Estamos muy agradecidos a Chun-lan Hsu y Yu-Chi Yang para la preparación de la comida marcha y el mantenimiento de las poblaciones de moscas, y para Su-Ping Lee y el IMB Imaging Core por su ayuda con la microscopía confocal. Este estudio fue apoyado por becas a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102 a 2321-B-001 -002, MOST 103 a 2311-B-001 -035 -MY3) del Consejo Nacional de Ciencia y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República de China.

Configuración 1. Pre-experimental <ol><li> Recoger un huevo de mosca que expresa la proteína verde fluorescente nuclear (GFP) bajo mδ0.5-Gal4 y de cultivo a 25 ° C durante 5 días. </li><li> Microondas 0,7 g de bajo punto de fusión de agarosa en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) hasta que la agarosa se disuelva completamente. Mantener el gel bajo punto de fusión 0,7% en una incubadora a 37 ° hasta su uso. </li><li> Esterilizar todo el equipo, incluyendo fórceps, tijeras, 42 mm cubreobjetos x 0,17 mm, una placa de punto de vidrio 9-bien, y una cámara de cultivo magnético, con 70% de etanol durante más de 12 h. </li><li> Preparar el medio de cultivo 3: medio Drosophila de Schneider suplementado con 2% de suero bovino fetal (FBS), 0,5% de penicilina-estreptomicina y 1,25 mg / ml de insulina. Para evitar la contaminación, preparar el medio en una campana de cultivo de células. Almacenar el medio de cultivo preparado a 4 ° C y se utiliza dentro de un mes. </li><li> Limpiar la plataforma de disección y el experimentador&#39;s manos con etanol al 70% antes de comenzar la disección. </li></ol> Disección 2. Disco <ol><li> Aire seco en todo el equipo de 70% de etanol. </li><li> Seleccione una larva de tercer estadio de un vial mosca. Para evitar la contaminación del vial mosca, lavar la larva en 1x PBS 3x para eliminar los residuos. </li><li> Diseccionar la larva limpiado en 1 ml de medio de cultivo (a temperatura ambiente) en la placa de punto de vidrio 9-bien bajo un microscopio de disección. </li><li> Agarre la larva con un par de pinzas en alrededor de un tercio de la distancia desde el extremo posterior y otros fórceps en el gancho de la boca. Tire de las dos pinzas en direcciones opuestas para liberar los tejidos internos. <ol><li> Retire las glándulas salivales, la grasa corporal, y la cutícula del complejo ojo-cerebro en el gancho de la boca. Si el cordón nervioso ventral está todavía conectado, se corta con tijeras. </li></ol></li><li> Utilice un par de pinzas para agarrar el gancho de la boca y un par de fórceps para retirar una pieza de tejido que connects los cerebros y discos de los ojos en la parte dorsal. NOTA: Si no se elimina este tejido, los dos discos de ojo-antenal estarán cerca uno del otro y el cerebro. Los discos de los ojos entonces no estar planos sobre el cubreobjetos porque este tejido, el cerebro, y el disco de ojo-antenal formarán un triángulo. </li><li> Girar todo el complejo a una posición ventral hacia arriba. Retire el filamento que conecta el gancho o el disco al cerebro. NOTA: Si no se elimina el filamento, el disco ojo-antenal se dividirá en dos piezas cuando se retira el gancho de la boca. <ol><li> Retire el gancho de la boca. Tenga cuidado de no dañar el ojo de disco durante el proceso. NOTA: El disco ojo es ahora libre en el medio y sólo conectado a cerebro por el tallo óptico. </li></ol></li></ol> 3. montaje <ol><li> Aire seco y montar los componentes de la cámara con un 42 mm x 0,17 mm cubreobjetos. Adjuntar una doble capa de juntas tóricas para el centro de la hoja de la cubierta para mantener ºe agarosa. </li><li> Montar la cámara con cubreobjetos. Ponga la 42 mm x 0,17 mm cubreobjetos sobre el aceptor etapa. Coloque la junta tórica de silicio sobre la hoja de la cubierta. Coloque la base. Bloquear el armario de sellado y colocar la cubierta (Figura 1). </li><li> transferir cuidadosamente el complejo ojo-cerebro diseccionado al centro de la junta tórica usando una micropipeta 20! l con una punta de 10-200 l. </li><li> Eliminar la mayor parte del medio y añadir 12 l de 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión (a 37 ° C) a la muestra. NOTA: La posición del ojo de disco puede ser cambiada con unas pinzas antes de la solidificación de la agarosa. La agarosa se solidificará dentro de 5 min. <ol><li> Añadir 1 ml de medio de cultivo a temperatura ambiente al centro de la junta tórica; cada junta tórica puede cargar hasta 4 muestras. Asegúrese de que la agarosa se pega a la junta tórica para evitar la deriva de la muestra. NOTA: No se aireación o circulación del medio es necesario. </li></ol></li></ol>4. Microscopía Confocal <ol><li> Coloque la cámara sobre la platina de un microscopio confocal invertido durante 30 minutos para equilibrar la temperatura. Esto puede evitar que la deriva del eje Z durante la formación de imágenes. </li><li> Antes de imágenes en vivo a largo plazo, puede comprobar si el tejido está intacto por diferencial microscopía de contraste de interferencia. </li><li> Para evitar la fototoxicidad, utilice una fuente de láser por debajo de 2 mW. Utilice un objetivo de 40X para la imagen. </li><li> Adquirir 62 micras imágenes Z en pila en 12 min en un intervalo óptico de 1 m. Adquirir 40 ciclos de exploraciones en un total de 10 h. Asegúrese de que cada ciclo contiene 12 min de formación de imágenes y 3 min de reposo. </li></ol>

<ol>
	<li>Cohen, S. M., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+disc+development.">Imaginal disc development.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 2, 747-842 (1993).</li><li>Auerbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+legs,+wings+and+halteres+in+wild+type+and+some+mutant+strains+of+Drosophila+melanogaster.">The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster.</a> Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Ex+Vivo+Culture+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Imaginal+Discs.">Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs.</a> PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 1277-1316 (1993).</li><li>Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+signaling+and+morphogenesis+in+Drosophila.">Planar signaling and morphogenesis in Drosophila.</a> Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).</li><li>Choi, K. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+glia+along+photoreceptor+axons+in+the+developing+Drosophila+eye.">Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye.</a> Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).</li><li>Strutt, D. I., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ommatidial+polarity+in+the+Drosophila+eye+is+determined+by+the+direction+of+furrow+progression+and+local+interactions.">Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions.</a> Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).</li><li>Gaengel, K., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egfr+signaling+regulates+ommatidial+rotation+and+cell+motility+in+the+Drosophila+eye+via+MAPK/Pnt+signaling+and+the+Ras+effector+Canoe/AF6.">Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6.</a> Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).</li><li>Li, C., Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditions+for+the+primary+culture+of+eye+imaginal+discs+from+Drosophila+melanogaster.">Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+differentiation+in+Drosophila.">Retinal differentiation in Drosophila.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, ., Wittbrodt, F., J, E. H., Stelzer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+fluorescence+microscopy:+advances+in+high+speed+biological+imaging.">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Control+of+Morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-Jointed+Planar+Cell+Polarity+Pathway.">Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chips+for+In+Vivo+Imaging+of+Cellular+Responses+to+Neural+Injury+in+Drosophila+Larvae.">Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae.</a> Plos One. 7 (1), (2012).</li><li>Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clonal+analysis+based+on+chronic+in+vivo+imaging+allows+multiscale+quantification+of+growth+in+the+Drosophila+wing+disc.">Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc.</a> Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).</li><li>Taylor, J., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs.">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li><li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis.">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li><li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila.">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li><li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro.">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este estudio, proporcionar un protocolo detallado para un experimento de imágenes en vivo a largo plazo en los discos imaginales de Drosophila. Pasamos mucho tiempo practicando la disección cuidadosa para evitar el daño del disco y para permitir la fijación del disco cerca de los cubreobjetos. Tratamos de poli-L-lisina (PLL) y bajo punto de fusión de agarosa para mantener el tejido; al final, la agarosa de bajo punto de fusión mostró una mejor capacidad para mantener el tejido. Aunque se usó sólo el ojo disco en el presente documento para demostrar la ocurrencia normal de la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial durante el período de formación de imágenes en vivo 10 h, este método también se puede aplicar a al menos otro disco, el disco del ala, como se demuestra en una 3 estudio previo. Por otra parte, la preparación de medio de cultivo y la configuración de imágenes en vivo son simples y no requieren aireación o circulación del medio. imágenes en vivo continua puede proporcionar una clara secuencia temporal de la víspera biológicaNTS. En nuestro informe anterior de la diferenciación de células gliales y la migración en el ojo de disco, hemos proporcionado una prueba directa de que la glía envolver diferencian de glía existente después de migrar a la parte anterior del ojo disco 3. Cultivo a largo plazo ex vivo permite el etiquetado por láser activado específica de células, como la foto-conversión de la proteína fluorescente KAEDE, a seguir sus comportamientos 3. También puede acomodar el ensayo de productos químicos que se añaden directamente al medio de cultivo; Por lo tanto, se puede utilizar como una plataforma de cribado de fármacos. Dado que algunos proceso dinámico se produce en cuestión de minutos o segundos, se requiere una alta resolución temporal. Para mejorar la resolución temporal, microscopía de lámina de luz 15, 16 o girando la microscopía disco 17 puede ser una buena opción. La condición de la cultura actual no es perfecto. No es compatible con el crecimiento del disco. p celularroliferation sólo se admite para un máximo de 12 h 3. Después de 12 h en cultivo ex vivo, la tasa de diferenciación de los fotorreceptores comienza a disminuir 3. Esto puede ser debido a la falta de ciertos nutrientes u hormonas. Dado que la principal diferencia en este medio de cultivo es la alta concentración de la insulina, la insulina de mamífero puede ser parcialmente imitando la función de los péptidos endógenos similares a la insulina. La adición de extracto de mosca, el insecto trehalosa azúcar en la sangre, y diversas concentraciones de la hormona de la muda 20 hidroxiecdisona, no fueron beneficiosos 3. Sin embargo, el periodo de cultivo de 12-18 h es suficiente para estudiar muchos procesos de desarrollo. Métodos de cultivo alternativos para el cultivo de discos imaginales larvas se han comparado 3, y nuestra condición de cultivo y de imagen proporciona la ventana de tiempo más largo y claridad para imágenes en vivo. Aunque los discos dentro de larvas vivas y pupas se pueden visualizar directamente18, 19, 20, 21, 22, la ventana de resolución y el tiempo para las observaciones son limitados. Late larvas y pupas discos pueden cultivarse durante mucho tiempo 23, 24, pero los discos se someten a la morfogénesis significativo. Para aprovechar las ventajas de los discos de larvas planas, 2D, nuestro método de cultivo y la imagen es la mejor solución hasta el momento.

Los discos imaginales de Drosophila larvas han sido un sistema experimental favorecido para el estudio de una amplia variedad de mecanismos biológicos. Estos discos se invaginan desde el epitelio embrionario y se convierten en estructuras en forma de saco como construido por dos capas epiteliales, peripodial Epitelio (PE) y el disco adecuada (DP) 1, 2. Las células del disco imaginal proliferan y se diferencian progresivamente durante las etapas de larva y pupa y eventualmente se convierten en las estructuras del cuerpo adulto. Debido a la estructura de dos capas plana y simple de los discos imaginales, que son fáciles de observar cuando disecados de larvas. Sin embargo, a pesar de varios esfuerzos de muchos grupos, los métodos actuales para el cultivo a largo plazo de los discos imaginales no han sido satisfactorios. Recientemente hemos desarrollado un método de cultivo que pueda sostener el desarrollo normal de múltiples discos imaginales para un máximo de 18 horas y que permite obtener imágenes en vivo 3 </sarriba&gt;. El método de cultivo puede apoyar la diferenciación celular y la migración, pero que puede soportar la proliferación celular por sólo 7-12 h y no puede soportar el crecimiento del disco. La principal diferencia en el medio de cultivo es la alta concentración de insulina 3. El método es simple, y no se requiere aireación especial o circulación del medio. Uno de los discos imaginales mejor estudiados es el ojo de disco-antenal. El ojo de Drosophila se construye de aproximadamente 800 ommatidia. Cada ommatidium se compone de ocho células fotorreceptoras (R1-R8). En el disco ojo larval, las células fotorreceptoras diferenciar siguiendo el paso de la morfogenética Surco (MF), que barre a través del disco ojo de posterior a anterior 4, 5. Los fotorreceptores en un ommatidium diferencian en secuencia, comenzando con R8, seguido por R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, y R7 6. El ommatidia en el dorsal y VEmitades ntral del disco ojo se someten a una rotación de 90 ° en direcciones opuestas, lo que resulta en quiralidad opuesta 7, 8. El proceso de rotación se produce en dos etapas: primero, una rotación de 45 ° comienza en y se completa en el sexto ommatidia fila detrás de la MF; la segunda rotación de 45 ° se completa en alrededor de fila 16 9, 10. Este estudio utilizó rotación ommatidial, marcado por el R3 / 4-específica mδ0.5-GA4 11, para demostrar la diferenciación celular normal y la dinámica que puede ser observado a través de este método a la cultura y vivir-imagen del disco ojo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:71px;">AMRESCO&#160;</td>
			<td style="width:215px;">0815-25G</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0780-2PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">42x0.17 mm cover slips&#160;</td>
			<td>PST</td>
			<td>G401-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Schneider&#8217;s Drosophila medium&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:215px;">I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture chamber&#160;</td>
			<td>PECON</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>POC-R2 Cell Cultivation System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x objective</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly strain:nls.GFP</td>
			<td style="width:71px;">Bloominggton</td>
			<td align="right" style="width:215px;">4775</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

Imágenes en vivo ofrece la posibilidad de rastrear continuamente los procesos celulares y de desarrollo dinámicos en tiempo real. Drosophila discos imaginales de larvas se han utilizado para estudiar muchos procesos biológicos, tales como la proliferación celular, la diferenciación, el crecimiento, la migración, la apoptosis, la competencia, la señalización célula-célula, y la formación de límite compartimental. Sin embargo, los métodos para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales no han sido satisfactorios, a pesar de muchos esfuerzos. Recientemente, hemos desarrollado un método para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales para un máximo de 18 h. Además de utilizar una alta concentración de insulina en el medio de cultivo, una agarosa de bajo punto de fusión también se utilizó para incrustar el disco para evitar que la deriva durante el período de formación de imágenes. Este informe utiliza los discos ojo-antenal como un ejemplo. expresión mδ0.5-GA4 / 4-específica de fotorreceptores R3 se siguió para demostrar que fotorreceptor differenciación y rotación ommatidial pueden ser observados durante un período de formación de imágenes en vivo 10 h. Este es un protocolo detallado que describe este método simple.

<html> En este ejemplo, los fotorreceptores R3 / R4 se marcaron con mδ0.5-GA4 para monitorizar la diferenciación de los fotorreceptores. mδ0.5-GA4 impulsa fuerte expresión en R4 y la expresión más débil en R3 11, por lo que es un excelente marcador para R3 y R4, así como para el proceso de rotación ommatidial. En la película 1, R3 y R4 se marcaron con GFP. Al comienzo de la 10 h sesión de formación de imágenes en vivo, había 8 filas de grupos ommatidial (Figura 2A y de película 1) y 14 filas de grupos ommatidial en el extremo (Figura 2B). La tasa de diferenciación ommatidial fue de 1,67 h por fila, que está cerca de la velocidad de 1,5-2 h / fila de discos en vivo 7, 8, 9, 10, 11,s = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Sobre la base de las posiciones relativas de R3 y R4, rotación ommatidial ocurrió en el disco ex vivo se cultivaron durante de imágenes en vivo (Figura 2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39;, y B &#39;&#39;). Un clúster sola R3 / R4 se marcó con una esfera blanca en el primer fotograma de la película 2. En el principio, el eje R3 / R4 parece ser perpendicular al ecuador (Figura 2C y Película 2). A continuación, parece girar 15 °, 30 °, y 45 ° en 3 (Figura 2C &#39;), 6 (Figura 2C &#39;&#39;), y 9 (Figura 2C &#39;&#39;&#39;) h, respectivamente. Estos datos sugieren que este método puede sostener la diferenciación de los fotorreceptores durante la proyección de imagen en directo 10 h. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Diagrama esquemático de conjunto de la cámara. Diagrama esquemático del conjunto de la cámara: (1) Coloque el cubreobjetos unido-O-ring de doble capa en el aceptor etapa. (2) Colocar la junta tórica de silicio sobre la hoja de la cubierta. (3) Colocar la base. (4) Bloquear el armario de sellado. (5) Cargar la muestra en el centro de la junta tórica y coloque la cubierta. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Figura 2: imágenes en vivo de R3 / R4 Diferenciación y Rotación. R3 / R4 marcado con mδ0.5-Gal4 expresando-forma nuclear GFP durante 10 h de formación de imágenes en vivo. Todas las figuras se capturaron a partir de la película 1. (A) La imagen captada por el principio. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A &quot;) Imagen ampliada del área de la caja a la izquierda ( A &#39; ) y derecha ( A&quot; ). ( B ) Imagen tomada al final del período de 10 h. ( B&#39;-B ) Imagen ampliada del área de la caja de la izquierda ( B &#39; ) y la derecha ( B &quot; ). ( CC &#39;&#39; &#39; ) Un solo par R3 / R4 (marcado con una flecha en A&#39;) se sigue a través del tiempo para mostrar la rotación del par R3 / R4. Barras de escala = 15 μm, 10 μm y 5 μm en A, B y C, respectivamente. Todas las figuras son proyecciones z de intensidad máxima. La escala de tiempo se muestra en h: min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Película 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Película 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Haga clic aquí para descargar esta película. <img alt="película 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Película 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K vistas.  National Yang-Ming University.  Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa. 

Video: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse de pollo temprano embriones

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una cámara simple para la formación de imágenes confocales a largo plazo del desarrollo de raíces y hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Métodos para el pH intracelular de la proyección de imagen del linaje de la célula de vástago del folículo en vivo tejido ovárico de Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagen en vivo y análisis de contracciones musculares en Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Imaging Dpp Liberación de un disco de ala Drosophila

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

Imágenes Intranuclear Actin Rods en vivo calor estresado Drosophila Embriones

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...