Création de la vidéo a été soutenue par des subventions du National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) et l&#39;Institut national des sciences médicales générales (8 P41 GM103533-17) du National Institutes of Health. Ce travail a également été soutenu par la NSF subvention 1120425. MJD est une Fondation Rita Allen Scholar. MN est soutenu en partie par le NIH T32 HG00035. Nous remercions Anna soleil de l&#39;aide pour l&#39;amélioration des protocoles. En outre, nous reconnaissons Sara DiRienzi, Celia Payen, et Amy Sirr que les premiers utilisateurs des Ministats.

Utiliser une technique stérile appropriée tout au long du protocole. 1. Assemblage de pièces et la préparation de la baie Ministat <ol><li> Commander toutes les pièces. </li><li> Nettoyer les tubes de verre. Marquez les tubes à 20 ml de volume. </li><li> S&#39;assurer que les assemblées de liège avec de l&#39;air, les médias, et les ports d&#39;effluents et de les placer en haut des tubes de culture en verre nettoyés. </li><li> Préparer chambres d&#39;humidification et d&#39;organiser toutes les parties non-autoclavés. </li><li> Assurez-air, des effluents, des médias et des tubes en utilisant des longueurs de tubes suffisantes et compatibles accouplements. </li><li> Connectez chaque type de tuyauterie (air, des médias et des effluents) aux assemblées de liège et des filtres bandes et les médias raccord rapide pour les préparer à l&#39;autoclave. </li><li> Préparer une bonbonne pour la fabrication de support chémostat stérile. </li><li> Préparer les bouteilles de prélèvement de la culture en insérant un bouchon de caoutchouc à deux trous avec des raccords appropriés. Feuille chaque filtre pour les préparer à l&#39;autoclave. </li><li> Fit l&#39;ensemble monté facilement dans un ou plusieurs plateaux autoclave et toutes les parties. </li><li> Marque et filtrer les médias chémostat en bonbonnes autoclave. </li></ol> 2. Configuration d&#39;un test <ol><li> Remplir chaque flacon hydratation avec 700 ml ddH O. 2 </li><li> Placer les Ministats autoclave dans l&#39;ensemble de blocs de chauffage à la température désirée. </li><li> Placez les compagnies aériennes dans le collecteur 4-port et tourner sur la pompe à air. </li><li> Raccorder les conduites d&#39;effluents dans les bouteilles de 100 ml de collecte. </li><li> Retirez le film de l&#39;extrémité du tube médias et tourie médias et connectez le rapide de deux connecte. Enfilez chaque longueur de tuyau de la pompe à travers une cartouche pompe péristaltique et s&#39;enclencher. Mettre la pompe de médias. </li><li> Les chambres à combler. Arrêter la pompe médias. </li><li> Vaporiser les assemblages en liège avec 70% d&#39;éthanol et ensemencer les cultures à l&#39;aide d&#39;une seringue. Sauvegarder un échantillon de l&#39;inoculum comme un stock de glycérol congeléssi on le désire. Laissez croître les cultures pendant 30 heures. </li><li> Réglez la hauteur de l&#39;aiguille des effluents jusqu&#39;à ce que le volume de culture est réglé à 20 ml avec le flux d&#39;air éteint. Cela peut prendre plusieurs ajustements au cours d&#39;une heure. Lorsque vous avez terminé transformer le flux d&#39;air en marche. </li><li> Tourner la pompe sur les médias. </li><li> Vider les bouteilles d&#39;échantillonnage des effluents qui contiennent des médias recueillies pendant le réglage du volume de culture de travail, et enregistrer le temps. </li><li> Pour prendre un point de mesure au temps zéro les lignes d&#39;effluents dans les tubes de prélèvement stériles pour 15 min-2 h (en fonction de ce volume que vous souhaitez goûter à l&#39;analyse génétique). Également faire un stock de glycerol congelé pour chaque culture à ce moment si désiré. </li></ol> 3. Les mesures quotidiennes <ol><li> Comme votre temps zéro de mesure, d&#39;échantillonnage sur la glace pendant 15 min-2 h (selon les besoins de votre expérience) sur la glace et enregistrer le temps échantillonné pour l&#39;ADN et des échantillons de mères congelées. </li><li> Pour recueillir des échantillons d&#39;ARN soit un petit volUme aide d&#39;une seringue et 22G 5 &quot;aiguille de la culture ou de déboucher chaque ministat de récolter toute la culture. échantillons doivent être prélevés rapidement, recueilli par filtration, et immédiatement congelés dans de l&#39;azote liquide. </li><li> Mesurer l&#39;eau résiduaire collectée depuis le dernier échantillonnage pour chaque ministat de quantifier le taux de dilution. Ajuster les taux si nécessaire, par le réajustement du réglage de la pompe ou le réglage du réglage fin sur des lignes individuelles de la pompe. </li><li> Remplacer les lignes d&#39;effluents dans des bouteilles vides de collecte. </li><li> Quantifier cellules / ml ainsi que d&#39;autres paramètres d&#39;intérêt et de faire un stock de glycerol congelé. </li></ol> 4. Post-expérience de nettoyage <ol><li> Placer tous les tubes dans des bacs séparés et rincer abondamment à l&#39;ddH 2 O. Tube sec à l&#39;aide d&#39;une pompe d&#39;aquarium. </li><li> Nettoyez les assemblages en liège avec ddH 2 O et utiliser insert d&#39;aiguille pour nettoyer les aiguilles, aspirer et distribuer de l&#39;eau à son tour. Essuyez l&#39;extérieur de l&#39;aiguille et du liège pour éliminer toutemédias résiduels. </li><li> Nettoyer le tube de verre avec de l&#39;eau et de l&#39;éthanol, et éliminer les contaminants physiques avec 3 en boule Kimwipes et des pinces. </li><li> Rincer et sécher toutes les pièces avant de les utiliser à nouveau. </li></ol>

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Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêt.

Culture chemostat dans les Ministats, comme avec n&#39;importe quel chémostat, exige de la minutie et le dépannage. Depuis la contamination est très préoccupante dans les expériences de culture continue, nous recherchent généralement via microscope pour la contamination bactérienne et fongique après inoculation et tous les 50 générations lors des expériences évolution à long terme. À ce jour, nous n&#39;avons pas observé de contamination dans 96 expériences évolution de plus de 300 générations (données non présentées). Pour tester la contamination croisée entre les Ministats et le potentiel pour les microbes de coloniser la chambre de culture par le biais de la ligne d&#39;effluent nous avons couru 16 Ministats telles que chaque ministat autre a été inoculé avec de la levure comme ci-dessus et le reste n&#39;ont pas été inoculés avec une culture. Les cultures ont été prélevés dans un conteneur à déchets communaux, qui a été vidé tous les deux jours. Ainsi, s&#39;il était possible pour les contaminants de pénétrer à travers la ligne d&#39;effluent que nous aurions probablement observé que dans cette expériment. Pendant trois semaines et plus de 100 générations de la croissance de ce motif en damier de cultures inoculées et non inoculées, nous n&#39;avons pas observé la croissance non inoculés tubes de culture MINISTAT, ce qui suggère que la contamination de la levure à l&#39;extérieur ou d&#39;autres microbes est peu probable de se produire dans des expériences de des délais similaires. Bien que les Ministats ont été conçus pour fonctionner dans un mode analogue à chemostats commerciaux, la nature modulaire de cet arrangement permet une optimisation en fonction des besoins des utilisateurs et du budget. La pompe péristaltique utilisée dans le présent protocole peut atteindre des débits compris entre 0,0186 vol / h à 3,6 vol / h (données non présentées). Un contrôle accru des taux de dilution peut être réalisée avec les modèles de pompe de rechange. Noter que le fonctionnement à taux de dilution inférieur peut exiger la substitution d&#39;une aiguille de calibre supérieur pour obtenir la même fréquence de réception de gouttelettes. Taille de la population est un facteur important pour une bonne conception des expériences d&#39;évolution.Le taux de dilution standard et la concentration nutritive utilisée ici fournit une taille de population relativement importante (~ 10 9 cellules) du même ordre de grandeur que les études publiées évolution. 11 populations plus petites ou plus pourrait être maintenue en changeant le volume de travail ou de limiter la concentration en nutriments. Alimentation mutation accrue pourrait également être obtenus en travaillant avec des souches avec des taux de mutation élevés. Les Ministats pourrait également être améliorée au cours de notre conception actuelle. Pour la condensation par exemple peuvent se déposer sur les parois des tubes de culture et peut être considérablement réduite en utilisant une profonde bain-marie, un incubateur ou une chambre à température constante. Bien que l&#39;agglutination et la croissance mur de sulfate de cultures limitées semble être relativement rare, apparaissant dans des expériences évolution 5/48 par 300 générations (données non présentées), une variété de tensioactifs sont disponibles qui peuvent aider à diminuer ou retarder cette caractéristique. Dans le cas où agglutination interfère avec la culture adéquatle mélange, sous agitation accrue peut être obtenue en réduisant le nombre de voies de chaque pompe à air est divisée, ou en ajoutant un dispositif d&#39;agitation. Sondes supplémentaires pour la concentration en gaz dissous, le pH ou d&#39;autres paramètres peuvent également être inclus, comme dans quelques autres conceptions 17. Malgré les modifications possibles, en utilisant les Ministats telles que décrites dans ce protocole, nous avons observé très uniformes paramètres expérimentaux et des résultats reproductibles lorsque l&#39;on compare notre dispositif aux données déclarées pour chemostats grand volume commerciales. Cela comprenait la reproductibilité de la physiologie cellulaire comme on le voit par atteindre l&#39;état stationnaire d&#39;équilibre dans les 10-15 générations (figure 2A) et d&#39;obtenir des densités de culture similaires à l&#39;équilibre. Profils d&#39;expression génique sont compatibles entre trois biologique réplique dans Ministats et entre Ministats et commerciaux à grand volume de plates-formes (figure 2B), à l&#39;exception des gènes du métabolisme du fer. Ces expression différences sont probablement causés par des changements dans la teneur en métaux des deux dispositifs ou d&#39;améliorations dans la qualité des ingrédients médias. Nos données suggèrent que Ministats sera utile pour les expériences de physiologie ou de la compétition où un environnement cohérent est nécessaire. Pour tester si la conception ministat est suffisante pour des applications expérimentales évolution nous évolué cultures sous limitation de sulfate pour 250 générations et utilisé pour caractériser CGH amplification au niveau du locus sul1 -. Marque distinctive de l&#39;évolution à long terme dans ces conditions dans chemostats grand volume 10 Nous observée amplification de sul1 dans les clones de 04.04 expériences évolution indépendants en sulfate limitées médias (figure 2C). Pris dans leur ensemble, ces données suggèrent que Ministats sont une plate-forme robuste qui peut être utile pour une variété d&#39;applications chémostat traditionnels. Bien que nous ont manifesté leur utilisation dans la culture de levure bourgeonnante, les Ministats devraitégalement être compatible avec d&#39;autres organismes et des conceptions similaires ont en fait été utilisé pour la culture des bactéries et d&#39;autres espèces de levures. 16,17,25 En outre, le plus petit volume de la culture et de corrélation réduction du besoin de médias peuvent apporter Ministats une alternative intéressante pour des expériences nécessitant coûteux ou exotiques réactifs comme cela peut être le cas dans l&#39;industrie chimique ou cribles génétiques.

La dynamique de la croissance microbienne et l&#39;évolution sont essentiels à la microbiologie, l&#39;écologie, la génétique et la biotechnologie. La méthode la plus commune de microbes culture est en mode batch, où les cellules sont ensemencées à faible densité en éléments nutritifs riches en bouillon et cultivées jusqu&#39;à saturation. Bien que simple à réaliser en utilisant du matériel de laboratoire standard, des cultures en lots l&#39;expérience d&#39;un environnement chimique fluctuante et modification correspondante de la physiologie cellulaire. Cet environnement de croissance hétérogène peut entraîner des effets sur la croissance et le stress secondaires qui peuvent masquer des différences subtiles physiologiques. Évolution expérimentale par transfert par lots de série permet de sélectionner des mélanges complexes de croissance en phase sous-populations spécifiques, ce qui complique les tentatives de connexion des adaptations à des conditions sélectives. Mesure des phénotypes quantitatifs peut être difficile à cause du bruit de synchronisation des échantillons imprécis et variation des caractéristiques telles que le temps de latence. Cultures continues de fournir une alternativerégime de croissance, où les cellules peuvent être cultivées de façon reproductible dans un milieu chimiquement homogène à une vitesse de croissance définies pour atteindre un état physiologique régulier. En raison de ces avantages, les études d&#39;évolution expérimentale et la caractérisation de l&#39;état cellulaire utilisent souvent l&#39;environnement contrôlé des cultures en continu comme le chemostat 14. L&#39;appréciation de ces avantages a conduit à un regain d&#39;intérêt pour les cultures en chémostat 15. Depuis leur introduction en 1950, 1,2 en chémostat systèmes ont été développés pour fonctionner sur une variété d&#39;échelles allant de litres d&#39;microlitres et pour une variété d&#39;applications 16. -19 Ces différents modèles, qui vont de bioréacteurs produits dans le commerce pour les navires à glassblown personnalisés plateformes microfluidiques, la part de principes généraux de conception. Enceinte de culture est agitée et aérée (en général en faisant barboter de l&#39;air à travers celui-ci) et les microbes contenus dans celui-ci sont maintenus homogènely dispersées dans toute la chambre de culture à tout moment. Composition de milieu frais est ajouté continuellement définie et la vitesse d&#39;addition contrôle le taux de croissance et influence de l&#39;environnement chimique connu par la culture. Un débordement définit le volume de la culture dans le tube de la croissance, et à travers ce débordement de la culture seront échantillonnés à la même vitesse à laquelle pénètre un milieu frais. De cette manière, les cultures d&#39;atteindre rapidement un état physiologique stable au cours de laquelle de nombreux paramètres biologiques restent constants. Malgré les avantages de chemostats et les rapports de ces différentes plates-formes dans la littérature, l&#39;adoption généralisée a été limitée par des difficultés dans la construction et l&#39;exploitation de ces systèmes et les coûts élevés liés aux options commerciales. En outre descriptions sur la façon de faire et d&#39;utiliser ces appareils peut être opaque. Nous présentons des dessins et des instructions pour l&#39;utilisation d&#39;un tableau de petite empreinte de chemostats miniatures construits à partir de pièces disponibles facilement à faible coût. Nous observez très uniformes paramètres expérimentaux et des résultats reproductibles lorsque l&#39;on compare notre dispositif aux données déclarées pour les levures cultivées dans des bioréacteurs de grands volumes commerciaux. Cela inclut la reproductibilité de la physiologie cellulaire comme on le voit à travers atteint l&#39;état d&#39;équilibre équilibre en 10-15 générations et d&#39;obtenir des densités de culture similaires à l&#39;équilibre. En outre, les profils d&#39;expression géniques sont compatibles entre Ministats et un plus grand volume commercial de la plateforme. Stabilité du taux de dilution, la densité optique et la reproductibilité de l&#39;expression des gènes entre les trois cultures répétées démontrer la robustesse de notre plate-forme. Nous montrons également que les mêmes mutations adaptatives se posent sur l&#39;évolution des délais similaires expérimentales avec chemostats plus grand volume.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; tubes en silicone </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Tuyau: Commande: (pack bobine 50 &#39;) </td></tr><tr><td> Tuyau 1/2 &quot;x 5/8&quot; de silicone (extra large) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Tuyau: Commande: (pack bobine 50 &#39;) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; tube en silicone (support) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Tuyau: Commande: (pack bobine 50 &#39;) </td></tr><tr><td> Orange vert tuyau de la pompe Marprène </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Tuyau: Order: 6x (pack de 6) </td></tr><tr><td> Luer femelle, 1/8 &quot;cannelé </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Connecteurs: Ordre: 4x (pack de 25) </td></tr><tr><td> Luer lock mâle, 1/8 &quot;cannelé </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Connecteurs: Ordre: 1x (pack de 25) </td></tr><tr><td> Réduction, PVDF, 1/4 &quot;à 1/8&quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30703-50 </td><td> Connecteurs: Ordre: 1x (pack de 10) </td></tr><tr><td> Barbed connecteur Y, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Connecteurs: Ordre: 3x (pack de 10) </td></tr><tr><td> Brides de tube à moyen </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Pinces: Ordre: 1x (pack de 12) </td></tr><tr><td> Jour Robinet à serrage (pince en métal pour tubes) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Pinces: Ordre: 1x (pack de 10) </td></tr><tr><td> Ligne Homme à clapet raccord rapide, Adaptés aux tuyaux: 1/4 po </td><td> Pêcheur </td><td> 05-112-39 </td><td> Connecteurs: Ordre: 1x (pack de 25) </td></tr><tr><td> Femme en ligne à clapet raccord rapide, Adaptés aux tuyaux: 1/4 po ID, Polypropylène </td><td> Pêcheur </td><td> 05-112-37 </td><td> Connecteurs: Ordre: 1x (pack de 5) </td></tr><tr><td> Pompes à air silencieux </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Aquarium Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Donner de l&#39;air: Ordre: 4 pompes </td></tr><tr><td> Filtres en PTFE, 0,45 um, pour la filtration de l&#39;air </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Donner de l&#39;air: Commande: 1x (boîte de 100) </td></tr><tr><td> Flacon 1L avec arme de poing </td><td> Pêcheur </td><td> 10-181F </td><td> Donner de l&#39;air: Commande: 2x (pack de 6) </td></tr><tr><td> N ° 8 bouchon en silicone, 3/8 dans le trou, pour des flacons arme de poing </td><td> Pêcheur </td><td> K953715-0801 </td><td> Donner de l&#39;air: Commande: 8 bouchons </td></tr><tr><td> 4-Port collecteur </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Donner de l&#39;air: Commande: 8 collecteurs </td></tr><tr><td> 55 ml tubes bouchon à vis de la culture </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Chambre Culture: Commande: 2x (pack de 48) </td></tr><tr><td> Régulière hypodermique blanc moyeu d&#39;aiguille, 16G, 5 po de longueur pour conduite d&#39;amenée </td&gt; <td> Pêcheur </td><td> 14-817-105 </td><td> Chambre Culture: Commande: 1x (pack de 100) </td></tr><tr><td> Aiguille ponction lombaire </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Chambre Culture: Commande: 4x (pack de 10) </td></tr><tr><td> Aiguille hypodermique régulière rose </td><td> Pêcheur </td><td> 14-817-104 </td><td> Chambre Culture: Commande: 1x (pack de 100) </td></tr><tr><td> Mousse bouchon en silicone taille &quot;2&quot;, rose </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Chambre Culture: Commande: 2x (pack de 20) </td></tr><tr><td> Support tube de 8-Eh bien </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Chambre Culture: Ordre: 4 racks </td></tr><tr><td> Bouteille réservoir 10L avec sortie de tuyau en bas: coffre-fort vide </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Médias: Ordre: 2 ou plus </td></tr><tr><td> Jaune bouchon de mousse de silicone, non-standard taille 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Médias: Ordre: 2 ou plus </td></tr><tr><td> Bonbonne de ventilation Filtre </td><td> Pêcheur </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Médias: Ordre: 1x (pack de 10) </td></tr><tr><td> Ruban électrique, vert </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td> Médias: Commander 1 rouleau. </td></tr><tr><td> Filtre, embouts, 1L, 0,2 um, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Médias: Ordre: (1 cas sur 12) </td></tr><tr><td> Bouteille de 5000 ml avec réservoir vidange de fond: vacueuh sécurité </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Média: (Facultatif) </td></tr><tr><td> Bleu bouchon en silicone, mousse nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Média: (Facultatif) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 pompe cartouche </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Pompe Média: commande: 1 </td></tr><tr><td> 16-canaux tête de pompe d&#39;extension 205CA </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Pompe médias: Commande: têtes de pompe 2 de vulgarisation </td></tr><tr><td> Scellant silicone d&#39;aquarium </td><td> Pêcheur </td><td> S18180B </td><td> Pompe Média: commande: 1 </td></tr><tr><td> 6-bloc bain sec </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Commande: 2 pour 32 Ministats ou 1 pour 16. </td></tr><tr><td> Bloc pour drybath, 6 tubes à essai x 25 mm par bloc </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: commande: 12 pour 32 Ministats ou 6 pour 16. </td></tr><tr><td> Filtres à membrane en nylon, 0,45 um Taille des pores; Dia: 25 mm. </td><td> Pêcheur </td><td> R04SP02500 </td><td> Récolte: Commande: 1x (pack de 100) (en option) </td></tr><tr><td> Filtres à membrane en nylon, 0,45 um Taille des pores de 45 mm; </td><td> Pêcheur </td><td> R04SP04700 </td><td> Récolte: Commande: 1x (pack de 100) (en option) </td></tr><tr><td> 47 mm, un appareil grand filtre </td><td> Pêcheur </td><td> XX10 047 30 </td><td> Récolte: commande: 1 (en option) </td></tr><tr><td> Glass porte-filtre, 25 mm, petit appareil filtrant </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Récolte: commande: 1 (en option) </td></tr><tr><td> Vase Dewar, 1L pour l&#39;azote liquide </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Récolte: commande: 1 (en option) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Chemostats sont des systèmes de culture continue dans laquelle les cellules sont cultivées dans un très contrôlé, environnement chimiquement stable où la densité de la culture est limitée par la limitation des nutriments spécifiques. 1,2 Les données de chemostats sont hautement reproductible pour la mesure des phénotypes quantitatifs car ils fournissent un taux de croissance constant et de l&#39;environnement à l&#39;état stationnaire. Pour ces raisons, chemostats sont devenus des outils utiles pour la caractérisation à échelle fine de la physiologie à travers l&#39;analyse de l&#39;expression génique 3-6 et d&#39;autres caractéristiques des cultures à l&#39;état stationnaire d&#39;équilibre. 7 à long terme des expériences dans chemostats peut mettre en évidence des trajectoires spécifiques que les populations microbiennes adopter cours de l&#39;évolution adaptative dans un environnement contrôlé. En fait, chemostats ont été utilisées pour l&#39;évolution expérimentale depuis leur invention. 8 Un résultat commun des expériences évolution est pour chaque réplicat biologique d&#39;acquérir un répertoire unique de mutations. 13.9 Cette diversité suggère que il reste encore beaucoup à découvrir en effectuant des expériences évolution avec un débit beaucoup plus important. Nous présentons ici la conception et l&#39;exploitation d&#39;une relativement simple, array faible coût de chemostats-ou-miniatures Ministats et de valider leur utilisation dans la détermination de la physiologie et de l&#39;évolution dans les expériences avec de la levure. Cette approche implique une croissance des dizaines de chemostats fonctionner sur un seul multiplex pompe péristaltique. Les cultures sont maintenues à un volume de 20 ml de travail, ce qui est pratique pour une variété d&#39;applications. C&#39;est notre espoir que d&#39;augmenter le débit, la diminution des dépenses, et de fournir bâtiment et des instructions détaillées de fonctionnement peuvent également motiver les applications de recherche et industriel de cette conception comme une plate-forme générale pour la caractérisation fonctionnelle grand nombre de souches, les espèces et les paramètres de croissance, ainsi que génétique bibliothèques de drogue ou.

Le tableau ministat décrit ci-dessus et (figure 1A, B) a été utilisé pour la culture d&#39;une souche de laboratoire haploïde MATa de levure de boulanger (S288C) sous le sulfate de limitation de conditions telles que décrites précédemment. 10 Nous avons testé l&#39;efficacité pour les applications en chémostat communs, y compris la détermination de la physiologie et de évolution expérimentale. Pour valider les Ministats, nous avons répété plusieurs expériences déjà réalisées dans des fermenteurs industriels modifiés pour l&#39;usage chémostat. 10,20,21 Sixfors ATR fermenteurs ont été effectués à un volume de 300 ml de travail, plus de dix fois le volume des Ministats, et ont des modes très différents d&#39;aération culture et de l&#39;agitation. Nous avons tenté de reproduire la stabilité équipement, la physiologie état d&#39;équilibre, les résultats expérimentaux évolution et l&#39;expression des gènes obtenus avec ces fermenteurs. L&#39;uniformité des taux de dilution et l&#39;aération sont des aspects importants de la conception chemostat, on measured le taux de dilution effectif à travers Ministats 32 après 15 générations de croissance et ont trouvé que, avec un taux de dilution de 0,17 cible vol / h (4-5 gouttes / min), on atteint un taux de dilution de 0,17208 moyenne avec un écart-type de 0,0075 à travers 32 répétitions. Cette gamme a été au sein de notre tolérance typique de + / -0,01 vol / h de différence à partir de la définition des objectifs, au-delà duquel changements à grande échelle dans l&#39;expression des gènes ont été observées. 22-23 sur 4 Ministats le débit d&#39;air a été établie à 307,5 ​​ml / min avec un écart type de 9,57 ml / min. Ceci suggère que l&#39;écoulement d&#39;air dans les chambres est robuste et uniformément répartis entre les 4 chambres et est une valeur similaire à celle décrite pour l&#39;aération dans des fermenteurs industriels 20. Nous avons déjà observé une amplification récurrent de la sul1 haute affinité du transporteur de soufre-ion 08.08 expériences évolution du sulfate limitées dans la levure. 10 Compte tenu de la cohérence des résultats sous thiétat s, nous avons choisi de sulfate de limitation de tester la capacité de notre système. Un élément indispensable de la culture en chémostat est la nécessité de maintenir un environnement chimique constante. Les fluctuations de l&#39;abondance d&#39;une limitation des changements nutritionnels ou d&#39;une autre dans l&#39;environnement aboutissent généralement à un changement dans le nombre de cellules dans une culture donnée. Nous avons mesuré la densité optique comme un proxy pour le nombre de cellules (figure 2A) et la reproductibilité mesurée dans 16 cultures répétées, de trouver un moyen de 1,12 A600 (~ 10 9 cellules) après environ 15 générations de croissance avec un écart type de 0,057 unités, soit 5,1 %. A titre de comparaison, les mesures prises à partir de 4 cultures répétées cultivées dans des fermenteurs industriels ont montré un écart type de 2,5%. Les cellules sont bien mélangés dans la chambre de croissance: les mesures de DO et le nombre de cellules prélevées sur la piste des effluents étaient équivalentes à des échantillons prélevés directement sur le tube de culture (données non présentées). Ces résultats démontrent la robustesse de notre plate-forme d&#39;unla capacité d pour maintenir un environnement chimique constante avec une tolérance similaire à celui du fermenteur industriel. Comme une lecture plus sensible de la physiologie, nous avons comparé l&#39;ensemble du génome expression régulière gène état des cultures cultivées dans du sulfate de limitation dans les Ministats et dans le fermenteur industriel. L&#39;expression des gènes dans les Ministats ont montré un degré élevé de similitude entre trois biologique répétitions (figure 2B). Nous avons déjà noté que pour l&#39;ARN dérivé de deux chemostats Sixfors répétés et co-hybridé à une puce à ADN, l&#39;expression de 99% des gènes est tombé dans une fourchette de 1,5 fois, ce qui permet l&#39;utilisation de 1.5X comme une coupure signification empirique 21. L&#39;expression des gènes de Ministats trois répétitions, deux à deux par rapport a montré, 99% des gènes est tombé dans une fourchette 1.5 à 1.7 fois, comparable aux résultats des fermenteurs industriels. Les trois échantillons ont été hybridées à des tableaux individuels et les ratios calculés par paires après, de sorte que ces vasyphilis comprennent inter-matrices de bruit en plus du bruit biologique, ce qui pourrait surestimer la variation entre les répétitions par rapport aux publications, co-hybridés résultats. 138 gènes sont exprimés de façon différentielle&gt; 1,5-pli dans tous ministat trois répétitions par rapport à un échantillon prélevé à partir d&#39;une culture cultivée identifié dans le fermenteur industriel. Les gènes ont diminué dans l&#39;expression dans les Ministats ont été fortement enrichi pour le métabolisme du fer. Cette signature peut refléter la composition de chaque métal différent configuration de l&#39;appareil: l&#39;appareil Sixfors comprend une turbine métallique et l&#39;assemblage d&#39;aération immergé dans la culture, des médias et de la bonbonnes précédemment utilisé également nécessaire quincaillerie métallique. Le ministat utilise des aiguilles en acier inoxydable, mais pas de composants métalliques. Les gènes présentant une expression accrue ont été largement associés avec les membranes cellulaires, bien que la signification biologique de cette association n&#39;est pas claire. Enfin, nous avons testé unde évolution expérimentaler ces conditions. Après 250 générations de sulfate de croissance limitée, 4/4 clones testés à partir de 4 populations indépendantes ont montré l&#39;évolution amplification de sul1 détectée par hybridation génomique comparative (CGH, figure 2C). Ce résultat est cohérent avec les résultats des chemostats des quantités plus importantes sur des intervalles de temps similaires 10. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Figure Design 1. A. Conception et agencement de l&#39;ensemble ministat. B. de la chambre de culture. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figure 2. A. ExperimeNTAL données montrant que les cultures atteignent un équilibre dans les dix générations de croissance (n = 16). B. Les données d&#39;expression pour trois réplicats biologiques S1-3 échantillonné pendant l&#39;état d&#39;équilibre avec une limitation de sulfate par rapport à une référence commune cultivé dans un appariement de sulfate limitée chémostat Sixfors C. amplifications. sul1 récupéré dans Ministats après 250 générations de croissance dans un environnement sulfate limitée. L&#39;ADN génomique de chaque clone évolué a été comparé à l&#39;ADN ancestral par CGH comme décrit. 21 Moyenne du nombre de copies a été calculé pour chaque région amplifiée et est indiqué à côté de chaque amplicon. Toutes les données de biopuces sont déposés dans la base de données GEO dans l&#39;adhésion GSE36691. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure.</a>

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Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Nous avons développé et validé un ensemble de petite empreinte de chemostats miniatures construits à partir de pièces facilement disponibles pour un faible coût. Évolution résulte physiologiques et expérimentales sont similaires à chemostats plus grand volume. Le tableau ministat fournit une plate-forme compacte, peu coûteux et accessible pour les expériences en chémostat traditionnels, la génomique fonctionnelle et les applications de criblage chimique.

Conception et utilisation des tableaux chémostat multiplexés

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.1K vues.  University of Washington. Nous avons développé et validé un ensemble de petite empreinte de chemostats miniatures construits à partir de pièces facilement disponibles pour un faible coût. Évolution résulte physiologiques et expérimentales sont similaires à chemostats plus grand volume. Le tableau ministat fournit une plate-forme compacte, peu coûteux et accessible pour les expériences en chémostat traditionnels, la génomique fonctionnelle et les applications de criblage chimique.

Vidéo: Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays. Robust flow control and precise fluidic volumes are two critical requirements for these applications. We have developed microfluidic chips featuring elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS) microvalve arrays that: 1) need no extra energy source to close the fluidic path, hence the loaded device is highly portable; and 2) allow for microfabricating deep (up to 1 mm) channels with vertical sidewalls and resulting in very precise features.

The PDMS microvalves-based devices consist of three layers: a fluidic layer containing fluidic paths and microchambers of various sizes, a control layer containing the microchannels necessary to actuate the fluidic path with microvalves, and a middle thin PDMS membrane that is bound to the control layer. Fluidic layer and control layers are made by replica molding of PDMS from SU-8 photoresist masters, and the thin PDMS membrane is made by spinning PDMS at specified heights. The control layer is bonded to the thin PDMS membrane after oxygen activation of both, and then assembled with the fluidic layer. The microvalves are closed at rest and can be opened by applying negative pressure (e.g., house vacuum). Microvalve closure and opening are automated via solenoid valves controlled by computer software.

Here, we demonstrate two microvalve-based microfluidic chips for two different applications. The first chip allows for storing and mixing precise sub-nanoliter volumes of aqueous solutions at various mixing ratios. The second chip allows for computer-controlled perfusion of microfluidic cell cultures.

The devices are easy to fabricate and simple to control. Due to the biocompatibility of PDMS, these microchips could have broad applications in miniaturized diagnostic assays as well as basic cell biology studies.

We demonstrate protocols for manufacturing and automating elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS)-based microvalve arrays that need no extra energy to close and feature photolithographically defined precise volumes. A parallel subnanoliter-volume mixer and an integrated microfluidic perfusion system are presented.

Puces microfluidiques contrôlée avec les tableaux microvanne élastomère

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Recherche

Biologie

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform routine activities, but prosthetic suspensions using traditional socket technology can prove to be cumbersome and uncomfortable for a person with limb loss.  Moreover, for those with high proximal amputations, limited residual limb length may prevent exoprosthesis attachment all together. Osseointegrated implant technology is a novel operative procedure which allows firm skeletal attachment between the host bone and an implant. Preliminary results in European amputees with osseointegrated implants have shown improved clinical outcomes by allowing direct transfer of loads to the bone-implant interface.  Despite the apparent advantages of osseointegration over socket technology, the current rehabilitation procedures require long periods of restrictive load bearing prior which may be reduced with expedited skeletal attachment via electrical stimulation.  The goal of the osseointegrated intelligent implant design (OIID) system is to make the implant part of an electrical system to accelerate skeletal attachment and help prevent periprosthetic infection. To determine optimal electrode size and placement, we initiated proof of concept with computational modeling of the electric fields and current densities that arise during electrical stimulation of amputee residual limbs.  In order to provide insure patient safety, subjects with retrospective computed tomography scans were selected and three dimensional reconstructions were created using customized software programs to ensure anatomical accuracy (Seg3D and SCIRun) in an IRB and HIPAA approved study.  These software packages supported the development of patient specific models and allowed for interactive manipulation of electrode position and size. Preliminary results indicate that electric fields and current densities can be generated at the implant interface to achieve the homogenous electric field distributions   required to induce osteoblast migration, enhance skeletal fixation and may help prevent periprosthetic infections.  Based on the electrode configurations experimented with in the model, an external two band configuration will be advocated in the future.

There is a need to develop alternative prosthesis attachment due to limb loss attributed to vascular occlusive diseases and trauma. The goal of the work is to introduce an osseointegrated intelligent implant design system to increase skeletal fixation and reduce periprosthetic infection rates for patients needing osseointegrated technology.

Analyses Bioelectric d&#39;un système ostéo-intégrés Implant Intelligent Design pour amputés

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Méthodologie d&#39;essai fluorométrique multiplexés dosage immunologique et dépannage

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

La cartographie des réseaux fonctionnels bactériens et voies de<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; En utilisant des tableaux synthétiques génétiques

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabrication et utilisation de puces à micro-environnement (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Assemblée des nucléosomiques tableaux de recombinants base histones et nucléosomes ADN positionnement

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Conception et analyse du comportement de préférence de température et de son rythme circadien chez la drosophile

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identifier les sites d&#39;interaction protéine-protéine à l&#39;aide de peptides tableaux

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...