Les cellules de la lignée cellulaire de chondrosarcome SW1353 ont été aimablement fournies par le professeur PCW Hogendoorn et Dr. J. Bovée de l&#39;Université de Leiden, Pays-Bas. Nous remercions J. Mestach et G. Wagemans pour une excellente assistance technique et G. De Bruyne pour le dessin professionnel de la vue d&#39;ensemble de notre protocole.

Voir la Figure 1 pour un aperçu Matériel tumoral 1. L&#39;obtention et la préparation des échantillons tumoraux Pour l&#39;utilisation du matériel malade, l&#39;approbation du comité d&#39;éthique est nécessaire, et le consentement éclairé doit être obtenu à partir du patient. <ol><li> matériau de récolte de mandataire (minimum 1 cm 3) au moment de l&#39;intervention, que ce soit une biopsie ou une résection d&#39;un sarcome. Le site approprié de la biopsie est définie en utilisant dynamique de contraste IRM. </li><li> Placer le matériau immédiatement dans un flacon stérile contenant du DMEM additionné de 1 000 U de pénicilline et 1 mg / ml de streptomycine. </li><li> Transporter le flacon immédiatement (30 - 90 min) au laboratoire. </li></ol> Toutes les procédures suivantes sont effectuées sous flux laminaire. <ol start="4"><li> Verser le contenu du flacon dans une boîte de Pétri stérile. </li><li> Mettre l&#39;échantillon tumoral dans de petites parties de maximum 1 mm 3 à l&#39;aide d&#39;un scalpel stérile. Retirez toutes les pièces calcifiées comme ils ont tendance à nuire à la transformation du tissu. </li><li> Prendre au hasard 10 greffes tumorales pour l&#39;application de la CAM. </li></ol> 2. Préparation des tumeurs dérivées des suspensions monocellulaires Durée approximative: 3 heures <ol><li> Peser le tissu restant de l&#39;échantillon. </li><li> Mettre 2 - 4 g de tissu dans un tube à dissociateur, plus d&#39;un tube peut être nécessaire de digérer tout le tissu de la tumeur restante. </li><li> Pour la digestion de 2 - 4 g de tissu, ajouter la solution de 2,5 ml de collagénase 2 (500 U / ml de RPMI 1640) et une solution de DNase 2,5 ml (22 KU / ml RPMI 1640). </li><li> Procédé du tissu selon le protocole de h_tumor de dissociateur. Il s&#39;agit de 2 cycles d&#39;incubation à 37 ° C en CO 2 incubateur tandis que le tube est secoué doucement pendant 30 min. </li><li> Filtrer la suspension restante à travers un tamis cellulaire 150 um. </li><li> Centrifuger le lysat à 1000 rpm pendant 5 kmn. </li><li> Eliminer le surnageant. </li><li> Reprendre le culot dans 10 ml de tampon de lyse érythrocytaire (ELB), permettant 10 minutes d&#39;incubation avec suspension régulière. </li></ol> Note: tampon de lyse érythrocytaire est fabriqué comme suit: Ajouter 0,037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g de NH 4 Cl à 1000 ml aqua, utiliser NaOH 10 N pour ajuster le pH à 7,3, filtre sous pression à 0,22 um filtrer. Conserver à 4 ° C. <ol start="9"><li> Ajouter 25 ml de milieu de culture (DMEM complété avec 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine) pour arrêter la réaction. </li><li> Centrifuger la suspension à 1000 rpm pendant 5 min. La couleur de la pastille doit être blanc maintenant. </li><li> Eliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu de la boulette. Filtrer la suspension à travers un tamis cellulaire um 70. </li><li> Compter le nombre de cellules vivantes / ml à l&#39;aide d&#39;un compteur automatique de cellules. </li></ol> 3. Cancer lignées cellulaires SAOS2 cellules d&#39;ostéosarcome (numéro ATCC: HTB-85) exprimant la protéine fluorescente verte ont été électroporation par le vecteur pEGFP-C1 en utilisant la lignée cellulaire Nucleofector Kit V selon le protocole du fabricant. Pour établir des lignées cellulaires stables, les cellules transfectées ont été sélectionnées dans G418 (1 mg / ml) pendant 4 semaines en ligne avec les précédents établis protocole 20. En outre le tri a été effectué par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) selon les instructions du fabricant. Les cellules provenant de la lignée de cellules de chondrosarcome SW1353 (numéro ATCC: HTB-94) ou de suspensions de cellules individuelles de tumeur fraîchement préparés sont étiquetés à l&#39;aide d&#39;une membrane lipophile fluorescent tache rouge. <ol><li> Retirez les cellules du flacon de culture d&#39;une manière classique en utilisant la trypsine (0,5% p / v) d&#39;acide éthylène diamine (EDTA, 0,2% poids / volume) solution. </li><li> Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1000 rpm. </li><li> Retirez le supernatant. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu sans sérum et 5 pi Dil (Vybrant Rouge) / 10 6 cellules. </li><li> Envelopper le flacon dans une feuille d&#39;aluminium et le mettre dans le CO 2 incubateur pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Centrifuger à nouveau pendant 5 min à 1000 rpm et éliminer le surnageant. </li></ol> Essai sur la membrane chorioallantoïque 1. L&#39;incubation des oeufs <ol><li> Les œufs fécondés provenant d&#39;une écloserie commerciale locale garantissant 95% fécondation des œufs sont obligatoires. </li><li> Les œufs fécondés peuvent être stockés à température ambiante jusqu&#39;à 10 jours. </li></ol> Remarque: avant de commencer l&#39;incubation, la saleté, les plumes et les excréments sont soigneusement retirés des coquilles d&#39;œufs mécaniquement par un essuyage à sec avec du papier absorbant, qui ont une grossière plutôt qu&#39;une structure de surface molle. Essuyer les œufs avec 70% d&#39;éthanol dénaturé ou tout autre réactif de nettoyage permet de réduire considérablement le taux de survie des embryons de poulet. <ol start="3"><li> Mettez les œufs dans le Incubteur d&#39;un côté, le marquage de la surface supérieure. Le jour où les œufs sont placés dans l&#39;incubateur est désignée 0 jours de développement embryonnaire. </li><li> Réglez la température d&#39;incubation à 37,8 ° C, et une humidité de 47%. Assurez-vous que l&#39;option de rotation automatique est désactivée. </li></ol> 2. Ouverture des œufs Durée: ± 60 min pour 25 oeufs Le jour de développement 3, les œufs sont ouverts sous flux d&#39;air laminaire. Ouverture des œufs lors d&#39;une nouvelle résultats de la phase de développement des dommages à la CAM, comme la membrane a tendance à coller à la coque. Une lampe infrarouge est utilisé pour garder les œufs au chaud pendant la procédure. Pour améliorer la stérilité, nous recommandons l&#39;utilisation de gants à la main. <ol><li> Placez l&#39;oeuf dans le coquetier, avec le côté marqué vers le haut. </li><li> Abaisser le niveau de la CAM en enlevant deux ml d&#39;albumine à travers une aiguille de calibre 18 insérées à la pointe de l&#39;œuf. Si l&#39;aiguille est émoussée après perforation plusieurscoquilles d&#39;œufs, remplacer l&#39;aiguille. Si non, trop de force doit être exercée, ce qui entraîne des dommages au jaune d&#39;œuf ou d&#39;une fracture de la coquille. Parfois l&#39;aiguille est bloqué par le chalazes, l&#39;un des 2 bandes spirales suspension le jaune dans l&#39;albumen. Ceci peut être résolu en poussant doucement le piston vers le bas jusqu&#39;à ce que le bloc est résolu. Si le jaune d&#39;oeuf est aspiré dans la seringue, remplacer l&#39;aiguille ainsi que la seringue. Parfois, l&#39;embryon meurt après cet événement. Si une quantité insuffisante d&#39;albumine est enlevé, la CAM sera endommagé lors de la coquille est enlevée. </li><li> Appliquer un film adhésif semi-perméable sur le côté supérieur de la coquille marquée afin d&#39;empêcher déversement de particules de coquille sur la CAM en coupant la fenêtre. </li><li> Faire un trou de mise en place d&#39;un petit poinçon à la surface de l&#39;oeuf. </li><li> Couper une fenêtre de 1 cm 2 dans la coquille, à l&#39;aide d&#39;une paire de ciseaux chirurgicaux pointus stériles. </li><li> Cœur battant de l&#39;embryon et les vaisseaux adjacents peuvent être observés à thsurface de e du jaune d&#39;oeuf. Retirez les œufs non fécondés ou d&#39;embryons morts. Un aspect interrompu des vaisseaux sanguins caractérise embryons morts. </li><li> Joint d&#39;étanchéité de la fenêtre avec un film adhésif semi-perméable. Il n&#39;est pas nécessaire de couvrir le site de ponction, à moins que la coquille a craqué lors de l&#39;insertion de l&#39;aiguille. </li></ol> 3. Procédure de vaccination Durée: ± 1 h par lignée cellulaire Le poussin embryonnaire jour 9 développement, les œufs sont inoculés sous flux d&#39;air laminaire. Evaluation de cellule cancéreuse la diffusion à travers la CAM nécessite confinement des cellules à une surface limitée lors de l&#39;inoculation. Matrigel est une matrice (ECM) gel extracellulaire du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm fréquemment utilisé dans des conditions de culture de cellules expérimentales. Il s&#39;agit d&#39;un liquide lorsqu&#39;il est refroidi, mais subira une polymérisation thermiquement activé lorsqu&#39;il est mis à 20 - 40 ° C, formant ainsi un gel stable. Au cours deles expériences, Matrigel sont conservées dans une boîte contenant de la glace fondante. Note: Nous insistons sur le fait de ne pas utiliser des lamelles perforées. Nous avons observé fixation et la croissance des cellules cancéreuses greffées sur le disque en plastique de sollicitation ainsi un potentiel de croissance des cellules sur la membrane elle-même. <ol><li> Remettre en suspension un culot cellulaire dans ECM gel refroidi à une concentration de 10 6 cellules/100 pi gel ECM. Conserver cette solution sur la fonte des glaces. </li><li> Douanes partie de la membrane semi-perméable avec une paire de chirurgicale stérile sous flux d&#39;air laminaire. Si le film adhésif est complètement supprimé, cela se traduira par une plus grande proportion de la mortalité embryonnaire due à la contamination. </li><li> Touchez le droit CAM-dessous de la fenêtre de shell légèrement avec une tige de verre stérile, afin d&#39;enlever la couche de cellules épithéliales. Toucher la CAM avec une tige de verre stérile s&#39;avère être moins traumatisant que d&#39;utiliser un scalpel n ° 11, qui exige plus de maniabilité et d&#39;expérience. Petites hémorragies peuvent se produire. </li><li> Adding matériel tumoral. </li><li> Pour les greffes tumorales: abaissez doucement un morceau de tissu sur la CAM avec une paire de pinces stériles, sans presser. </li><li> Pour la procédure de gel ECM: Ajouter 4x 25 pi de la suspension de gel cellule-ECM à la CAM, les uns sur les autres, ce qui permet le gel ECM à polymériser entre les applications. De cette manière, une plaque adhérente contenant les cellules cancéreuses est créé. </li><li> Joint d&#39;étanchéité de la fenêtre d&#39;enveloppe à nouveau avec un film adhésif semi-perméable. </li></ol> 4. Imagerie et la récolte de la CAM Durée: 2 h pour 25 oeufs Le poussin embryonnaire jour le développement 16, les cames sont récoltés. Travaillant sous flux laminaire n&#39;est pas nécessaire. <ol><li> Agrandir la fenêtre avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Veillez à ne pas couper trop bas, sinon la CAM sera endommagé, entraînant une hémorragie des vaisseaux lésés. </li><li> Ajouter 300 - 500 pi de PBS D avec une pipette sur la secte CAMionique contenant le matériau inoculée. Si aucune des sondes fluorescentes sont utilisées, le formaldéhyde tamponné peut être utilisé car cela rend la membrane rigide, ce qui facilite la coupe de la membrane. </li><li> Faire une photographie de la came dans l&#39;oeuf à travers un microscope à fluorescence stéréo, équipé d&#39;une caméra numérique en couleurs, en utilisant à la fois la GFP ou le filtre DSR, et aucun filtre. Pour les greffes tumorales, toutes les photographies sont prises sans filtres. Éclairage par le dessus par LED est fortement recommandé lors de photographier (Figure 2). </li><li> Fiche migration des cellules de tumeur des cellules marquées. Les frontières des tumeurs peuvent être irrégulières et effilochées. Cellules épars peuvent être présents près des frontières tumorales. Dans certains échantillons, des rangées de cellules tumorales peuvent être observées (Figure 3). </li><li> Découper la membrane avec une paire de ciseaux stériles à la frontière se trouvant contre la coque. </li><li> Placez le CAM récolté dans une boîte de Pétri stérile rempli de PBS D ou tamponné pourformaldéhyde. </li><li> Faire une photographie à la fois du côté supérieur et le côté inférieur de la came, à la fois avec et sans filtre. </li><li> Placez la membrane dans un contenant étiqueté avec du formaldéhyde tamponné pendant au moins 72 heures. </li><li> Intégrer les CAM dans de la paraffine et de les préparer pour l&#39;examen histologique. Prendre soin de couper les greffes de tumeurs au centre du nodule, en s&#39;assurant que la surface de coupe est parallèle au fond de la cassette. Sinon, l&#39;interaction entre le CAM et la greffe tumorale ne sera pas visible. La même stratégie s&#39;applique à des plaques de gel ECM: la surface tournée vers la lame de coupe doit être perpendiculaire à la plaque. </li></ol> 5. L&#39;évaluation histologique Hématoxyline-éosine et Ki-67 immunohistochimie ont été effectuées pour obtenir des précisions, si nécessaire. L&#39;immunohistochimie a été réalisée sur des coupes de tissus inclus dans la paraffine fixés au formol de 3,5 pm d&#39;épaisseur, en utilisant une coloration de lames selon automatiséaux instructions du fabricant. Un anticorps monoclonal de souris primaire de Ki-67 (clone MIB-1, dilution 1/100) a été utilisé. Induite par la chaleur épitope a été réalisée en utilisant la cellule conditionné 1, et la visualisation a été réalisé avec le kit de détection DAB Universal, selon les instructions du fabricant. Déshydratation des sections de tissus a été réalisée à l&#39;aide d&#39;une colleuse automatique. Pour la SAOS2 et les lignées de cellules SW1353, le nombre de cellules Ki67-positives et Ki67 négatif nuclei/100 um 2 ont été comptés en trois zones: l&#39;une près de la frontière de la CAM, un près de la surface et un dans le centre de la plaque de gel ECM. Cette procédure a été répétée 6x pour chaque diapositive Ki-67 taché. L&#39;indice de prolifération a été déterminée pour chaque diapositive en divisant le nombre de cellules Ki67-positives par le nombre total de cellules comptées. La nécrose se définit par une perte de dispersion fine de la chromatine dans le noyau de la cellule, accompagné par fading des marges de cellules distinctes. Pour xénogreffes, la nécrose est marqué comme complet, partiel (souvent à la surface), ou absents. L&#39;infiltration de cellules tumorales dans la came est défini par l&#39;observation de cellules tumorales dans le mésoderme de la CAM, et est marqué comme étant présent ou absent. Trois points sont marqués pour le comportement de l&#39;hôte. l&#39;infiltration des fibroblastes est défini comme cellules allongées sortant du CAM et d&#39;envahir la greffe / plaque tumeur, et est marqué comme étant présent ou absent. Interposition vasculaire peut être observé comme interposition de la prolifération des vaisseaux chiches, caractérisés par la présence d&#39;érythrocytes de poulet nucléées.

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A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Chorioallantoic+membrane+(CAM)+Assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis.">Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).</li><li>Vargas, A., Zeisser-Labou&#232;be, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+and+its+chorioallantoic+membrane+(CAM)+for+the+in+vivo+evaluation+of+drug+delivery+systems.">The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model.">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).</li><li>De Wever, O., Hendrix, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+quantification+of+cancer+cell+invasion+through+collagen+type+I+matrices.">Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices.</a> International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).</li><li>Albini, A., Benelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemoinvasion+assay:+A+method+to+assess+tumor+and+endothelial+cell+invasion+and+its+modulation.">The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation.</a> Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Moment de l&#39;inoculation et la récolte Chronométrant le jour de l&#39;inoculation a été effectuée à l&#39;aide SAOS2 en gel ECM (36 CAM) et variait entre embryonnaire journée de perfectionnement 5 et 10. Avant le jour d&#39;incubation 9, le CAM a pas toujours assez grand pour soutenir le gel ECM, nous avons appliqué. A la récolte, les cellules tumorales devaient parfois être récupérés à partir de la CAM profond, et quelques échantillons de gel ECM ...

Sarcome est une tumeur rare du tissu conjonctif avec un taux de mortalité élevé dû à 1,2 résistance à la thérapie. Progrès dans la survie des patients est entravée par leur faible incidence annuelle, leur grande diversité, et le fait que les cellules de sarcome sont signalés à être difficile à la culture in vitro de 3,4. L&#39;utilisation de cellules en culture pour l&#39;évaluation préclinique de thérapie a révélé que de nouvelles molécules, apparemment actif in vitro ne reflètent pas toujours les résultats dans le contexte clinique. En outre, les aberrations du génome révélées par des tableaux d&#39;expression des gènes ne sont pas toujours en corrélation avec les caractéristiques de comportement de la tumeur chez le patient individuel 7.5. Pour tenter de résoudre ces problèmes, la médecine personnalisée a gagné en importance, ce qui se reflète dans l&#39;augmentation de la recherche de modèles de xénogreffes 8-12. Un essai in vivo a l&#39;avantage de refléter l&#39;interaction complexe entre ccellules ancer et de l&#39;environnement de tissu de l&#39;hôte dans les tumeurs solides, nécessaires à la prolifération du cancer et l&#39;invasion 13. Actuellement, nous étudions l&#39;utilisation de l&#39;essai sur la membrane chorio-allantoïdien (CAM-test) comme un modèle de xénogreffe reproductible pour le sarcome 14,15. Ce test est largement utilisé pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse tumorale 16,17. Dans la littérature, cependant, nous avons trouvé des protocoles différents pour ce test, tandis que d&#39;autres études ont observé une différence marquée de la croissance ou de l&#39;angiogenèse selon différents protocoles 18,19. Dans cet article, nous examinons l&#39;effet des conditions de la CAM-dosage variable sur le comportement des cellules en utilisant des greffes tumorales, les suspensions de cellules uniques dérivées de tumeurs et de cultures cellulaires de sarcome établies.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

Sarcome est une maladie très rare qui est de nature hétérogène, tout d&#39;entraver le développement de nouvelles thérapies. patients atteints de sarcomes sont des candidats idéaux pour une médecine personnalisée après stratification, ce qui explique l&#39;intérêt actuel pour l&#39;élaboration d&#39;un modèle de xénogreffe reproductible et à faible coût pour cette maladie. La membrane chorio poussin est un hôte immunodéprimé naturel capable de soutenir les tissus et les cellules greffées sans restrictions spécifiques à l&#39;espèce. En outre, il est facilement accessible, manipulée et imagées par stéréomicroscopie optique et fluorescence. L&#39;histologie permet une analyse plus détaillée des interactions cellulaires hétérotypiques. Ce protocole décrit en détail l&#39;in ovo greffe de la membrane chorio avec sarcome dérivés de tissus frais de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et les lignes permanentes et transitoires marqués par fluorescence établies cellules sarcome (Saos-2 et SW1353). La survie rat de poussines sont en hausse de 75%. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d&#39;infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement. Pour greffage localisé de suspensions cellulaires simples, gel ECM offre des avantages significatifs par rapport aux matériaux de confinement inertes. L&#39;index de prolifération Ki67 est liée à la distance entre les cellules de la surface de la came et de la durée de l&#39;application sur la came, celle-ci déterminant une période de temps pour l&#39;addition de produits thérapeutiques.

Évaluation de la CAM Greffes tumorales deviennent adhérentes à la CAM (figure 2A). Suspensions de cellules isolées à partir de matériaux patients présentent souvent une séché, plaque légèrement surélevée (figure 2D). Après exérèse de la CAM, marquée plissement de la membrane se produit (figures 2E et 2F). Pour les lignées cellulaires commerciaux la plaque devient plus opaque dans l...

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The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Le<em&gt; In ovo</em&gt; Chorioallantoic membrane (CAM) est greffé avec des tissus frais sarcome dérivées de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et des lignées cellulaires établies sarcome marquées par fluorescence permanents et transitoires. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d&#39;infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement.

Le<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-test comme un Xenograftmodel pour le sarcome

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

JoVE Journal

Medicine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

25.3K vues.  Ghent University Hospital. Le In ovo Chorioallantoic membrane (CAM) est greffé avec des tissus frais sarcome dérivées de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et des lignées cellulaires établies sarcome marquées par fluorescence permanents et transitoires. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d'infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Une stratégie pour identifier des mutations de novo dans les troubles courants comme l&#39;autisme et la schizophrénie

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Recherche

Médecine

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

Une méthode simple guide de vis pour intracrânienne études de xénogreffe chez la souris

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

L&#39;homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l&#39;étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and diabetic retinopathy. It was the object of this study to introduce a standardized stress model for future preclinical therapeutic testing.
Bovine retinas were prepared and perfused with an oxygen saturated standard solution, and the ERG was recorded. After recording stable b-waves, hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;m glutamate) was exerted for 45 min. To investigate the effects on photoreceptor function alone, 1 mM aspartate was added to obtain a-waves. ERG-recovery was monitored for 75 min.
For hypoxia, a decrease in a-wave amplitude of 87.0% was noted (p &#60;0.01) after an exposition time of 45 min (decrease of 36.5% after the end of the washout p = 0.03). Additionally, an initial decrease in b-wave amplitudes of 87.23% was recorded, that reached statistical significance (p &#60;0.01, decrease of 25.5% at the end of the washout, p = 0.03).
For 250 &#181;m glutamate, an initial 7.8% reduction of a-wave amplitudes (p &#62;0.05) followed by a reduction of 1.9% (p &#62;0.05). A reduction of 83.7% of b-wave amplitudes (p &#60;0.01) was noted; after a washout of 75 min the reduction was 2.3% (p = 0.62). In this study, a standardized stress model is presented that may be useful to identify possible neuroprotective effects in the future.

With this study, we introduce a standardized stress model for the isolated superfused bovine retina for future preclinical therapeutic testing. The effect of either hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;M glutamate) on retinal function represented by a- and b-wave amplitudes was evaluated.

Glutamate et hypoxie comme un modèle de stress pour la isolé perfusé vertébrés Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

La<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick chorioallantoïque membrane (CAM) Assay comme un modèle de xénogreffe efficace de carcinome hépatocellulaire

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Mise en place d&#39;un modèle de xénogreffe humain de myélome multiple dans le poulet pour étudier la croissance tumorale, l&#39;invasion et l&#39;angiogenèse

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

Acide oléique-Injection chez les porcs comme modèle pour un Syndrome de détresse respiratoire aiguë

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Abrasion épithéliale cornéenne avec oculaire Burr comme modèle pour la cornée, la cicatrisation

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...