Los autores agradecen a Angela Busta para obtener ayuda con la cría de pez cebra. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (AG-020591 de SVB y 1K08AR054835 a JJD).

Nota: todos los procedimientos relacionados con el pez cebra se deben realizar de acuerdo con las directrices, reglamentos, y las agencias reguladoras. Todos los procedimientos de uso de animales que aparecen en este artículo fueron aprobados por la Universidad de Michigan, el Comité de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA). 1. Haga sutura Loops <ol><li> Use unas pinzas para separar la sutura no estéril (USP 10/0 monofilamento de nylon, 3 capas) en tres vertientes. </li><li> Empezar a hacer un nudo doble simple en una de las cadenas. Detener antes de apretar el nudo completamente para hacer un pequeño bucle (~ 1 mm de diámetro) en lugar de un nudo. </li><li> Utilice unas tijeras para cortar el exceso de sutura de las colas de bucle. Un ejemplo de un bucle terminado se muestra en la Figura 1. </li><li> Coloque el lazo en el lado adhesivo de un Post-it para su uso posterior. Los lazos de sutura se utilizan para mantener las larvas en su lugar durante la prueba de fuerza. </li><li> Repita los pasos 1.1 a 1.4, según sea necesario. Make dos bucles de sutura para cada larva que se pondrá a prueba. </li></ol> 2. Haga Solución Pruebas <ol><li> Hacer solución Tyrodes mediante la adición de 7,977 g de cloruro de sodio, 0,373 g de cloruro de potasio, 0,265 g de cloruro de calcio dihidrato, 0,102 g de hexahidrato de cloruro de magnesio, 0,048 g de fosfato de sodio monobásico, 1,000 g de bicarbonato de sodio, y 0,037 g de ácido etilendiaminotetraacético disódico dihidrato de la sal a 1000 ml de agua purificada. </li><li> Se agita la solución hasta que las sales se disolvieron por completo. Esta solución se puede almacenar durante un mes a 4 ° C. </li><li> Añadir 2,1 ml de 4 mg / ml tricaína, preparado de acuerdo con el Libro de pez cebra 24, a 47,9 ml solución Tyrodes y mezclar. Proteja esta solución de la luz guardándolo en una botella de vidrio oscuro o en una botella de vidrio cubierto con papel de aluminio. Esta solución debe ser almacenada a temperatura ambiente y se hizo fresco cada día. </li></ol> 3. Ate Larva Aanesthetized en Sala Experimental <ol> &lt;li&gt; Coloque el aparato de prueba (Figura 2) en el escenario de un microscopio estereoscópico. </li><li> Conecte el transductor de fuerza y ​​los cables del controlador longitud del aparato de prueba. Encienda el transductor de fuerza. Encienda el regulador de duración para que quede rígida. (Nota:.. El controlador longitud proporciona la capacidad para estirar o acortar una preparación de músculo durante una contracción Sin embargo, esta característica del regulador de duración no se utiliza en el método descrito en este documento Por lo tanto, el controlador de la longitud puede ser pensado como un accesorio rígido punto montado en un sistema de posicionamiento XYZ). </li><li> Con una pipeta de transferencia desechable, llenar la cámara experimental con solución de prueba. </li><li> Utilice pinzas para recoger un lazo de sutura por una de las colas y colgarlo en el tubo transductor de fuerza. Espera un segundo lazo de sutura en el tubo conectado al regulador de duración. (Nota: agarra un lazo de sutura en la parte curva puede doblar la sutura y cauSE que se rompa durante las etapas posteriores). </li><li> Con una pipeta de transferencia desechable, transferir una larva de pez cebra a una pequeña placa de Petri llena de solución de prueba. Espere a que el anestésico en la solución de prueba (tricaína) entre en vigor (~ 1 min). Con unas pinzas, empujar suavemente la cola y compruebe que la larva está anestesiado por la falta de tacto-evocó la natación. </li><li> Usar una pipeta de vidrio para transferir las larvas a la cámara experimental. </li><li> Por empujando suavemente la larva con unas pinzas cerradas, guiar a la porción anterior de la larva a través del lazo de sutura en el tubo del transductor de fuerza. Guía de la porción anterior de la larva a través del lazo de sutura en el tubo. Agarre ambos bucle colas de sutura con unas pinzas y tirar de ellos simultáneamente para apretar el lazo de sutura posterior al saco vitelino o vejiga natatoria (Figura 3A). </li><li> Con unas pinzas, mantenga un lazo de sutura y tirar de la cola, haciendo que la larva de girar 90 ° alrededor del tubo hasta que el lado lateral de la cara larvas arriba (Figura 3B). Si el bucle se ha reforzado lo suficiente, habrá algo de resistencia a la tracción; la larva no debe girar fácilmente. Si el bucle se aprieta demasiado, la larva no girará alrededor del tubo. </li><li> Utilizando el dispositivo de posicionamiento XYZ conectada al controlador longitud, mueva el tubo de controlador de longitud a lo largo del eje X (eje de las definiciones en la Figura 2A) y en el tronco y la cola de la larva. Deje espacio entre los extremos del tubo regulador de duración y el tubo transductor de fuerza. </li><li> Guía del lazo de sutura sobre la cola de la larva y apretar el lazo de sutura como se ha descrito anteriormente (Figura 3C). Puede que tenga que girar la parte posterior de la larva para que el lado lateral hacia arriba. Corte las colas de bucle de sutura (Figura 3D). </li></ol> 4. Posición Larva en la Cámara Experimental <ol><li> Mover la larva a una distancia apropiada desde el fondo de la cámara para asegurar el w larvamal estar dentro de &quot;trabajo a distancia&quot; de un objetivo de microscopio invertido durante los pasos siguientes. Para lograr esto, utilizar los dispositivos de posicionamiento XYZ para bajar lentamente los tubos (con larva adjunto) a lo largo del eje Z hasta que los tubos sólo tiene que tocar la parte inferior de la cámara. A continuación, elevar los tubos hasta que la larva es una distancia apropiada desde el fondo de la cámara (~ 100 micras). </li><li> Utilizando el dispositivo de posicionamiento XYZ conectada al controlador longitud, ajustar el controlador de tubo de longitud a lo largo del eje Y para alinear el eje largo de la larva con el eje largo del tubo de transductor de fuerza. </li></ol> 5. Registro de la Fuerza durante una contracción máxima Twitch <ol><li> Mueva el aparato de prueba para la etapa de un microscopio invertido. </li><li> Ajuste la temperatura de la cámara a un valor deseado. Para empezar, conectar el baño de recirculación de agua, termómetro, y controlador de temperatura para el aparato de prueba. Encienda los componentes necesarios y ajustar las configuraciones en el contr temperaturaoller hasta que el termómetro informa el valor deseado. Los datos incluidos en este artículo se recogieron a 25 ° C, pero las mediciones también se pueden realizar a temperatura ambiente o a 28,5 ° C. </li><li> Conectar los cables del estimulador para el aparato de prueba. Encienda la alimentación del estimulador pero no estimulan la larva hasta el paso 5.6. </li><li> Asegúrese de que la larva es paralelo al fondo de la cámara. A través de un objetivo de 40X, ver la parte de la larva entre los extremos de los tubos. Si paralela a la parte inferior, los dos extremos de la larva estarán en foco. Si es necesario, ajustar el tubo de transductor de fuerza a lo largo del eje Z hasta que ambos extremos están en foco. </li><li> Compruebe que la longitud larva es más corto que el óptimo. Encienda el sistema de longitud del sarcómero vídeo y girar la cámara de vídeo de tal manera que las estrías son paralelos a los lados de la trama de vídeo. Este sistema controla espaciamiento estriación mediante el análisis de las variaciones de intensidad de los píxeles a lo largo de cada fila horizontal de pixeles dentro de una región definida por el usuario de interés(ROI). Los resultados de todas las filas en el retorno de la inversión se promedian y se informaron con una frecuencia equivalente a la velocidad de fotogramas (≥ 80 s-1) video. El espaciado de estriación se utiliza como un indicador de la longitud del sarcómero. </li><li> Ajuste el microscopio para centrarse en las fibras periféricas y anote la longitud del sarcómero indicado. Si es necesario, utilizar el dispositivo de posicionamiento XYZ conectada al controlador longitud para ajustar la longitud de la larva (eje X) hasta que la longitud del sarcómero es menos que óptima (por ejemplo, 1,90 m). </li><li> Ajuste la corriente para optimizar la fuerza de contracción estimulación. Para empezar, ajustar la corriente en el estimulador a una baja magnitud (por ejemplo, 100 mA) de salida. El estimulador se puede activar de forma manual o mediante un equipo que ejecuta un programa de LabVIEW personalizado. Provocar una contracción de los músculos de larvas con un impulso de corriente de 0,2 mseg de duración. </li><li> Utilice un osciloscopio para registrar la salida de la fuerza y ​​medir la fuerza de contracción máxima utilizando los cursores del osciloscopio. Aumente la corrienteen incrementos de 50 mA y medir la fuerza de contracción máxima en cada nivel de curso. Espere 30 segundos entre las contracciones para evitar la fatiga. Como aumenta la corriente de estimulación, la fuerza de contracción pico típicamente aumenta hasta un máximo y luego disminuye gradualmente. La corriente a la cual la larva genera la fuerza más grande es la corriente de estimulación óptima. Ajuste la amplitud de la corriente a la corriente de estimulación óptima. </li><li> Utilizando el dispositivo de posicionamiento XYZ, ajustar la longitud de la larva (y por lo tanto, la longitud del sarcómero) a fin de obtener la máxima fuerza de contracción. Larvas de pez cebra de tipo salvaje (3-7 dpf) generar la máxima fuerza de contracción del sarcómero en longitudes de 2,10 m o 2,15 micras. Sin embargo, la longitud del sarcómero se puede ajustar a 2,08 micras para evitar el exceso de tensión en la larva. </li><li> Provocar una contracción de los músculos de las larvas. Utilice el osciloscopio para registrar la respuesta de la fuerza y ​​guardar el registro para su posterior análisis. </li></ol> 6. Mida musculatura Dimensiones con Larva en Optimal Longitud <ol&gt; <li> Mueva el aparato de prueba de nuevo al microscopio estereoscópico. </li><li> Usando la escala ocular, medir la altura de la musculatura como se ve desde el lado. Luego, con cuidado de no cambiar la longitud de la larva, la larva bascular 90 ° con el bucle de sutura en la cola para poder ver la larva de la parte inferior. Mida el ancho de la musculatura como se ve desde la parte inferior. Tome las medidas en un punto de referencia anatómica (por ejemplo, apertura urogenital) (Figura 4). </li><li> Cortar los lazos de sutura con un microcuchilla para liberar la larva del equipo de prueba. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este método mide la generación de fuerza durante una contracción para evaluar la función muscular en los músculos del tronco de larvas de pez cebra. Aunque las contracciones tetánicas pueden ser provocados en larvas de pez cebra (por ejemplo, por 200 pulsos de estimulación / seg para una duración de 0,2 segundos), la fuerza tetánica máxima es sólo un 10-15% mayor que la fuerza máxima de contracción. Por lo tanto, la fuerza generada durante un tic es una medida razonable de la capacidad de generación de fuerza. Twitches se prefieren sobre las contracciones tetánicas debido a contracciones nerviosas son menos propensos a causar que rasga o se deslice en los lazos de sutura. Con el fin de generar datos significativos con esta técnica, la máxima fuerza de contracción se debe lograr para cada larva y la variabilidad entre los grupos experimentales debe reducirse al mínimo. Con estos objetivos en mente, ofrecemos las siguientes sugerencias. En primer lugar, tenga cuidado al atar la larva al transductor de fuerza y ​​los tubos del regulador de longitud. Si los bucles de sutura se aprietan demasiadomucho, la sutura se corte a través del tejido muscular. Si los bucles de sutura no se aprietan lo suficiente, la fuerza generada por la larva no será totalmente transmitido al transductor de fuerza. Ambas situaciones, pero sobre todo este último, subestiman la fuerza máxima de contracción. En segundo lugar, dado que las pruebas múltiples grupos experimentales pueden tardar varias horas (20-30 min / larva), alternan entre grupos porque las larvas continuará desarrollando durante el periodo de prueba. Mientras que algunos de los equipos mencionados es esencial para la medición de la fuerza máxima de contracción (por ejemplo, transductor de fuerza, estimulador de corriente), otros artículos no son absolutamente necesarias. El sistema de la longitud del sarcómero vídeo es deseable, pero no necesario. Como una alternativa, una serie de contracciones nerviosas se puede utilizar para encontrar la longitud óptima, durante el cual la longitud de la larva se ajusta hasta que se consigue la máxima fuerza de contracción. Un sistema de control de la temperatura también no es absolutamente necesario. El control de temperatura es crítico cuando measuring cinética de contracción, que son altamente sensibles a la temperatura, mientras que la máxima fuerza de contracción no es particularmente sensible a pequeños cambios en la temperatura y se puede medir a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que, independientemente de la temperatura en la cámara durante la prueba de fuerza, las larvas debe mantenerse a la temperatura óptima de crecimiento de 28,5 ° C 24 antes de forzar a las pruebas para la estadificación precisa. Las larvas se ponen a prueba en una solución que contiene Tyrodes tricaína. Utilizamos 0,02% (w / v) tricaína, la concentración recomendada para la anestesia 24, para eliminar las contracciones espontáneas evocadas por el sistema nervioso y por lo tanto prevenir la fatiga durante las pruebas de fuerza. Tricaína también facilita el paso para atar y reduce el tiempo total de prueba. Sin embargo, se observa que la inclusión de tricaína en la solución de prueba se reduce constantemente la fuerza máxima de contracción en un 30%. Un efecto similar se ha observado también en el músculo cola de renacuajo, donde tricaine reduce la generación de fuerza después de que se bloquea la transmisión neuromuscular, lo que sugiere que tricaína tiene un efecto directo sobre el músculo 25. Tricaína puede reducir la excitabilidad de las células musculares mediante la reducción de la conductancia de sodio a través de la membrana de la célula, como lo hace en las células nerviosas 26. Otras opciones para el bloqueo de la activación de las neuronas motoras son d-tubocurarina y α-bungarotoxina pero, a diferencia de tricaína, estos compuestos no son la piel permeable y deben ser inyectados directamente en la cabeza, la médula espinal, o del corazón 27. Investigadores individuales tendrán que evaluar si tricaína es conveniente para su aplicación específica. Si tricaína se incluye en la solución de prueba, la concentración debe ser consistente entre los experimentos y los investigadores deben verificar que el efecto de la tricaína no varía entre los grupos experimentales. Se describe este método para las larvas de tan sólo 3 dpf y tan viejo como 7 dpf. Aunque las fibras musculares parecen ser functional tan pronto como 17 horas después de la fertilización, cuando los movimientos espontáneos comienzan cola 27, la corta longitud de la cola antes de 3 dpf impide atar la larva para el equipo de prueba. Por lo general no probamos larva después de 7 dpf ya que muchos modelos de enfermedad no sobreviven mucho más tiempo esta vez. Si las pruebas larvas allá 5 dpf, las larvas deben ser alimentados. Hemos observado que las larvas sin alimentar tienen los músculos más pequeños y genera menos fuerza máxima de contracción de las larvas alimentadas, probablemente debido a la disminución de saco vitelino. Por lo tanto, puede ser deseable para probar las larvas entre 3-5 dpf, para evitar la variable adicional de alimentación externa. En resumen, se describe un método cuantitativo y fiable para medir la generación de la fuerza durante una contracción contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Este método se puede utilizar para evaluar la salud general de los músculos de larvas de pez cebra y proporciona específicamente información sobre la función muscular. Además de proporcionar información acerca de lamagnitud de generación de la fuerza, esta técnica se puede utilizar para estudiar la cinética de generación de la fuerza o ser adaptado para estudiar la fatiga muscular 22. Aunque se describe esta técnica para su uso con larvas de tipo salvaje, este método se puede utilizar para las larvas modificado genéticamente o para larvas tratadas con los medicamentos o las sustancias tóxicas, para caracterizar modelos de enfermedades musculares y evaluar los tratamientos, o para estudiar el desarrollo muscular, lesión muscular, o muscular relacionada con la toxicidad química.

Joven pez cebra (Danio rerio) larvas, 3-7 días después de la fertilización (dpf), se reconoce cada vez más como un organismo útil para la investigación del músculo esquelético. Las larvas jóvenes se utilizan para modelar la enfermedad del músculo humano 1-9, evaluar medicamentos y estrategias terapéuticas 10-11, estudio lesión muscular 12, entender el desarrollo muscular 13-16, e investigar muscular relacionada con la toxicidad química 17-19. Los estudios típicos en estas áreas examinar el grado en el que el músculo sano se representa anormal por manipulación genética o la exposición a sustancias tóxicas, y algunos estudios examinan el grado en el cual el músculo anormal responde al tratamiento. Crítico para el éxito de estos estudios es la capacidad para evaluar con precisión la salud del músculo. Mientras que hay una variedad de métodos disponibles para evaluar la salud del músculo en larvas de pez cebra, pocos proporcionan información directa sobre la función muscular. Salud muscular generalmente es evaluada por appearance, según la evaluación de la tinción histológica 6,8,11, inmunotinción 9,15,16,18, microscopio óptico 3,13, microscopía electrónica 3,4,14,16 o birrefringencia 7,9,11, pero estas técnicas proporcionan información morfológica solamente. Tronco y desplazamientos cola y velocidad de nado 4,17 evaluar la función motora, pero éstas no son medidas directas de la función muscular, ya que también reflejan la entrada de los nervios, el metabolismo energético, y otros procesos. En contraste, la medición de generación de la fuerza durante la contracción proporciona una evaluación directa de la función muscular y representa una medida de la salud del músculo general. Los beneficios adicionales de este enfoque incluyen el análisis de datos sencilla y los resultados cuantitativos. En este artículo de vídeo, se proporciona un procedimiento detallado para medir la generación de fuerza por parte de los músculos de las larvas, con la esperanza de que más investigadores utilizarán este método para complementar las medidas existentes de salud del músculo en sus investigaciones. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; El objetivo general de este método es medir la generación de fuerza durante la contracción de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Para lograr este objetivo, una larva de pez cebra se anestesia y se colocaron en una cámara llena con una solución de sal. El extremo anterior de la larva está ligado a un transductor de fuerza y ​​el extremo posterior de la larva está ligado a un controlador de longitud. La activación del músculo se logra por la estimulación de campo eléctrico, y la corriente de estimulación y la longitud de la larva se ajusta para producir la máxima fuerza de contracción. Una contracción contracción isométrica y se provoca la respuesta de la fuerza se registra para el análisis. Para que quede claro, esta técnica no mide las fuerzas generadas por los músculos de larvas durante la natación. Debido a que ambos extremos de la larva se atan a los equipos y porque la larva permanece anestesiado, que no pueden iniciar el movimiento durante la prueba. Por otra parte, la estimulación de campo se activa todas las fibras musculares al mismo tiempo para inducir una BILcontracción ateral, que no es lo que naturalmente se produce 20. Por lo tanto, en lugar de medir las fuerzas reales generados durante la natación, esta técnica determina la capacidad de generación de la fuerza de los músculos de las larvas. Hemos usado esta técnica para demostrar la debilidad muscular en un modelo de pez cebra de nemalínica miopatía 21, así como para evaluar el efecto del tratamiento antioxidante sobre la función muscular en un modelo de pez cebra de la enfermedad de múltiples MiniCore 22. Otros han utilizado una técnica similar 23 para examinar los efectos de un contaminante del medio ambiente sobre la función muscular 19.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonsterile-suture</td>
			<td>Ashaway Line &amp; Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td>USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vannas</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td>Illuminated with Fostec EKE ACE I light source</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>400A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Length controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>318B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>XYZ positioning devices</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Cut end to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-11YZ </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Axiovert 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Water bath circulator</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Alpha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>701C</td>
			<td>High-power, follow stimulator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Video sarcomere length system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>900B-5A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Nicolet Technologies</td>
			<td>ACCURA 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-13</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data analysis software (Signo)</td>
			<td>Alameda Applied Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae

Larvas de pez cebra proporcionar modelos de desarrollo muscular, enfermedades musculares y los músculos relacionados con la toxicidad química, pero los estudios relacionados a menudo carecen de las medidas funcionales de la salud muscular. En este artículo de vídeo, se demuestra un método para medir la generación de la fuerza durante la contracción de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Mediciones de la fuerza se llevan a cabo mediante la colocación de una larva anestesiados en una cámara llena con una solución de sal. El extremo anterior de la larva está ligado a un transductor de fuerza y ​​el extremo posterior de la larva está ligado a un controlador de longitud. Una contracción contracción isométrica se provoca por la estimulación de campo eléctrico y la fuerza de respuesta se registra para el análisis. Generación de la fuerza durante la contracción proporciona una medida de la salud muscular general y establece específicamente una medida de la función muscular. Aunque se describe esta técnica para su uso con larvas de tipo salvaje, este método se puede utilizar con larvas modificado genéticamente o con larvas tratadas con los medicamentos o las sustancias tóxicas,para caracterizar modelos de enfermedades musculares y evaluar tratamientos, o para estudiar el desarrollo muscular, lesión o toxicidad química.

En las larvas de pez cebra de tipo silvestre sano, las fibras musculares deben estar paralelos el uno al otro sin grandes espacios entre ellos y tienen estrías evidentes (Figura 5A). Larvas de pez cebra de tipo salvaje que no presentan estas características, o con daños evidentes, tales como fibras separadas (Figura 5B), debe desecharse. Un gráfico representativo de la fuerza de contracción pico frente a la corriente para una sola larva de pez cebra estimulación se muestra en la Figura 6. Para las larvas de pez cebra de tipo salvaje entre 3-7 dpf, la corriente de estimulación óptima es normalmente entre 400-600 mA, con 3 larvas dpf generalmente requiere una mayor corriente de larvas dpf 6-7 estimulación. Los datos de la fuerza primas (recogidas durante el paso 5.8) tiene que ser procesados ​​y analizados con el software de análisis de datos. En primer lugar, la línea de base del registro de la fuerza se establece en cero. En segundo lugar, la salida de tensión del transductor de fuerza se convierte a la fuerza (mN) (ver las instrucciones del fabricante para generar una curva de calibración para el transductor de fuerza). Una respuesta de fuerza representativa recogida durante una contracción contracción máxima de una sola larva se muestra en la Figura 7. Software de análisis de datos se puede utilizar para medir el pico de fuerza y ​​otras características de la respuesta de la fuerza. Un conjunto representativo de datos de la fuerza pico de las contracciones de contracción máxima se muestra en la Figura 8A. Valores de la fuerza de contracción máximas típicas de 3-7 variedad de tipo salvaje larvas dpf 0,9 a 1,7 mN, con larvas mayores generar más fuerza que las larvas jóvenes. Las diferencias en la fuerza de contracción pico puede ser debido a los procesos normales como el crecimiento y el desarrollo (Figura 8) o procesos anormales, tales como mutación del gen relacionado con la patología 21,22. La normalización por área de sección transversal del músculo (CSA) se puede utilizar para determinar el grado en que las diferencias en la fuerza de contracción máxima son simplemente debido a diferir<html> rencias en tamaño de la musculatura 21,22. CSA muscular puede ser estimada mediante la fórmula: CSA = π (A / 2) (B / 2), donde A es la altura de la musculatura como se ve desde el lado, B es la anchura de la musculatura como se ve desde la parte inferior, y se asume una sección transversal elíptica. Los valores típicos para CSA 3-7 rango larvas dpf de tipo salvaje 0,027 a 0,034 mm 2, con larvas dpf generalmente 3-4 muestra los valores CSA menores de larvas dpf 5-7. Un conjunto representativo de datos de la fuerza de pico normalizadas de contracciones máximas de contracción se muestra en la Figura 8B. Los valores típicos normalizados pico de contracción de fuerza para 3-7 rango de tipo salvaje larvas dpf 34-51 mN / mm 2, con 4-7 larvas dpf general muestra valores superiores a 3 larvas dpf. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig1.jpg" /> Figura 1. Lazo de sutura. Flechas apuntan a las colas de bucle de sutura. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2.jpg" /> Figura 2. (A) un aparato de pruebas con componentes etiquetados. (B) vistas Close-up de la cámara experimental. (A) de la cámara experimental con fondo transparente. (B) transductor de fuerza. (D) dispositivos de posicionamiento XYZ (c) regulador de duración.. La X, Y, y Z se definen en la esquina superior derecha. (E) Sistema de control de temperatura que utiliza módulos termoeléctricos. Tubería acomoda el flujo de agua para la refrigeración de los módulos termoeléctricos. (F) de tubo de acero inoxidable unido a la fuerza transductor. (G) de tubo de acero inoxidable conectado al controlador longitud. (H) microsonda Termómetro (i). Platino electrodos de placas paralelas, que abarca la longitud de lacámara. Placas de platino son de 2,5 mm de alto y 0.255 mm de espesor. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3.jpg" /> Figura 3. Atar larva dentro de la cámara experimental. (A) Larva ató al extremo anterior, pero aún no están girados 90 °. (B) Larva después girado 90 º. (C) Larva atado en al extremo posterior, pero aún no giró. (D) Larva después girados y sutura colas bucle se recortan. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4.jpg" /> La Figura 4. Medidas para la estimación de área de sección transversal. Musculatura visto desde la (A) y lateral (B) </strong&gt; fondo. La colocación de las barras rojas indican la localización de la abertura urogenital. La longitud de las barras rojas indican la altura y la anchura de la musculatura, visto desde el lateral e inferior, respectivamente. <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5.jpg" /> Figura 5. Vista lateral de larvas de pez cebra musculatura del tronco. (A) el tejido sano. (B) tejido con daño evidente. Las contracturas resultantes de destacamentos de fibra están marcados con asteriscos. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig6.jpg" /> La Figura 6. Gráfico representativo de la fuerza de contracción máxima frente a la estimulación actual. La corriente de estimulación óptima es de 500 mA. Figura 7. Record vigente Representante de una sola contracción contracción. Esta contracción se obtuvo con un pulso de estímulo a 0 ms. La fuerza máxima es 1,56 mN. <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8.jpg" /> Figura 8. Datos de la fuerza representativos 3-7 larvas dpf. (A) datos sobre la fuerza de las contracciones máximas de contracción máxima. (B) datos sobre la fuerza de las contracciones máximas de contracción máxima normalizaron a CSA. Las larvas más viejas (6-7 dpf) fueron alimentados Hatchfry Encapsulon Grado 0 con Spirulina (Argent Laboratories) a partir del 5 dpf. Medios + desviaciones estándar se informó con N = 5 en cada grupo. Grupos significativamente diferentes de 3 larvas dpf (*) y 4 larvas dpf (#) se indican (ANOVA, P &lt;0,05). El aumento significativo en la fuerza normalizada entre 3 y 4 dpf (B) indica un aumento en la capacidad de generación de la fuerza intrínseca durante este período de tiempo, mientras que el aumento de la fuerza entre 4 y 6-7 dpf (A) se atribuye a un crecimiento basado en ningún cambiar del 4 al 7 dpf en la fuerza normalizada.

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Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Mediciones de fuerza se pueden utilizar para demostrar los cambios en la función muscular debido al desarrollo, lesión, enfermedad, tratamiento o toxicidad química. En este vídeo, se demuestra un método para medir la fuerza durante una contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

force-measurement-during-contraction-to-assess-muscle-function

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K vistas.  University of Michigan. Mediciones de fuerza se pueden utilizar para demostrar los cambios en la función muscular debido al desarrollo, lesión, enfermedad, tratamiento o toxicidad química. En este vídeo, se demuestra un método para medir la fuerza durante una contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra.

Video: Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Investigación

Biología

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando la respuesta de optocinético para estudiar la función visual del pez cebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinyecciones intravenosa de larvas de pez cebra para el Estudio de la lesión renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage de larvas de pez cebra

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Evaluación de la función muscular del músculo extensor largo digitorum<em&gt; Ex vivo</em&gt; Y tibial anterior del músculo<em&gt; In situ</em&gt; En ratones

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

La medición de la función del músculo liso en el tejido aislado Bath-aplicaciones en Farmacología Investigación

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...