta estéreis para 15 min-2 horas (dependendo do que o volume que deseja provar para análise de DNA). Também fazer um estoque de glicerol congelado de cada cultura nesta altura, se desejado. </li></ol> 3. Medidas diárias <ol><li> Tal como acontece com a sua medida de tempo zero, a amostra em gelo durante 15 min-2 h (como requerido para a sua experiência) em gelo e registará o tempo de amostragem para o DNA e as amostras congeladas imagens. </li><li> Para amostras de RNA ou coletar uma pequena volUme usando uma seringa e uma agulha de 22G 5 &quot;a partir da cultura ou uncork cada ministat para colher toda a cultura. amostras devem ser tomados de forma rápida, recolhido por filtração, e imediatamente congelados em azoto líquido. </li><li> Meça o efluente coletado desde a última amostragem para cada ministat quantificar taxa de diluição. Ajustar as taxas de diluição, se necessário reajustando a definição bomba ou ajustar o ajuste fino em linhas individuais da bomba. </li><li> Substitua as linhas de efluentes em garrafas vazias de coleta. </li><li> Quantificar células / ml, bem como outros parâmetros de interesse e fazer um estoque de glicerol congelado. </li></ol> 4. Pós-experimento de Limpeza <ol><li> Coloque todos os tubos em bandejas separadas e enxaguar abundantemente com DDH 2 O. Tubo seco utilizando uma bomba de aquário. </li><li> Limpe as assembleias de cortiça com DDH 2 O e usar inserção de agulha para limpar as agulhas, aspiração e distribuição de água, por sua vez. Passe o exterior das agulhas e de cortiça para remover qualquermídia residuais. </li><li> Limpar o tubo de vidro com água e etanol, e remover os contaminantes físicos com 3 enrolado Kimwipes e fórceps. </li><li> Lavar e secar todas as partes novamente antes da utilização. </li></ol>

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Os autores declaram não ter nenhum conflito de interesse.

Cultivo quemostato nos ministats, como com qualquer quemostato, requer atenção aos detalhes e resolução de problemas. Desde que a contaminação é de grande preocupação em experimentos de cultura contínua, que normalmente olhar através do microscópio para a contaminação bacteriana e fúngica após inoculação ea cada 50 gerações durante experimentos evolução a longo prazo. Até à data, não observamos contaminação através de 96 experiências de evolução superior a 300 gerações (dados não mostrados). Para testar a contaminação cruzada entre ministats e do potencial de micróbios para colonizar a câmara de cultura por meio da linha de efluente 16 que correu ministats tais que cada ministat outro foi inoculado com a levedura como acima, e o restante não foram inoculados com a cultura. As culturas foram recolhidos num recipiente de resíduos urbanos, que foi esvaziado em dias alternados. Assim, se fosse possível para os contaminantes para entrar na linha de efluentes que provavelmente teria observado que neste experiment. Durante três semanas e mais de 100 gerações de crescimento neste padrão quadriculado de células inoculadas e não inoculados não foi observada no crescimento não-inoculados tubos de cultura ministat, sugerindo que a contaminação por fungos ou outros micróbios fora é improvável que ocorra em experimentos de prazos semelhantes. Embora os ministats foram projetados para operar de forma análoga à quimiostatos comerciais, a natureza modular deste arranjo permite a otimização para se ajustar às necessidades dos usuários e orçamento. A bomba peristáltica usada no presente protocolo podem alcançar taxas de fluxo entre 0,0186 vol / vol para 3,6 hr / hr (dados não mostrados). Um maior controlo das taxas de diluição pode ser conseguido com modelos de bombas alternativas. Note-se que a operação a baixas taxas de diluição podem exigir a substituição de uma agulha de maior calibre para atingir a mesma frequência de fornecimento de gotículas. O tamanho da população é uma consideração importante para o projeto adequado de experimentos evolução.A taxa de diluição padrão e concentração de nutrientes utilizada aqui proporciona uma população relativamente grande (~ 10 9 células) da mesma ordem de grandeza que os estudos publicados de evolução. 11 populações maiores ou menores podem ser mantidos, alterando o volume de trabalho, ou limitar a concentração de nutrientes. Fornecimento de mutação aumentada também pode ser obtida através do trabalho com as estirpes com taxas de mutação elevadas. Os ministats também pode ser melhorado com o nosso projeto atual. Por exemplo, a condensação pode acumular nas paredes do tubo de cultura e pode ser muito reduzido por meio de um banho de água profunda, incubadora ou sala de temperatura constante. Embora a aglomeração e crescimento de parede em sulfato de culturas limitadas parece ser relativamente rara, aparecendo em experiências 5/48 evolução por 300 gerações (dados não mostrados), uma variedade de surfactantes estão disponíveis, que podem ajudar a diminuir ou retardar esta característica. No caso em que interfere com a agregação de cultura adequadoagitação, a mistura pode ser aumentada pela redução do número de caminhos de cada bomba de ar é dividido, ou pela adição de um aparelho de agitação. Sondas adicionais para a concentração de gás dissolvido, o pH, ou outros parâmetros podem também ser incluídos, tal como em alguns modelos de outros 17. Apesar de possíveis modificações, usando os ministats como descritas neste protocolo, observou-se altamente consistentes parâmetros experimentais e resultados reproduzíveis quando se compara o nosso dispositivo com dados relatados para quimiostatos maior volume comerciais. Isto incluiu a reprodutibilidade da fisiologia celular, como visto através do alcance de estado estável de equilíbrio dentro de 10-15 gerações (Figura 2A) e a obtenção de densidades semelhantes de cultura no estado de equilíbrio. Padrões de expressão de genes foram consistentes em três repetições em ministats biológica e entre ministats e comerciais de grande volume plataformas (Figura 2B), com a excepção de genes do metabolismo do ferro. Estes expression diferenças são provavelmente causado por alterações no teor de metais dos dois dispositivos ou melhorias na qualidade dos ingredientes de mídia. Os nossos dados sugerem que ministats serão úteis para a fisiologia ou a concorrência experiências onde um ambiente consistente é necessária. Para testar se o desenho ministat é suficiente para aplicações de evolução experimental que evoluíram culturas sob limitação de sulfato durante 250 gerações e CGH utilizado para caracterizar a amplificação no locus SUL1 -. Uma característica fundamental da evolução a longo prazo sob estas condições em quimiostatos maior volume 10 Observou amplificação de clones de SUL1 em 4/4 experiências independentes em evolução sulfato limitados meios de comunicação (Figura 2C). Tomado como um todo, estes dados sugerem que são ministats uma plataforma sólida que pode ser útil para uma variedade de aplicações quimiostato tradicionais. Embora demonstrado sua utilização na cultura de levedura de brotamento, as ministats devetambém ser compatível com outros organismos e projetos similares foram efectivamente utilizadas para cultura de bactérias e leveduras outros. 16,17,25 Além disso, o menor volume de cultura e correlacionados diminuição da necessidade de mídia pode fazer ministats uma alternativa atraente para experimentos que requerem caros ou exóticos Os reagentes, como pode ser o caso em química ou telas genéticos.

A dinâmica do crescimento microbiano e evolução são fundamentais para a microbiologia, ecologia, genética e biotecnologia. O método mais comum é a cultura de micróbios em lotes, onde as células são inoculadas a uma densidade baixa em caldo rico em nutrientes e cultivadas até à saturação. Embora simples de realizar utilizando equipamento de laboratório padrão, culturas em lote experimentar um ambiente químico flutuante e, correspondentemente, alterar a fisiologia celular. Este ambiente de crescimento heterogêneo pode resultar em efeitos secundários de crescimento e estresse que podem mascarar sutis diferenças fisiológicas. Evolução experimental por transferência lote de série pode selecionar para misturas complexas de crescimento fase subpopulações específicas, dificultando tentativas de conexão adaptações às condições específicas do seletivos. Medição de fenótipos quantitativos pode ser difícil devido ao ruído do tempo de coleta imprecisa e variação em características como tempo de atraso. Culturas contínuas fornecer uma alternativaregime de crescimento, onde as células podem ser cultivadas de forma reprodutível num ambiente quimicamente homogéneo com uma taxa de crescimento definidos para chegar a um estado fisiológico constante. Devido a estas vantagens, os estudos sobre evolução experimental e caracterização do estado celular utilizam frequentemente o ambiente controlado de culturas contínuas como o quimiostato 14. Apreciação destas vantagens levou a um ressurgimento do interesse nas culturas quimiostato. 15 Desde a sua introdução em 1950, 1,2 quimiostato sistemas têm sido desenvolvidos para a função de uma variedade de escalas que vão de litros de microlitros e para uma variedade de aplicações 16. -19 Estes projetos diversos, que variam de biorreatores produzidos comercialmente para navios glassblown para plataformas personalizadas microfluídica, partes princípios gerais de design. A câmara de cultura é agitada e arejada (normalmente, fazendo borbulhar ar através dele) e os micróbios neles contidos são mantidos homogéneosly dispersas por toda a câmara de cultura em todos os momentos. Meio fresco de composição definido é adicionado continuamente e a velocidade de adição controla a taxa de crescimento e influencia o ambiente químico experimentado pela cultura. Um estouro define o volume de cultura no tubo de crescimento, e através desta o transbordamento cultura serão amostrados na mesma taxa em que entra no meio fresco. Desta forma, as culturas rapidamente chegar a um estado fisiológico estável em que muitos parâmetros biológicos permanecem constantes. Apesar das vantagens do quimiostatos e relatórios destas plataformas diferentes na literatura, a adoção generalizada tem sido limitada por dificuldades de construção e operação desses sistemas, e altos custos associados às opções comerciais. Além disso descrições de como fazer e utilizar estes dispositivos podem ser opacos. Apresentamos projetos e instruções para uso de uma matriz de pequenas dimensões de quimiostatos miniatura construídas a partir de partes prontamente disponíveis a baixo custo. Nós obsErve altamente consistentes parâmetros experimentais e resultados reproduzíveis quando se compara o nosso dispositivo com dados relatados para leveduras cultivadas em biorreatores maior volume comerciais. Isto inclui a reprodutibilidade da fisiologia celular, como visto através do alcance de estado estável de equilíbrio dentro de 10-15 gerações e obtenção de densidades semelhantes de cultura no estado de equilíbrio. Além disso, os padrões de expressão de genes são consistentes entre ministats e uma plataforma de maior volume comercial. Estabilidade da taxa de diluição, a densidade óptica e da reprodutibilidade da expressão do gene entre as três culturas replicadas demonstrar a robustez da nossa plataforma. Mostramos também que as mesmas mutações adaptativas surgir ao longo prazos semelhantes evolução experimental como com quimiostatos de maior volume.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> 3/32 tubing &quot;x 7/32&quot; de silicone </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Tobogã: Ordem: (50 &#39;pacote de bobina) </td></tr><tr><td> Tubagem de 1/2 &quot;x 5/8&quot; de silicone (muito grande) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Tobogã: Ordem: (50 &#39;pacote de bobina) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; de tubagem de silicone (meio) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Tobogã: Ordem: (50 &#39;pacote de bobina) </td></tr><tr><td> Laranja verde tubulação de bomba Marprene </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Tobogã: Order: 6x (pacote de 6) </td></tr><tr><td> Luer fêmea, 1/8 barbela &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> : Ordem: 4x (pacote de 25) </td></tr><tr><td> Luer lock macho, 1/8 barbela &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> : Ordem: 1x (pacote de 25) </td></tr><tr><td> Reduzindo conector, PVDF, 1/4 &quot;a 1/8&quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30703-50 </td><td> : Ordem: 1x (pacote de 10) </td></tr><tr><td> Farpado conector Y, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> : Ordem: 3x (pacote de 10) </td></tr><tr><td> Médio braçadeiras de tubulação </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Grampos: Ordem: 1x (pacote de 12) </td></tr><tr><td> Dia Pinchcock (braçadeira de metal para tubos) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Grampos: Ordem: 1x (pacote de 10) </td></tr><tr><td> Linha masculina valvulados rápida conector, Fits tubulação: 1/4 pol </td><td> Pescador </td><td> 05-112-39 </td><td> : Ordem: 1x (pacote de 25) </td></tr><tr><td> Linha feminina valvulados conector rápido, Fits tubulação: 1/4 pol ID, Polipropileno </td><td> Pescador </td><td> 05-112-37 </td><td> : Ordem: 1x (pack de 5) </td></tr><tr><td> Silenciosas Bombas de ar </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Aquário Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Air Supply: Ordem: 4 bombas </td></tr><tr><td> Filtros de PTFE, de 0,45 um, para a filtração do ar </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Air Supply: Ordem: 1x (caixa com 100) </td></tr><tr><td> Flask 1L com arma </td><td> Pescador </td><td> 10-181F </td><td> Air Supply: Ordem: 2x (Pack of 6) </td></tr><tr><td> º 8 rolha de silicone, 3/8 no buraco, para garrafas sidearm </td><td> Pescador </td><td> K953715-0801 </td><td> Air Supply: Ordem: 8 rolhas </td></tr><tr><td> 4 Porta-colector </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Air Supply: Ordem: 8 manifolds </td></tr><tr><td> 55 ml de parafuso cultura tubos com tampas de </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Câmara cultura: Ordem: 2x (pacote de 48) </td></tr><tr><td> Regular hipodérmica agulha branca hub, 16G, 5 polegadas de comprimento para linha de efluentes </td&gt; <td> Pescador </td><td> 14-817-105 </td><td> Câmara cultura: Ordem: 1x (pacote de 100) </td></tr><tr><td> Agulha de punção lombar </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Câmara cultura: Ordem: 4x (pacote de 10) </td></tr><tr><td> Agulha hipodérmica regular rosa </td><td> Pescador </td><td> 14-817-104 </td><td> Câmara cultura: Ordem: 1x (pacote de 100) </td></tr><tr><td> Espuma de silicone rolha tamanho &quot;2&quot;, rosa </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Câmara cultura: Ordem: 2x (pacote de 20) </td></tr><tr><td> 8-Bem rack tubo </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Câmara cultura: Ordem: 4 racks </td></tr><tr><td> Garrafa Reservatório 10L com mangueira de saída inferior: seguro de vácuo </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Mídia: Ordem: 2 ou mais </td></tr><tr><td> Rolha de silicone amarelo espuma, não-padrão tamanho 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Mídia: Ordem: 2 ou mais </td></tr><tr><td> Garrafão Ventilação Filtro </td><td> Pescador </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Media: Pedidos: 1x (pacote de 10) </td></tr><tr><td> Fita isolante, verde </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10.851-BA-10 </td><td> Media: Ordem 1 rolo. </td></tr><tr><td> Filtro frasco superior, 1L, 0,2 mM, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Media: ordem: (1 caso de 12) </td></tr><tr><td> 5000 frasco reservatório ml com descarga de fundo: vacuhum seguro </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Mídia: (Opcional) </td></tr><tr><td> Rolha de silicone azul Espuma, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Mídia: (Opcional) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 bomba de cartucho </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Mídia Bomba: Ordem: 1 </td></tr><tr><td> De 16 canais 205CA cabeça da bomba de extensão </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Mídia Bomba: Ordem: 2 cabeças de bomba de extensão </td></tr><tr><td> Silicone selante aquário </td><td> Pescador </td><td> S18180B </td><td> Mídia Bomba: Ordem: 1 </td></tr><tr><td> 6-bloco banho seco </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Ordem: 2 para 32 ministats ou um para 16. </td></tr><tr><td> Bloco para drybath, 6 tubo de ensaio x 25 mm por bloco </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Ordem: 12 para 32 ministats ou 6 para 16. </td></tr><tr><td> Filtros de membrana de nylon, Tamanho 0,45 mM poros; Dia: 25 mm. </td><td> Pescador </td><td> R04SP02500 </td><td> Colheita: Ordem: 1x (pacote de 100) (opcional) </td></tr><tr><td> Filtros de membrana de nylon, 0,45 uM Pore Size 45 milímetros; </td><td> Pescador </td><td> R04SP04700 </td><td> Colheita: Ordem: 1x (pacote de 100) (opcional) </td></tr><tr><td> 47 mm, aparelho de filtro grande </td><td> Pescador </td><td> Xx10 047 30 </td><td> Colheita: Ordem: 1 (opcional) </td></tr><tr><td> Glass suporte do filtro, 25 mm, o aparelho de filtro pequeno </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Colheita: Ordem: 1 (opcional) </td></tr><tr><td> Dewar frasco, 1L de nitrogênio líquido </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Colheita: Ordem: 1 (opcional) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Quimiostatos são sistemas de cultura contínua em que as células são cultivadas num ambiente bem controlado, quimicamente constante onde a densidade da cultura é limitada pela limitação de nutrientes específicos. 1,2 Dados do quimiostatos são altamente reprodutível para a medição de fenótipos quantitativos uma vez que proporcionam uma taxa de crescimento constante e meio ambiente no estado estacionário. Por estas razões, quimiostatos se tornaram ferramentas úteis para a caracterização de fina escala da fisiologia através da análise da expressão do gene da 3-6, e outras características de culturas de equilíbrio de estado estacionário. Sete experiências a longo prazo em quimiostatos pode destacar trajectórias específicas que as populações microbianas adoptarem durante a evolução adaptativa no ambiente controlado. Na verdade, quimiostatos têm sido utilizados para a evolução experimental desde a sua invenção. 8 Um resultado comum em experimentos de evolução é para cada réplica biológica para adquirir um repertório único de mutações. 9-13 Essa diversidade sugere que há ainda muito a ser descoberto por realizar experimentos evolução, com rendimento muito maior. Nós apresentamos aqui o projeto e operação de uma matriz relativamente simples, de baixo custo de quimiostatos-ou-em miniatura ministats e validar seu uso na determinação de fisiologia e evolução em experimentos com leveduras. Esta abordagem implica crescimento de dezenas de quimiostatos correr um único multiplexados bomba peristáltica. As culturas são mantidas a um volume de trabalho de 20 ml, o que é prático para uma variedade de aplicações. A nossa esperança é que aumentando a produção, diminuindo despesas e prestação de edifício e instruções detalhadas de operação pode também motivar a investigação e aplicação industrial deste projeto como uma plataforma geral para caracterizar funcionalmente um grande número de cepas, espécies, e parâmetros de crescimento, bem como genética ou bibliotecas de medicamentos.

A matriz ministat descrito acima e na (Figura 1A, B) foi utilizado para a cultura de uma estirpe haplóide MATa laboratório de fermento de brotamento (S288c) sob condições limitantes de sulfato, tal como descrito previamente 10. Testamos a eficácia para aplicações quimiostato comuns, incluindo a determinação da fisiologia e evolução experimental. Para validar os ministats, repetiu-se várias experiências anteriormente realizadas em fermentadores industriais modificados para utilização quimiostato. Sixfors 10,20,21 fermentadores ATR foram corridas a um volume de trabalho de 300 ml, mais de 10 vezes o volume dos ministats, e têm modos consideravelmente diferentes cultura de aeração e agitação. Buscou-se replicar estabilidade equipamento, fisiologia estado estacionário, os resultados experimentais de evolução, e padrões de expressão de genes obtidos com esses fermentadores. Desde uniformidade da taxa de diluição e aeração são aspectos importantes do projeto quemostato, que measured a taxa de diluição real em 32 ministats após 15 gerações de crescimento e descobriu que, com uma taxa de diluição de 0,17 alvo vol / hr (4-5 gotas / min) que atingiu uma taxa de diluição média de 0,17208 com um desvio padrão de 0,0075 entre 32 repetições. Esta gama foi no nosso tolerância típico de + / -0,01 diferença vol / hr a partir da configuração de alvo, para além do qual grandes alterações na expressão de genes têm sido observadas. 22-23 Através 4 ministats a taxa de fluxo de ar foi determinado como sendo 307,5 ​​ml / min, com um desvio padrão de 9,57 ml / min. Isto sugere que o fluxo de ar para dentro das câmaras é robusto e igualmente dividida entre os quatro câmaras e é um valor semelhante ao descrito para o arejamento em fermentadores industriais 20. Nós já observado amplificação recorrente do SUL1 transportador de alta afinidade de enxofre-ion em 8/8 experimentos sulfato limitados evolução em leveduras. 10 Dada a consistência dos resultados sob thicondição s escolhemos sulfato de limitação para testar a capacidade do nosso sistema. Um elemento necessário de cultura quimiostato é a necessidade de manter um ambiente químico constante. Flutuações na abundância de uma mudança de limitação de nutrientes ou outras no ambiente tipicamente resultar numa mudança do número de células numa dada cultura. Medimos a densidade óptica, como um proxy para o número de células (Figura 2A) e da reprodutibilidade medido em 16 culturas replicadas, encontrar uma A600 média de 1,12 (~ 10 9 células) após aproximadamente 15 gerações de crescimento, com um desvio padrão de 0,057 unidades, ou 5,1 %. Para comparação, as medições efectuadas a partir de 4 culturas replicadas cultivadas nos fermentadores industriais mostrou um desvio padrão de 2,5%. As células foram bem misturadas na câmara de crescimento: As medições de OD e contagem de células extraídos da pista de efluente foram equivalentes às amostras colhidas directamente a partir do tubo de cultura (dados não mostrados). Estes resultados demonstram a robustez da nossa plataforma de umd capacidade de manter um ambiente químico constante dentro de uma tolerância semelhante ao fermentador industrial. Como uma leitura mais sensível da fisiologia, comparamos genome-wide expressão do gene de estado estacionário a partir de culturas cultivadas em sulfato de limitação nas ministats e no fermentador industrial. A expressão do gene nas ministats mostrou um elevado grau de semelhança entre três réplicas biológicas (Figura 2B). Nós anteriormente notado que, para o RNA derivado de duas réplicas quimiostatos Sixfors e co-hibridada com um microarray, expressão de 99% dos genes caiu dentro de um intervalo de 1,5 vezes, o que permite a utilização de 1,5 X como um nível de significância empírica. 21 expressão do gene a partir de ministats três replicados, em comparação aos pares, mostraram 99% de genes caiu dentro de um intervalo 1,5-1,7 vezes, comparável aos resultados dos fermentadores industriais. As três amostras foram hibridizados com matrizes individuais e os rácios calculados emparelhadas depois, portanto, estes values incluem matriz inter-ruído para além do ruído biológico, potencialmente sobrestimar a variação entre réplicas em comparação com os publicados, co-hibridizados resultados. 138 genes foram diferencialmente expressos&gt; 1,5 vezes em todos ministat três repetições, em comparação com uma amostra colhida de uma cultura correspondente crescido no fermentador industrial. Genes diminuição na expressão dos ministats foram fortemente enriquecido para o metabolismo do ferro. Esta assinatura pode reflectir a composição do metal diferente de cada configuração do dispositivo: o aparelho Sixfors inclui um rotor de metal e montagem de arejamento submerso na cultura, e os meios de comunicação garrafões utilizado anteriormente também necessário hardware metal. O ministat utiliza agulhas de aço inoxidável, mas nenhum componente de metal. Os genes com expressão aumentada foram amplamente associados a membranas celulares, embora o significado biológico desta associação não é claro. Finalmente, testou-se a evolução experimental under estas condições. Após 250 gerações de sulfato de crescimento limitado, 4 quartos clones testados a partir de 4 populações independentes mostraram amplificação da evolução SUL1 como detectado pela matriz hibridação genómica comparativa (CGH, a Figura 2C). Este resultado é consistente com os achados quimiostatos maior volume em intervalos de tempo semelhantes. 10 <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Figura 1. A. Desenho e arranjo da matriz ministat. B. Desenho da câmara de cultura. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figura 2. A. experimental dados que mostram que as culturas atingem o equilíbrio dentro de 10 gerações de crescimento (n = 16). B. Expressão de dados para três réplicas biológicas S1-3 amostrada durante o estado estacionário sob sulfato de limitação em relação a uma referência comum cultivadas em correspondência quimiostato Sixfors sulfato limitada amplificações. C. SUL1 recuperado em ministats após 250 gerações de crescimento em um ambiente de sulfato limitado. O ADN genómico de cada um dos clones foi comparada com a evolução do DNA ancestral CGH como descrito por 21. Média do número de cópias calculado para cada região amplificada e é mostrado ao lado de cada fragmento amplificado. Todos os dados de microarranjos são depositados no banco de dados GEO sob adesão GSE36691. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura.</a>

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Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Temos desenvolvido e validado um conjunto de pequenas dimensões de quimiostatos em miniatura construído a partir de partes prontamente disponíveis para baixo custo. Resultados evolução fisiológica e experimental foram semelhantes aos quimiostatos de maior volume. A matriz ministat fornece uma plataforma compacta, barata e acessível para experimentos quemostato tradicionais, a genômica funcional e aplicações de rastreamento de produtos químicos.

Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

design-and-use-of-multiplexed-chemostat-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K visualizações.  University of Washington. Temos desenvolvido e validado um conjunto de pequenas dimensões de quimiostatos em miniatura construído a partir de partes prontamente disponíveis para baixo custo. Resultados evolução fisiológica e experimental foram semelhantes aos quimiostatos de maior volume. A matriz ministat fornece uma plataforma compacta, barata e acessível para experimentos quemostato tradicionais, a genômica funcional e aplicações de rastreamento de produtos químicos.

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays. Robust flow control and precise fluidic volumes are two critical requirements for these applications. We have developed microfluidic chips featuring elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS) microvalve arrays that: 1) need no extra energy source to close the fluidic path, hence the loaded device is highly portable; and 2) allow for microfabricating deep (up to 1 mm) channels with vertical sidewalls and resulting in very precise features.

The PDMS microvalves-based devices consist of three layers: a fluidic layer containing fluidic paths and microchambers of various sizes, a control layer containing the microchannels necessary to actuate the fluidic path with microvalves, and a middle thin PDMS membrane that is bound to the control layer. Fluidic layer and control layers are made by replica molding of PDMS from SU-8 photoresist masters, and the thin PDMS membrane is made by spinning PDMS at specified heights. The control layer is bonded to the thin PDMS membrane after oxygen activation of both, and then assembled with the fluidic layer. The microvalves are closed at rest and can be opened by applying negative pressure (e.g., house vacuum). Microvalve closure and opening are automated via solenoid valves controlled by computer software.

Here, we demonstrate two microvalve-based microfluidic chips for two different applications. The first chip allows for storing and mixing precise sub-nanoliter volumes of aqueous solutions at various mixing ratios. The second chip allows for computer-controlled perfusion of microfluidic cell cultures.

The devices are easy to fabricate and simple to control. Due to the biocompatibility of PDMS, these microchips could have broad applications in miniaturized diagnostic assays as well as basic cell biology studies.

We demonstrate protocols for manufacturing and automating elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS)-based microvalve arrays that need no extra energy to close and feature photolithographically defined precise volumes. A parallel subnanoliter-volume mixer and an integrated microfluidic perfusion system are presented.

Chips microfluídicos controlados com Arrays microválvula elastoméricos

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Biologia

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform routine activities, but prosthetic suspensions using traditional socket technology can prove to be cumbersome and uncomfortable for a person with limb loss.  Moreover, for those with high proximal amputations, limited residual limb length may prevent exoprosthesis attachment all together. Osseointegrated implant technology is a novel operative procedure which allows firm skeletal attachment between the host bone and an implant. Preliminary results in European amputees with osseointegrated implants have shown improved clinical outcomes by allowing direct transfer of loads to the bone-implant interface.  Despite the apparent advantages of osseointegration over socket technology, the current rehabilitation procedures require long periods of restrictive load bearing prior which may be reduced with expedited skeletal attachment via electrical stimulation.  The goal of the osseointegrated intelligent implant design (OIID) system is to make the implant part of an electrical system to accelerate skeletal attachment and help prevent periprosthetic infection. To determine optimal electrode size and placement, we initiated proof of concept with computational modeling of the electric fields and current densities that arise during electrical stimulation of amputee residual limbs.  In order to provide insure patient safety, subjects with retrospective computed tomography scans were selected and three dimensional reconstructions were created using customized software programs to ensure anatomical accuracy (Seg3D and SCIRun) in an IRB and HIPAA approved study.  These software packages supported the development of patient specific models and allowed for interactive manipulation of electrode position and size. Preliminary results indicate that electric fields and current densities can be generated at the implant interface to achieve the homogenous electric field distributions   required to induce osteoblast migration, enhance skeletal fixation and may help prevent periprosthetic infections.  Based on the electrode configurations experimented with in the model, an external two band configuration will be advocated in the future.

There is a need to develop alternative prosthesis attachment due to limb loss attributed to vascular occlusive diseases and trauma. The goal of the work is to introduce an osseointegrated intelligent implant design system to increase skeletal fixation and reduce periprosthetic infection rates for patients needing osseointegrated technology.

Análises bioelétrica de um Sistema de Design Inteligente osseointegrados Implant para Amputados

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...