Damos las gracias a Lee Tuddenham (IBMC, Estrasburgo) para amplificar y titulación MCMV-Luc y Thomas Baumert (INSERM U748, Estrasburgo) por el permiso para usar el animalario del Instituto de Virología. El apoyo financiero del INSERM, Universidad de Estrasburgo y la Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) se reconoce. También se reconoce la participación inicial de Sonia Beroud y Laetitia Lelieur durante su proyecto principal.

1. Preparación de la suspensión viral <ol><li> Obtener la cepa Smith de MCMV expresar luciferasa (Luc MCMV-15) desde el laboratorio de Ulrich Koszninowski. En este recombinante, el gen de la luciferasa se ​​inserta en el locus del genoma IE2 MCMV. </li><li> Para amplificar MCMV-Luc, infectar una línea celular estromal de médula ósea murina (M2-10B4, ATCC n º CRL-1972) con MCMV a diferente multiplicidad de infección (MOI, 0,001 a 1) 16. Para ello, añadir el virus a las células cultivadas en medio libre de suero a 37 ° C. Después de una hora, retirar el sobrenadante y reemplazarlo con DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Cinco días más tarde, cosechar el medio de cultivo y las alícuotas se almacenan a -80 ° C hasta su uso posterior. </li><li> La titulación de la suspensión viral mediante ensayo en placa. <ol><li> Dividir las células 3T3 (ATCC # CRL-1658) en una placa de 24 pocillos a 40.000 células / pocillo en 1 ml de DMEM suplementado con 10% de FCS que contiene penicilina (200 UI / ml) y steptomycin (200 mg / ml) E incubar 24 horas a 37 ° C. </li><li> Preparar diluciones en serie (10 -1 a 10 -8) de una parte alícuota de la suspensión de MCMV en DMEM e infectar las células diana (3T3) con 200 l de dilución después de la eliminación de medio de cultivo celular. Incubar 1 hora a 37 ° C. Añadir 1 ml de medio superior (DMEM FCS al 3%, 2% (v / v) de gentamicina, 200 UI / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina, 8 g / l de carboximetil celulosa) e incubar durante 5 días a 37 ° C. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 200 l 10% de formaldehído (formaldehído de dilución con agua se debe realizar en una campana química para evitar inhalaciones tóxicas) a cada pocillo, y la incubación de 6 horas a temperatura ambiente. Retirar el medio de cultivo + fijador con la pipeta y se añade solución de tinción celular 200 l (1% de cristal violeta (w / v) en etanol al 20%). Antes de usar, diluir 1 parte con 9 partes de agua milli-Q. Incubar 2 minutos a temperatura ambiente, lavar la placa 3-4x al sumergirlo en agua, dejar secar y contar el número de las placas con un binocular. </li></ol></li> &lt;li&gt; Diluir MCMV-Luc en DMEM obtener 50 UFP en 50 l y dejar en hielo hasta su uso posterior. Uso de inóculos virales más altas induce letalidad antes de que los recién nacidos alcanzan 2-3 semanas de edad. En nuestra experiencia, 500 UFP inducir letalidad de cada neonato 5 a 7 días después de la inyección. </li></ol> 2. La inyección de neonatos <ol><li> Cuando recién nacidos (de 4 a 20 ratones horas de edad) están disponibles, manipular la basura y los excrementos de la jaula con los guantes antes de manipular con cuidado a las crías para evitar la contaminación por olores &quot;extranjeros&quot; que insistir en la madre y provocar el rechazo de los cachorros . </li><li> Realice una inyección intraperitoneal usando una jeringa de insulina (29 g) como se muestra en la Figura 1A. Sostenga el recién nacido con la piel dorsal. Con el lado ventral hacia arriba, introducir la aguja por debajo de la pata delantera y empuje suavemente por vía subcutánea para alcanzar la cavidad peritoneal (un poco bajo el ombligo). Actualmente inyectamos 1% de azul de metileno diluido en DPBS y monitoreamos la supervivencia de practique la técnica antes de realizar las infecciones virales. Desde El azul de metileno es claramente visible durante el proceso de inyección, se recomienda realizar esta inyección &quot;entrenamiento&quot; en primer lugar para garantizar la entrega adecuada de la suspensión viral en la cavidad intraperitoneal. </li><li> Eliminar las diminutas gotas de sangre que puedan surgir y colocar la parte trasera recién nacido en la jaula. </li></ol> 3. Imágenes in vivo <ol><li> En el día 7, manejar los recién nacidos con la misma precauciones como se mencionó anteriormente. Se inyecta por vía intraperitoneal una mezcla de anestésicos (4 mg / ml de ketamina, 0,8 mg / ml de xilazina) y luciferina (0,15 mg / g de peso corporal) en 50 l en cada animal. El peso promedio corporal de los animales es de 1-2 g, y la dosis de anestésicos por animal es: ketamina 40 mg, 8 mg de xilazina Espere 12 a 15 minutos hasta que la luciferina alcanza su máximo de emisión. Esta tiene que ser determinada de antemano y depende del proveedor de luciferina y el sistema de imagen utilizado. </li><li> Mientras que los cachorros son anesthetized, etiquetarlas para la futura identificación y cosechar una pequeña muestra de tejido que luego pueden ser utilizados para futuras genotipado si se utilizan animales mutantes. </li><li> Coloque los cachorros en el sistema de imagen y realizar la adquisición de la luz emitida por todo el cuerpo. Siete días después de la infección, el virus se ha replicado en numerosos ejemplares en los órganos diana como el hígado, los riñones, los pulmones y las glándulas salivales, por lo tanto, la duración de la exposición debe ser corto. En nuestro caso, llevamos a cabo la adquisición de 10 a 20 segundos (Figura 1B). La plataforma en la cámara de adquisición del dispositivo de formación de imágenes tiene que ser calentado para evitar el enfriamiento excesivo de la temperatura del cuerpo de los animales anestesiados. Además, es útil para obtener imágenes de baja resolución de varios animales dentro de una ronda de adquisición y posteriormente, subir en la plataforma cerca de la lente de la cámara con el fin de centrarse en una parte de un animal en particular o un órgano aislado después de la disección. El software debe permitir cambios rápidosde los parámetros (tiempo de exposición, la distancia de la muestra / de la lente, la sensibilidad), la cuantificación de las regiones de interés definidas y futura exportación de imágenes instantáneas. </li><li> Para adquirir la señal de luz sólo desde la cabeza, cubrir el cuerpo de los recién nacidos se extiende lateralmente con un, papel grueso y oscuro que enmascarar los fotones emitidos a nivel de los órganos en los que se produce una alta replicación viral (hígado, pulmones, glándulas salivales) y realizar adquisición de 5 a 10 min (Figura 1C). Realizar adquisición de el lado opuesto del animal en las mismas condiciones. </li><li> Reintroducir los cachorros en la jaula y coloque una lámpara de calor en la parte superior para evitar el enfriamiento excesivo de los recién nacidos anestesiados. Monitorear regularmente la recuperación post-anestésica. Con la dosis indicada, la anestesia actualmente dura 30 min. </li><li> Repita el mismo procedimiento en los días 9, 11 y 14. En los días 11 y 14, cambiar la dosis de anestésicos (6 mg / ml de ketamina, 1,2 mg / ml de xilazina). </li></ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathogenesis+of+congenital+cytomegalovirus+infection:+disease+mechanisms+and+prospects+for+intervention.">Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention.</a> Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).</li><li>Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cytomegalovirus+infection+on+embryogenesis+and+brain+development.">Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development.</a> Congenit. Anom. 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Genome. 17, 398-406 (2006).</li><li>Juanjuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+congenital+CMV+infection+and+hearing+impairment.">Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment.</a> Virol. J. 8, 70 (2011).</li><li>Koontz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+development+of+the+brain+after+focal+herpesvirus+infection+of+the+central+nervous+system.">Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system.</a> J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).</li><li>Bantug, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals.">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li><li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research.">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li><li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo.">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li><li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+(M2-10B4).">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li></ol>

Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia. Declaración de Ética Los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos en las instalaciones de cuidado de los animales del Institut d&#39;Immunologie et d&#39;Hématologie. Manejo de los ratones y los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con la Ley Francesa de Protección de los Animales de Laboratorio. El procedimiento fue aprobado por el servicio veterinario de la Préfecture du Bas-Rhin (Francia) con el número de autorización A-67-345.

Gracias al uso de la tecnología de imágenes in vivo para monitorear difusión MCMV-Luc en ratones recién nacidos, hemos sido capaces de observar la propagación viral en el cerebro de los animales mutantes, a diferencia de tipo salvaje. Además la disección del animal y de formación de imágenes ex vivo del cerebro confirmó la presencia del virus luminiscente en el sistema nervioso central. Además, también se realizó la inmunohistoquímica (no se muestra) en secciones delgadas del cer...

Citomegalovirus Humano (HCMV/HHV-5) es un miembro de la familia β-herpesvirus. HCMV es un patógeno oportunista muy frecuente que por lo general se adquiere durante la vida temprana como una infección asintomática 1. Como todos los herpesvirus, HCMV persiste durante toda la vida del huésped cuyo sistema inmune controla estrechamente la replicación viral. Los episodios de reactivación viral ocurren principalmente en individuos inmunodeprimidos como los pacientes trasplantados que reciben medicamentos para evitar el rechazo del injerto 2. En los adultos, HCMV también se ha relacionado con los glioblastomas 3. Además, HCMV es un patógeno importante para los recién nacidos con la inmunidad inmadura 4-6. La infección primaria en el feto o el neonato en desarrollo puede tener consecuencias graves. Infección por citomegalovirus es la causa infecciosa más común de defectos congénitos y trastornos de la infancia en los países desarrollados. Se estima que la incidencia de infección neonatal HCMV afecta 0,5-1% de Of todos los nacidos vivos entre los cuales 10.5% sufrirá síntomas graves, como microcefalia o hipoplasia cerebelosa. Además, el 10% de los niños infectados con una infección viral subclínica después dará secuelas que conduce al retraso mental, pérdida, defectos visuales o convulsiones y epilepsia 7,8 audición. A diferencia de otros herpesvirus humanos tales como herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) que pueden ser inoculados a ratones a través de diferentes rutas de inyección 9, la replicación de citomegalovirus es específico de la especie. Investigaciones de la patogénesis HCMV que se realizan en diferentes modelos animales Esta característica ha obstaculizado seriamente (ratón, rata, cobaya, mono rhesus) y sus respectivos vehículos comerciales genuinos específicos del host. Todos los vehículos comerciales exhiben similitudes significativas en el tamaño del genoma y la organización, tropismo tisular y la regulación de la expresión génica. También inducen patologías similares en sus respectivos anfitrión. A pesar de la diversidad genómica serentre HCMV y citomegalovirus de ratón (MCMV) (50% de los ORFs presentes en el virus humano se identifican en el CMV murino), el modelo de ratón se ha demostrado recientemente que es ventajoso, sobre todo porque las cepas mutantes pueden ser probados por su capacidad para controlar viral la replicación in vivo. Esto ha llevado a una pantalla genética que permitió una estimación del número de genes de ratón expresadas en la etapa adulta que componen el &quot;resistome&quot; a este virus 10. En conjunto, esto indica que los ratones MCMV infectados representan un modelo atractivo para el estudio de las interacciones huésped-virus en adultos. La exploración de la infección congénita por CMV es más compleja debido a las diferencias en la organización capa placentaria entre humanos y ratones afectan la transmisión de la madre al feto de la infección viral en ratones. Recientemente, la inyección directa de MCMV en la placenta en el día 12,5 de gestación ha permitido infección del cerebro de ratones recién nacidos que han llevado a un deterioro de audición 11. Sin embargo, la mayoría investigations ahora utilizan la inyección intraperitoneal de 4-20 horas de edad, recién nacidos para proporcionar difusión viral sistémica que puede conducir a una infección cerebral hematógena, un modelo que es más relevante que la de una inyección intracraneal. Este protocolo proporcionado importantes conocimientos sobre CMV patogénesis y, más particularmente, se demostró que la infección por MCMV de recién nacidos en los resultados de la replicación viral en las células neuronales y gliales situadas en los focos inflamatorios que están infiltrados con células mononucleares como los macrófagos 12. Este informe también describe la morfogénesis alterada del cerebelo acompañada con la disminución de la proliferación y la migración de neuronas granulares y la inducción de múltiples genes de interferón-estimuladas. El papel esencial de los linfocitos T CD8 + para el control de MCMV en el sistema nervioso central también fue reportado por el mismo grupo de 13. Un aspecto importante a considerar cuando se analiza el efecto patológico de un microbio es la dinámica de la infectarde iones. En el caso de MCMV, es particularmente crucial para explorar y cuantificar la progresión de la diseminación viral en el cerebro en desarrollo con el fin de entender y anticipar la magnitud de las lesiones futuras neurobiológicos. Tradicionalmente, la cuantificación de la progresión de una infección requiere el continuo sacrificio de los animales infectados para titular el patógeno en los tejidos, tales como el cerebro, que son de otra manera inaccesibles. Este tipo de protocolo es ahora cuestionada por la mejora necesaria del bienestar de los animales y las 3R (reducir, mejorar, reemplazar) los principios 14. El uso de tecnologías de formación de imágenes in vivo puede permitir una reducción drástica del número de animales que son necesarios en en experimentos de infección in vivo. Aquí, se presenta y describe un análisis de tiempo-luego de la difusión viral en el cerebro a la inyección intraperitoneal MCMV-Luc a los recién nacidos de ratón. Utilizando los mismos animales, que seguidos y controlados en vivo los sitios de intensa vireplicación RAL durante un período de 2 semanas.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3523A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319112</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4897</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CentraVet</td>
			<td>Ket 201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine/Vetranal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>P0436500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>gentamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>carboxymethylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4888</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3886</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IVIS 50</td>
			<td>Caliper/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates

El citomegalovirus humano (HCMV o HHV-5) es un patógeno potencialmente mortal en los individuos inmunocomprometidos. Tras la infección congénita o neonatal, el virus puede infectar y replicarse en el cerebro en desarrollo, lo que puede inducir daño neurológico grave, incluyendo sordera y retraso mental. A pesar de la posible gravedad de los síntomas, las opciones terapéuticas son limitadas por la falta de disponibilidad de una vacuna y la ausencia de una terapia antiviral específica. Además, una descripción precisa de los eventos moleculares que ocurren durante la infección del sistema nervioso central (SNC) está todavía ausente desde observaciones sobre todo se derivan de la autopsia de los niños infectados. Varios modelos animales, tales como macacos rhesus por CMV, se han desarrollado y proporcionado importantes conocimientos sobre patogénesis CMV en el SNC. Sin embargo, a pesar de su proximidad evolutiva con los seres humanos, este modelo estaba limitada por el procedimiento de inoculación intracraneal utilizado para infectar a los animales y los contrasistently inducir la infección del SNC. Por otra parte, las consideraciones éticas han promovido el desarrollo de modelos alternativos, entre los que la infección neonatal de ratones recién nacidos con citomegalovirus ratón (MCMV) ha llevado recientemente a avances significativos. Por ejemplo, se informó de que la inyección intraperitoneal de MCMV a Balb / c recién nacidos conduce a la infección de las neuronas y las células gliales en áreas específicas del cerebro. Estos resultados sugirieron que la inoculación experimental de ratones podría recapitular los déficits inducidos por la infección por HCMV en los niños. Sin embargo, un análisis dinámico de la infección por MCMV de los recién nacidos es difícil de realizar porque la metodología clásica requiere el sacrificio de un número significativo de los animales en diferentes puntos de tiempo para analizar la carga viral y / o parámetros relacionados con la inmunidad. Para sortear este obstáculo y permitir que las futuras investigaciones de los animales mutantes raros, se aplicó en la tecnología de imágenes in vivo para realizar un análisis de tiempo-curso de la viral difusión en el cerebro después de la inyección periférica de un MCMV recombinante que expresa luciferasa a C57Bl / 6 recién nacidos.

Un experimento representativo se ilustra en la Figura 1. Tras la inyección intraperitoneal de 50 PFU de MCMV-Luc (panel A muestra una inyección similar realizado con azul de metileno para visualizar la ruta subcutánea de la aguja), los recién nacidos se anestesiaron y se reciben simultáneamente 0,3 mg del sustrato de luciferasa (luciferina, Pinza). Quince minutos más tarde, los animales fueron colocados lado ventral hacia arriba en la cámara de adquisición de la IVIS 50 (En Sistema de imágenes ...

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Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

El citomegalovirus (HCMV) La infección humana de los recién nacidos representa una causa importante de retraso mental, pero los eventos moleculares que conducen a la patogénesis inducida por virus son aún poco conocidos. Para investigar la dinámica de la infección en el cerebro, adaptamos todo animal<em&gt; In vivo</em&gt; De imágenes para realizar análisis de tiempo-curso de los recién nacidos infectados con un virus de la luciferasa recombinante.

El uso de<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

14.8K vistas.  Université de Strasbourg. El citomegalovirus (HCMV) La infección humana de los recién nacidos representa una causa importante de retraso mental, pero los eventos moleculares que conducen a la patogénesis inducida por virus son aún poco conocidos. Para investigar la dinámica de la infección en el cerebro, adaptamos todo animal In vivo De imágenes para realizar análisis de tiempo-curso de los recién nacidos infectados con un virus de la luciferasa recombinante.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Investigación

Inmunología e Infección

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

El uso de diacetato de carboxifluoresceína Ester succinimidil (CFSE) para controlar la proliferación de linfocitos

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

En Vivo Imaging Systems (IVIS) La detección de un virus invasor Neuro-encefálico

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

In vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imagen de la producción de interferón gamma in situ en el bazo de ratón después de la infección por Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Un ensayo ex vivo para estudiar Candida albicans Morphogenesis hifal en el tracto gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...