Name: live imaging of drosophila larval neuroblasts
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la división de investigación intramural en los Institutos Nacionales de la Salud / NHLBI (1ZIAHL006126) y un Lenfant Biomédica beca posdoctoral adjudicados a DAL.

1. Preparación de los materiales requeridos para explante Brains tercer estadio larval <ol><li> Preparar las herramientas necesarias para microdisección. <ol><li> Forjar dos herramientas de disección (un bisturí y un gancho) colocando primero un único pin de disección en cada soporte de pasador. Asegure los pasadores firmemente con la mano o con pinzas (Figura 1C). </li><li> Use un par de pinzas de edad para doblar un pin de disección para un ángulo de aproximadamente 120 °. Haga esto bajo un microscopio de disección para asegurar que la mitad superior de la espiga quede plana cuando el soporte de pasador se mantiene en su mano. Esta herramienta se utilizará como un bisturí para sujetar o cortar a través del tejido. </li><li> Use un par de pinzas de edad para doblar el segundo pasador en forma de gancho que se utiliza para mantener y raspar el tejido. </li><li> Cubra cada herramienta de disección con una punta de pipeta para proteger las herramientas de deterioro. Con cuidado, herramientas bien formados pueden ser utilizados para la disección de forma indefinida. Reemplace los pins dañados o deformados según sea necesario. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Preparar la disección de medio. <ol><li> En una campana de cultivo de tejidos, diluir el suplemento antibiótico-antimicótico en medio de cultivo de la Schneider. Agitar los medios para incorporar el suplemento. </li><li> Prepare varias alícuotas de 5 ml de los medios suplementados. Guarde todos los medios a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. </li><li> Calentar una alícuota de 5 ml de medio suplementado a temperatura ambiente. Dibuje el medio en una estéril jeringa de 5 ml y el tornillo en un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril. </li></ol></li><li> Seleccione larvas para la disección. Utilice una sonda de disección para seleccionar arrastrándose larvas de tercer estadio como el cerebro será más fácil de diseccionar. Opcional: las larvas se depositan sobre una placa de agar de uva. Nota: No utilizar los viales o frascos excesivamente concurridos con &quot;alimentos húmedos&quot;, ya que estos tienden a forzar segundos o larvas de primer instar a gatear antes de tiempo. Nota: Algunos antecedentes genéticos requerirán el uso de larvas de menos. Esto no afecta el protocolo, pero hace que el dissection más difícil. </li></ol> 2. Disección del Sistema Nervioso Central <ol><li> En una sola lámina de vidrio, cree dos piscinas de 50 ml de medios de disección cálidos separadas por unos 3 cm. Una de las piscinas será utilizada para la disección bruto y otra utilizada para la disección fina (Figura 1C). </li><li> Transferir varios larvas a una de las gotas de medios de comunicación. </li><li> Mueva el cubreobjetos con larvas a un microscopio de disección. Zoom en la piscina que contiene las larvas de tal manera que los extremos anterior y posterior de las larvas son discernibles. </li><li> Use un par de pinzas para agarrar la región media de una sola larva. Tome un segundo par de pinzas en la otra mano y agarrar la larva cerca de la misma región. Tire de los dos pares de pinzas, aparte de romper suavemente la larva en el medio. Repita los dos pasos anteriores para todas las larvas en el cubreobjetos. </li><li> Deshágase de las mitades posteriores del cuerpo de la larva, transfiriéndolos a un tejido. </li><li> Zoom en una larva por lo que thmouthhooks anteriores correos son claramente visibles. Utilice ambos pares de pinzas para crear una pequeña incisión, o muesca, en lados opuestos de los mouthhooks de larvas entre la tercera y la primera torácica bandas denticle anteriores. </li><li> Agarre las mouthhooks con las pinzas en la mano no dominante. Utilice las pinzas en la otra mano para que despegar la cutícula en una dirección antero-posterior a. Continuar para pelar lentamente cutícula hasta el sistema nervioso central está expuesto. </li><li> Aislar el sistema nervioso central del resto de la larva por desgarro tejidos con los fórceps. Tenga cuidado de no alterar el sistema nervioso central. Paso crítico: No tire en el sistema nervioso central! Desechar las muestras dañadas con un cable roto ventral del nervio (Figura 2A) o lóbulos ópticos distorsionadas (Figuras 2B y 2B &#39;). </li><li> Repita los dos pasos anteriores para todas las larvas en el cubreobjetos. Transferir el tejido explantado saludable para lasegunda piscina (limpia) de media sobre el portaobjetos para la etapa de la disección fina. </li><li> Utilice las herramientas de pasador de disección para limpiar los tejidos periféricos (por ejemplo, los ojos, las alas y las piernas discos) desde el cerebro. Deslice el bisturí entre la quería (cerebro) y el tejido no deseado, sujetando el tejido conectivo del cubreobjetos. Utilice el gancho para embromar suavemente el tejido no deseado mientras pulsa simultáneamente el bisturí para el cubreobjetos en los movimientos de sierra similares. </li><li> Paso crítico: Trabaje despacio y deliberadamente para eliminar todos los discos de cada cerebro. Tenga cuidado de no alterar la morfología del cerebro. Un cerebro saludable tendrá un cordón ventral del nervio intacto y simétrico, lóbulos ópticos redondos (Figura 2C). </li></ol> 3. Montaje Brains explantado para imágenes en vivo <ol><li> Invierta una placa de cultivo de gas permeable 50 mm con la película clara hacia arriba (Figura 2D). Presione la jeringa para depositar una pequeña gota (aproximadamente 30 l) de medio sobre tél centro del plato. </li><li> Transfiera los cerebros aislados, uno a la vez, a la gota de medio en el plato. Utilice la herramienta de gancho para sacar un cerebro debajo de los lóbulos ópticos. Por otra parte, el uso de fórceps para agarrar los axones que se proyectan desde el cordón nervioso ventral. </li><li> Recoger 5-10 cerebros en la gota de medio. Sumerja el cerebro mediante el uso de las herramientas de pasador de disección para empujar los cerebros individuales a la parte inferior de la gota de medio ya que muchos de ellos serán atrapados en el menisco (Figura 2E). </li><li> Orientar los cerebros utilizando las herramientas pin de disección para alinear cerebros dependiendo de la RN en ser fotografiado (Figura 3A). Para la imagen de la RN dorsal, coloque el cordón nervioso ventral hacia abajo (a lo largo de la membrana). Para la imagen de las NBS-Antério ventral, ponen el cerebro con el cordón nervioso ventral hacia arriba (alejándose de la membrana). Alinear los cerebros de tal manera que todos los cordones nerviosos ventrales apuntan en la misma dirección dentro del plano XY. </li><li> Utilice una jeringa o de transferencia de plástico pipette para colocar 4 halocarbonos (HC) gotas de aceite (unos 30 l cada uno) sobre la membrana permeable a los gases. El volumen de cada gota de aceite debería ser equivalentes entre sí y a la gota de medio. Espacio de las gotas de aceite para que correspondan a las cuatro esquinas de un cubreobjetos centrada alrededor de la gota de medio de cultivo. Una vez completo, los cinco gotas (cuatro gotas de aceite y una gota de medio en el centro) se parecerán a las cinco facetas en estilo occidental dados (Figura 3B). </li><li> Bajar un # 1.5 22 mm cubreobjetos sobre el conjunto de tal manera que realiza todas las 5 gotas al mismo tiempo. El mantenimiento de una presión uniforme a través de las muestras reduce la probabilidad de que serán interrumpidos. Espere aproximadamente 3 min como el aceite y el medio disperso bajo el peso del cubreobjetos. Se forma una forma de cruz de los medios de comunicación (Figuras 3C y 3D). </li><li> Paso crítico: Baje el cubreobjetos sobre la superficie del cerebro, eliminando el exceso de medios usando una mecha de papel de seda (Figure 3C). Haga esto mientras ve la muestra bajo el microscopio de disección. Como se retiró el medio, el cubreobjetos bajará. Detener una vez que el cubreobjetos toca el cerebro. No se exceda en la mecha, ya que esto hará que la distorsión del tejido del cerebro o explosiones. </li><li> Si dorsal imágenes NBS (Figura 3E), se mueven al paso 3.9. Si de formación de imágenes NBS-Antério ventral, el cubreobjetos se debe mover ligeramente (por suavemente empujándola con fórceps) en la dirección de las puntas de cordón nervioso ventral. Esto hace que el cerebro para girar, lo que trae los lóbulos cerebrales en contacto directo con el cubreobjetos para facilitar la formación de imágenes (Figura 3F). </li><li> Sellar la cámara rodeando el cubreobjetos con pequeñas cantidades de aceite de halocarbono (Figura 3D). El exceso de aceite de la exudación de los cubreobjetos debe reducirse al mínimo y borró de distancia con un pañuelo de papel. </li></ol> 4. Imágenes en vivo de Central Brain neuroblastos Nota: Para este trabajo, un hilado de disco Nikon Eclipse Timicroscopio confocal (microscopio invertido) se utilizó para la formación de imágenes en vivo; detalles de nuestra instalación se han publicado previamente 31. Alternativamente, la muestra puede ser reflejado usando un sistema en posición vertical. <ol><li> Añadir una gota de aceite de inmersión para el cubre justo por encima de los cerebros montados. Esto ayudará a centrar el objetivo directamente sobre la muestra. </li><li> Paso crítico: Mantener el cerebro a una temperatura constante de 25 ° C con una incubadora de etapa. Coloque suavemente la muestra montada en la incubadora escenario y cubrir la cámara con su tapa. </li><li> Localice RN centrales del cerebro con luz transmitida, centrándose en las células grandes y redondos que residen en las zonas central y medial de los lóbulos ópticos y no utilice epi-fluorescencia. Esto se hace más fácil con la práctica. Es muy importante para exponer la muestra a la menor cantidad de luz posible. No pierda tiempo cerebros de imágenes que se encuentren dañados. </li><li> Una vez en su lugar, tomar exposiciones rápidas utilizando el confocal paradeterminar la ubicación y profundidad adecuada. Límite de profundidad a la primera 10-15 micras. Ajuste según sea necesario, y tomar otra imagen de prueba. <ol><li> Paso opcional: Se recoge una película de prueba del cordón nervioso ventral para asegurar que no hay deriva xy. Si se detecta la deriva, espere 15-30 minutos para la muestra a un acuerdo. Si la tendencia no se asienta en 30 min, preparar una nueva muestra. Major deriva generalmente se remonta a la adición de un exceso de aceite, o el tamaño desigual de aceite cae durante el montaje. </li></ol></li><li> Para eliminar la deriva axial (z-drift) utiliza un dispositivo de enfoque automático continuo que utiliza un LED infrarrojo. Alternativamente, corregir manualmente el plano focal. </li><li> Una vez que se identifica una Nota de interés, continuar con el régimen de formación de imágenes. Al igual que con todas imágenes de células vivas, la cantidad de luz láser, tiempo de exposición, la cámara hurgar en la basura, aumento del objetivo, el tiempo y / o el intervalo z pasos deben ser todas empíricamente optimizado para un experimento en particular para responder a la cuestión que nos ocupa. El objetivo es reducir al mínimo la presa luzedad, mientras que todavía la recogida de datos útiles. Véase la discusión para orientación adicional. <ol><li> Imagen de todo el volumen de la NB mediante la recopilación de 12-14 imágenes espaciados por 1 m en el eje z. Ajuste la resolución de tiempo para capturar los ciclos de células individuales o múltiples de la misma NB. Como regla general, utilice intervalos de 10-30 seg para la imagen única del ciclo celular y de 1-3 minutos durante varios ciclos celulares. </li></ol></li><li> Paso crítico: Confirme que la muestra es saludable mediante el control de la duración de la mitosis. Si mitosis tarda más de 15 minutos, pasar a otro cerebro. Un cerebro sano mostrará muchas notebooks en el mismo campo de visión de someterse a varias rondas de mitosis. Tenga en cuenta que cada ciclo celular es ligeramente más larga que la anterior debido a daño de la luz. </li><li> Una vez que la imagen está completa, desmontar la cámara de incubación, y desechar todo, pero los platos de cultivo permeables al gas. Enjuague la superficie del plato de cultivo con 95% de etanol y limpie bien con un pañuelo de papel. Repita dos veces más. </li&gt; </ol> 5. Preparación de Brains por inmunofluorescencia <ol><li> Recoger 20 o más explantados cerebros en un tubo de 1,5 ml que contiene aproximadamente 0,2 ml de medio suplementado. </li><li> Retire medio del tubo y enjuague cerebros una vez con 0,5 ml de PBSTx (salina tamponada con fosfato, PBS, con 0,3% de Triton X-100). Deje cerebros se depositan en el fondo del tubo entre todos los intercambios de líquido. El detergente de Triton X-100 se utiliza para permeabilizar el tejido. El enjuague normalmente toma menos de 30 segundos; basta con quitar el PBSTx una vez cerebros se han asentado en el fondo del tubo. </li><li> Reemplace la solución con 0,5 ml de un 9% de electrones paraformaldehído grado microscopía diluido en PBSTx. Incubar con nutación durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Deshágase de fijador de acuerdo a las regulaciones de desechos peligrosos. </li><li> Lavar las muestras con 0,5 ml de PBSTx durante 15 min. Repita el paso de lavado con PBSTx fresca dos veces más. </li><li> Reemplace la solución con 0,5 ml PBT (PBS, 1% Albúmina de suero bovino (BSA), y 0,1% de Tween-20). Incubar con nutación durante 1 hora a temperatura ambiente. Bloquea el unión no específica de anticuerpos contra el tejido de este paso. </li><li> Reemplazar la solución con 0,5 ml de anticuerpo primario diluido en PBT suplementado con 4% de suero de cabra normal (NGS). Incubar con nutación noche a 4 ° C. </li><li> Deseche o guardar el anticuerpo primario diluido. </li><li> Lavar las muestras con 0,5 ml de PBT durante 15 min. Repita el paso de lavado con PBT fresca dos veces más. </li><li> Reemplazar la solución con 0,5 ml de PBT modificado (PBS, 2% de BSA, 0,1% de Tween-20, y 4% de NGS). Incubar con nutación durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Reemplace la solución con 0,5 ml de anticuerpo secundario diluido en PBT modificado. Incubar con nutación durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Reemplazar la solución con 0,5 ml de PBST (PBS con 0,1% de Tween-20). Incubar con nutación durante 15 min a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado con PBST fresca dos veces más. </li></ol><ol><li> Transferir cuidadosamente las muestras como una gota en un portaobjetos de vidrio, la restricción de la caída hacia la izquierda del centro de la corredera. </li><li> Añadir una gota grande (alrededor de 2 cm de diámetro) de medio de montaje (por ejemplo, Aqua-Poly/Mount) al centro de la corredera. Evitar la piscina de PBST que es hacia la izquierda. </li><li> El uso de fórceps para transferir los cerebros de la piscina de PBST a la piscina de medio de montaje. Adición de medio de montaje directamente sobre el cerebro puede alterar su orientación y se debe evitar. </li><li> Bajo un microscopio de luz, disponer las muestras en el medio de montaje con la parte que será reflejado hacia arriba. </li><li> Con el portaobjetos bajo el microscopio de luz, baje lentamente un cubreobjetos de vidrio # 1.5 en la parte superior de las muestras. Paso opcional: Desalojar las burbujas de aire de menor importancia presionando ligeramente sobre el cubreobjetos. </li><li> Dejar que el medio de montaje para polimerizar durante varias horas, o durante la noche, por las diapositivas que miente completamente, la luz-protegida, a temperatura ambiente. </li><li> Los portaobjetos pueden tomarse imágenes al día siguiente, o se almacena antes de la imagen. </li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Imágenes de células vivas es un enfoque inestimable utilizado para estudiar los mecanismos que regulan ACD de las células madre, la diferenciación de los linajes de células, y la morfogénesis de tejidos complejos. Aunque los grupos de investigación han utilizado históricamente una variedad de técnicas para visualizar NB ACD, estos enfoques pueden ser generalmente se agrupan en dos categorías que difieren principalmente con respecto a si el tejido cerebral se deja intacta o disociado. <p class="jove_content...

Las células madre mantienen un equilibrio de la diferenciación y autorrenovación para generar diversidad celular durante el desarrollo temprano y reemplazar las células dañadas en los tejidos adultos. Reglamento de esta homeostasis impide que tanto la pérdida como la expansión excesiva de la población de células madre, lo cual puede resultar en la degeneración del tejido perjudicial o tumorigénesis. Los neuroblastos (NBS) son las células madre neurales ampliamente estudiadas del sistema nervioso central de Drosophila (Figura 1A) que primero forma durante las etapas embrionarias 1, 2. RN sometidos a rondas repetidas de división celular asimétrica (ACD) para producir dos células desigual predestinados: una célula madre de autorrenovación y diferenciación celulares. ACD es guiado por centrosomas, los orgánulos no membranosos que actúan como los centros de organización de microtúbulos de la mayoría de las células 3. Durante la mitosis, los centrosomas NB organizan y orientan el huso mitótico bipolar a lo largo del polo apical-basaleje dad. Tras la escisión de la división de NB, determinantes destino apicales que especifican el destino de células madre, y los determinantes del destino basales que especifican la diferenciación, son segregados en las células hijas desiguales. En el cerebro central de las larvas, dos tipos de RN se pueden distinguir por su número, la posición, la expresión del factor de transcripción, y el linaje celular (Figura 1 A) 4-6. Tipo I NBS son los más abundantes, y sobre 90 de los pueblan los lados anterior y posterior de cada lóbulo óptico del cerebro 7. Estos NBS expresan el factor de transcripción Asense (ASE), y que característicamente se dividen en una auto-renovación NB y uno ganglio de células madre más pequeña (GMC; Figura 1B). Cada GMC se somete a una sola división de terminal para generar dos neuronas o la glía (Figura 1B). Por el contrario, los RN ocho de tipo II que pueblan la parte posterior de cada lóbulo óptico carecen Ase expresión 5. Se someten a ACDpara producir un auto-renovación NB y uno progenitoras neurales intermedio (INP). El INP, a su vez, divide asimétricamente tres a cinco veces. Cada una de estas divisiones resultados en la regeneración de la INP y la producción de un solo GMC 4. En conjunto, la identidad específica NB y el orden temporal de GMC nacimiento da lugar a la diversidad neuronal asombrosa del sistema nervioso central adulto. La comprensión de la biología celular que subyace NB ACD se ha mejorado enormemente mediante el uso de técnicas de imágenes de células vivas. Publicado protocolos utilizados por los investigadores a imagen RN vivos varían ampliamente. En general, sin embargo, estos métodos se pueden agrupar en dos categorías generales que se distinguen por si el cerebro de larvas se deja intacta o mecánicamente disociado. Ambas técnicas tienen ventajas y desventajas, dependiendo de la solicitud del investigador. Los primeros informes que revelan vivo división celular NBnes implican algún grado de disociación manual de la cerebro de larvas. Estos protocolos de detalle se corra 8 o burlas aparte 9 del cerebro para crecer cultivos primarios a corto plazo de la RN sobre cubreobjetos de vidrio. Para mejorar la imagen, las NBS redondas son generalmente aplanados en los cubreobjetos, ya sea con placas de vidrio 8 o almohadillas de agarosa 9. Aunque las células aplanadas han mejorado la óptica, estas técnicas conducen a menudo a defectos mitóticos NB, incluyendo la regresión del surco de segmentación y la incapacidad para dividir más de una vez. Por lo tanto, los protocolos que implican tanto la disociación manual y distorsión física del tejido cerebral de larvas generalmente sólo se adaptan a muy corto plazo (es decir., Ciclo de una célula o menos) aplicaciones. Del mismo modo, semi-aplastamiento o aplanar completamente cerebros intactos entre las diapositivas de cristal y cubreobjetos limita el tiempo que uno puede pasar la imagen de una modelo que figura como a un período de aproximadamente 30 min 10. A pesar de esta limitación, this enfoque ha sido utilizado con éxito 11-14. Los recientes esfuerzos para vivir imagen disocian límite RN distorsión física de las células aisladas. Estas técnicas son particularmente útiles para aplicaciones en las que es necesario para mantener cultivos de células para múltiples ciclos de división celular. Por ejemplo, las células dispersas de cerebros disociados manualmente pueden estar parcialmente incrustadas en un coágulo a partir de la mezcla de fibrinógeno y trombina 15 para formación de imágenes a largo plazo 16. Alternativamente, los cerebros explantados pueden ser primero químicamente disociado con la enzima colagenasa, junto interrumpido manualmente por el paso repetido a través de una punta de pipeta, y posteriormente se sembraron en platos de fondo poli-L-lisina-revestido de vidrio 17, 18. Revestimiento de platos de vidrio, ya sea con el fibrinógeno o poli-L-lisina promueve el apego y ligera propagación de células redondas, llevándolos tan cerca del cubreobjetos posible sin distorsión importante físico. En additien adelante, estos métodos implican el cultivo de la NBS en medio que puede intercambiarse fácilmente para los experimentos de perturbación farmacológicas 18. En general, enchapado directamente dispersados ​​RN mejora óptica de imagen sin sacrificar la capacidad de imagen a largo plazo. Recientemente, un protocolo que describe el cultivo a largo plazo de NB disociada se ha detallado 19. Sin embargo, este enfoque no es sin sus limitaciones. Hay varias advertencias a las imágenes RN disociadas en vivo. En un campo de células dispersas, por ejemplo, es difícil identificar linajes NB específicos que se organizan espacialmente en el cerebro intacto 1. Del mismo modo, distinguir el tipo I frente II NB dentro del tejido disociado tipo también es difícil sin la expresión de marcadores de linaje o transgenes específicos de subtipo, tales como Worniu-GAL4, GAL80-aSENSE 20. Aunque estos transgenes son muy útiles para algunas aplicaciones, no se limitan a los investigadores a los transgenes expresionado bajo el control del elemento promotor de UAS 21 y requieren esquemas genéticos más complejos. Los estudios que se refieren al desarrollo espacial o temporal de los RN, por lo tanto, requieren de imágenes in vivo, en el contexto de un tejido intacto. Por otra parte, los estudios de NBS embrionarias disociadas indican que el contacto físico de las células adyacentes es crítica para la localización de la interfase polaridad clave determinantes 22, 23. Estos estudios muestran completamente aislado RN ya no mantener el eje del huso mitótico invariante. En su lugar, estas células presentan un eje de husillo más aleatorios y amplios ángulos de separación entre los sucesivos brotes de GMC, tal vez debido a la pérdida de posicionamiento del centrosoma apical 22. Aunque la relación entre el BNE larvales y sus células vecinas no ha sido ampliamente estudiado, vale la pena considerar que el microambiente de células madre de larvas puede incidir en la polaridad celular u otrocomportamientos. Para mantener el contexto fisiológico de larvas NBS, que la imagen de ACD a partir de cerebros enteros. Dadas las limitaciones inherentes asociados con la formación de imágenes disociadas RN, nuestro laboratorio y otros han establecido protocolos para imágenes sucesivas rondas de NB ACD de cerebros larvales enteros. Técnicas a la imagen cerebros intactos a menudo sustituyen la superficie rígida de vidrio en un lado de la cámara de cultivo con una membrana flexible para evitar la distorsión o daño de tejido y permitir el intercambio de gases. Algunos métodos implican montaje cerebros explantados en una mezcla de medio de insecto de cultivo, suero, y ácido ascórbico con los cuerpos grasos aislados de diez larvas 24. Los cuerpos grasos aislados se añaden porque secretan un mitógeno sabe que estimula la división celular NB 25. Este protocolo preserva la integridad de los tejidos durante más de 3 horas y es, por lo tanto, susceptibles de formación de imágenes a largo plazo 24, 26-28. Recientemente, un protocolo que describe la lonimágenes g plazo de cerebros larvas intactas en presencia de ácido ascórbico, suero y los órganos de grasa se ​​ha detallado 29. Es importante destacar que, debido a que el tejido está expuesto ni tampoco inmovilizado, este enfoque es menos útil para aplicaciones en las que se intercambia medio de cultivo (por ejemplo, estudios de la droga, la inmunodepleción, etc.). Nuestro laboratorio ha simplificado todo el monte de la preparación de los cerebros de larvas vivas para la imagen a largo plazo 30, 31. La principal ventaja de nuestro protocolo sobre los demás es su simplicidad: nuestras observaciones indican ni el suero, el ácido ascórbico, la insulina, ni cuerpos gordos son aditivos necesarios a imagen de rondas sucesivas de NB ACD. Aunque aditivos, tales como la insulina, han sido útiles para la formación de imágenes prolongada de divisiones celulares vástago 32 y la migración celular colectiva en los ovarios de Drosophila 33, que parecen ser prescindible para NB de ACD, como nuestro medio de formación de imágenes se compone de una mezcla simple de Standard medio de cultivo de células de insecto suplementado con antibiótico-antimicótico para evitar la contaminación. Mediante el uso de placas de cultivo de fondo permeable al gas o de vidrio reutilizables, hemos sido capaces de sostener varias rondas sucesivas de ACD NB. Las mismas muestras explantados fácilmente se pueden utilizar para inmunofluorescencia y otros procedimientos con tejido fijado. En este protocolo, detallamos la disección del cerebro de larvas intactas, así como la preparación de los cerebros para el análisis tanto en directo como fijo.

<table><tbody><tr><td>Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 &amp;#956;g/ml), and amphotericin B (25 &amp;#956;g/ml) that is added to Schneider&#039;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td></tr><tr><td>Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle/probe with plastic handle</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, 0.22 &amp;#956;m pore size</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 32% EM-grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td></tr></tbody></table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

Las células madre se dividen asimétricamente para generar dos células hijas con desigual potencial destino: una célula madre de autorrenovación y diferenciación celular. Dada su importancia para el desarrollo y la enfermedad, la comprensión de los mecanismos que gobiernan la división de células madre asimétrica ha sido un área sólida de estudio. Debido a que son genéticamente manejable y se someten a rondas sucesivas de la división celular aproximadamente una vez cada hora, las células madre del sistema nervioso central de Drosophila, o neuroblastos, son modelos indispensables para el estudio de la división de células madre. Acerca de 100 células madre neurales se encuentran cerca de la superficie de cada uno de los dos lóbulos cerebrales de larvas, por lo que este modelo de sistema particularmente útil para estudios de microscopía de formación de imágenes en vivo. En este trabajo se revisan los enfoques ampliamente utilizados para visualizar las divisiones de células madre, y nos dirigimos a las ventajas y desventajas de las técnicas que emplean disocian frente a los tejidos cerebrales intactas relativos. También detalle nuestra simplifprotocolo ied utiliza para explantar cerebros enteros de larvas del tercer estadio de imágenes de células vivas y aplicaciones de análisis fijos.

Formación de imágenes en vivo ha dilucidado una serie de mecanismos que regulan NB ACD. Antes de la adquisición de la imagen, es necesario determinar las condiciones óptimas de formación de imágenes. Es necesario equilibrar la tasa de captura de imágenes con la duración de imágenes de células vivas. Para el análisis celular fina, por ejemplo, aumentó temporal y la resolución óptica puede ser requerida. Cuando la visualización de un solo ciclo celular NB (Figura 4A), la velocidad a la que ...

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.8K vistas.  National Institutes of Health.  Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente. 

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Neurociencias

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioingeniería

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imágenes en directo de la migración de células gliales en el ojo del disco imaginal de Drosophila

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biología

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Imágenes de explantes cerebrales vivos de larvas de Drosophila melanogaster en el tercer estadio

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor destacado: Investigación de la dinámica de la división celular asimétrica: un protocolo para la obtención de imágenes en vivo de explantes cerebrales de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Imágenes en vivo de

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Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

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