Name: live imaging of drosophila larval neuroblasts
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung an den National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) und eine Lenfant Biomedizinische Postdoctoral Fellowship an DAL ausgezeichnet unterstützt.

1. Herstellung von Materialien Erforderlich zum dritten Larven Larven Brains Explantation <ol><li> Bereiten Sie Werkzeuge für die Mikrodissektion erforderlich. <ol><li> Forge sezieren zwei Werkzeuge (ein Skalpell und ein Haken), indem zunächst eine einzelne Sektions Stift in jeder Stifthalter. Sichern Sie sich die Stifte fest mit der Hand oder mit einer Zange (Abbildung 1C). </li><li> Verwenden Sie ein Paar alte Pinzette, um ein Seziersaal Pin auf einem etwa 120 ° Winkel biegen. Tun Sie dies unter einem Binokular, um sicherzustellen, dass die obere Hälfte des Stiftes liegt flach, wenn der Stift Halter in der Hand hielt. Dieses Tool wird wie ein Skalpell in der Hand nach unten oder in Scheiben schneiden durch das Gewebe verwendet werden. </li><li> Verwenden Sie ein Paar alte Pinzette, um den zweiten Stift in einen Haken, die verwendet werden, um zu halten und abkratzen Gewebe wird zu biegen. </li><li> Cover jede Sezieren Werkzeug mit einer Pipettenspitze, die Werkzeuge vor Beschädigungen zu schützen. Mit Sorgfalt können gut ausgebildete Werkzeuge für die Präparation auf unbestimmte Zeit verwendet werden. Beschädigte oder verformte Pins Bedarf ersetzen. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Bereiten Sie sezieren Medium. <ol><li> In einer Gewebekultur Kapuze, verdünnen das Antibiotikum-Antimykotikum in Ergänzung des Schneiders Kulturmedium. Schwenken Sie die Medien, um den Zuschlag zu integrieren. </li><li> Bereiten mehrere 5 ml Aliquots der ergänzten Medium. Speichern Sie alle Medien bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Warm eine 5 ml-Aliquot ergänzt Medium auf Raumtemperatur. Zeichnen Sie das Medium in einer sterilen 5 ml Spritze und Schrauben auf einer sterilen 0,2 um Spritzenfilter. </li></ol></li><li> Wählen Larven für die Präparation. Verwenden Sie ein Sezieren Sonde auf Crawling dritten Larvenstadium auswählen, wie das Gehirn wird am einfachsten sein, sezieren. Optional: Kaution Larven auf einem Wein Agar-Platte. Hinweis: Verwenden Sie keine überfüllten Ampullen oder Flaschen mit &quot;Nassfutter&quot;, wie diese dazu neigen, zweiten oder ersten Larvenstadium zu zwingen, vorzeitig kriechen. Hinweis: Einige genetischen Hintergründen erfordern wird mit jüngeren Larven. Dies betrifft nicht das Protokoll, aber machen die dissection schwieriger. </li></ol> 2. Dissection des Zentralnervensystems <ol><li> An einem einzigen Objektträger aus Glas, erstellen Sie zwei Pools von 50 ml warmem Seziersaal Medien von etwa 3 cm getrennt. Ein Pool wird für grobe Zerlegung und andere für die Fein Dissektion (Abbildung 1C) verwendet werden. </li><li> Transfer mehrere Larven einem der Medientropfen. </li><li> Bewegen Sie das Deckglas mit Larven auf einem Binokular. Zoom in den Pool mit den Larven, so dass die vorderen und hinteren Enden der Larven sind erkennbar. </li><li> Verwenden Sie ein Paar Zangen, um den mittleren Bereich einer einzigen Larve erfassen. Nehmen Sie eine zweite Zange in der anderen Hand und fassen die Larve in der Nähe der gleichen Region. Ziehen Sie die beiden Pinzetten auseinander reißen, um sanft die Larve in der Hälfte. Wiederholen Sie die obigen beiden Schritte für alle Larven auf dem Deckglas. </li><li> Entsorgen der hinteren Hälften der Larvenkörper durch Übertragung auf ein Gewebe. </li><li> Zoom in eine Larve, so dass the vorderen mouthhooks sind deutlich sichtbar. Mit beiden Zangenpaaren, um einen kleinen Einschnitt oder eine Kerbe, die auf gegenüberliegenden Seiten der Larven mouthhooks zwischen dem dritten und ersten vorderen Brust denticle Bands zu schaffen. </li><li> Fassen Sie die mouthhooks mit der Zange in der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die Zange in der anderen Hand, um vorsichtig abziehen Nagelhaut in einer anterior-to-posterior-Richtung. Fahren Sie langsam abziehen Nagelhaut, bis das zentrale Nervensystem ausgesetzt ist. </li><li> Isolieren des zentralen Nervensystems von dem Rest der Larve durch Reißen Gewebe mit der Zange. Seien Sie vorsichtig, nicht auf das zentrale Nervensystem stören. Critical Schritt: auf das zentrale Nervensystem zu zerren Sie nicht! Entsorgen Sie beschädigte Proben mit einem zerrissenen Bauchmark (2A) oder verzerrten optischen Loben (2B und 2B &#39;). </li><li> Wiederholen Sie die obigen beiden Schritte für alle Larven auf dem Deckglas. Übertragen Sie das gesunde Gewebe explantiert, um dieSekunden (clean) Pool von Medium auf dem Deckglas für die Fein Dissektion der Bühne. </li><li> Verwenden Sie die Werkzeuge, um Sezieren Stift aus dem Gehirn beseitigen die peripheren Gewebe (z. B. Augen-, Flügel-und Beinscheiben). Schieben Sie das Skalpell zwischen der wollte (Gehirn) und dem unerwünschtes Gewebe, Pinning das Bindegewebe auf die Deckgläser. Verwenden Sie den Haken, um sanft zu necken entfernt die unerwünschte Gewebe, während Sie gleichzeitig die Tasten Skalpell, um das Deckglas in Säge-ähnlichen Bewegungen. </li><li> Critical Schritt: Arbeiten Sie langsam und bewusst, um alle Scheiben von jedem Gehirn zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, nicht die Morphologie des Gehirns stören. Ein gesundes Gehirn haben eine intakte Bauchmark und symmetrisch, rund optischen Loben (Abbildung 2C). </li></ol> 3. Montage Explantierte Gehirne für Live-Imaging <ol><li> Kehren Sie ein 50 mm gasdurchlässigen Kulturschale mit der Klarsichtfolie nach oben (2D). Drücken Sie die Spritze, um einen kleinen Tropfen (etwa 30 ul) Medium auf t einzahlener Mitte der Schale. </li><li> Übertragen der isolierten Hirn, eine zu einem Zeitpunkt, zu dem Mediumtropfen auf dem Teller. Verwenden Sie den Haken Werkzeug aufnehmen ein Gehirn unter den optischen Loben. Alternativ können Sie Pinzette Axone aus dem Bauchmark vorstehenden erfassen. </li><li> Sammeln 5-10 Gehirne in der Dropdown Medium. Tauchen Sie die Gehirne mit den Seziersaal Stift Tools, um einzelne Gehirne, um den Boden der Tropfen Medium, wie viele von ihnen vorantreiben wird am Meniskus (2E) gefangen werden. </li><li> Richten Sie die Gehirne mit den Seziersaal Stift Werkzeuge, um Gehirn abhängig von der NBS, die abgebildet werden (Abbildung 3A) auszurichten. Um das Bild der dorsale BS, legen Sie das Bauchmark nach unten (entlang der Membran). Um die Bild die anterio-ventralen NBs, legen die Gehirne mit dem Bauchmark nach oben (weg von Membran). Richten Sie die Köpfe, so dass alle die ventralen Nervenstränge in die gleiche Richtung in der xy-Ebene. </li><li> Verwenden Sie eine Spritze oder Kunststoffübertragung pipette bis 4 Halogenkohlenwasserstoff (HC) Öltropfen (30 &amp;mgr; l jeweils) auf der gasdurchlässigen Membran zu platzieren. Das Volumen jeder Tropfen Öl sollte äquivalent zueinander und zu dem Mediumtropfen sein. Raum die Tropfen Öl in den vier Ecken eines Deckglases um den Tropfen Kulturmedium zentriert entsprechen. Wenn Sie fertig sind, werden die fünf Tropfen (vier Tropfen Öl und ein Tropfen des Mediums in der Mitte) die fünf Facetten auf westlichen Stil Würfel (3B) ähneln. </li><li> Senken Sie # 1.5 22 mm Deckglas auf der Versammlung, dass er trifft alle 5 Tropfen in der gleichen Zeit. Aufrechterhaltung eines gleichmäßigen Druck über die Proben reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass sie gestört werden. Warten Sie ca. 3 Minuten, da das Öl-und Mittel unter dem Gewicht des Deckglases zu zerstreuen. Eine kreuzförmige Gestalt Medien bilden (Fig. 3C und 3D). </li><li> Critical Schritt: Senken Sie die Deckglas auf der Oberfläche des Gehirns, indem überschüssiges Medien mit einem Seidenpapier Docht (Figure 3C). Tun Sie dies, während Sie die Probe unter dem Binokular. Als Medium wird entfernt, wird das Deckglas zu senken. Stoppen Sie, wenn die Deck berührt die Gehirne. Nicht über-Docht da diese Gewebe Verzerrung oder Gehirn Explosionen verursachen. </li><li> Wenn Bildgebung Rücken NBs (3E), gehen Sie zu Schritt 3.9. Wenn Abbildungs ​​anterio-ventralen NBs, muss die Deck leicht (durch leichtes Antippen mit Zange) in Richtung der Bauchmark Spitzen verschoben werden. Dies bewirkt, dass das Gehirn zu drehen, die die Hirnlappen bringt in direktem Kontakt mit dem Deckglas zu Bildgebung (Fig. 3F) zu erleichtern. </li><li> Verschließen Sie die Kammer, die durch umlauf das Deckglas mit geringen Mengen an Halogenkohlenwasserstofföl (3D). Überschüssiges Öl sickert aus dem Deckglas sollte minimiert und mit einem Papiertuch abgetupft werden entfernt. </li></ol> 4. Live-Imaging von Central Brain Neuroblasten Hinweis: Für diese Arbeit, eine Nikon Eclipse-Ti Spinnplattenkonfokalen Mikroskop (inverses Mikroskop) wurde für die Bildgebung verwendet werden; Details unserer Einrichtung haben bisher veröffentlichten 31 wurde. Alternativ kann die Probe unter Verwendung eines aufrechten System abgebildet werden. <ol><li> Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas montiert, direkt über den Gehirnen. Dies wird Ihnen helfen zu zentrieren das Ziel direkt über der Probe. </li><li> Kritischer Schritt: Halten Gehirn bei einer konstanten Temperatur von 25 ° C Inkubator mit einer Stufe. Sanft in die Bühne positionieren Sie den Inkubator Probe montiert und decken die Kammer mit dem Deckel. </li><li> Suchen zentrale Gehirn NBs Durchlicht durch die Konzentration auf den großen, runden Zellen, die in den zentralen und medialen Bereiche der optischen Loben befinden, nicht verwenden Auflicht-Fluoreszenz. Dies wird leichter mit der Praxis. Es ist sehr wichtig, um die Probe zu der geringsten Menge an Licht wie möglich freizulegen. Verschwenden Sie keine Zeit Bildgebung Gehirn, die beschädigt sind. </li><li> Einmal im Ort, um schnelle Aufnahmen mit dem konfokalen zuBestimmung der richtigen Lage und Tiefe. Grenztiefe auf den ersten 10-15 um. Passen Sie bei Bedarf, und einen weiteren Testbild. <ol><li> Optionaler Schritt: Sammeln Sie eine Test-Film mit dem Bauchmark, um sicherzustellen, gibt es keine xy Drift. Wenn Drift erkannt wird, warten Sie 15-30 Minuten für die Probe zu begleichen. Wenn die Drift nicht in 30 min absetzen, bereiten eine neue Probe. Wichtige Drift kann in der Regel wieder auf die Zugabe von überschüssigem Öl zurückgeführt werden, oder die ungleiche Größe der Öltropfen während der Montage. </li></ol></li><li> Um eine axiale Drift (z-Drift) zu beseitigen verwenden eine kontinuierliche automatische Fokussierung Gerät, eine Infrarot-LED verwendet. Alternativ manuell die Brennebene zu korrigieren. </li><li> Sobald ein NB von Interesse identifiziert wird, gehen Sie mit bildgebenden Regime. Wie bei allen Live-Cell-Imaging, die Menge von Laserlicht, Belichtungszeit, Kamera Binning, Objektivvergrößerung, Zeit-und / oder z-Intervall Schritt müssen alle empirisch für einen bestimmten Versuch, die Frage zu beantworten, bei der Hand optimiert werden. Das Ziel ist es, Licht Damm minimierenAlter, während immer noch nützliche Daten sammeln. Siehe Diskussion für zusätzliche Hinweise. <ol><li> Bild das gesamte Volumen des NB durch Sammeln von 12-14 Bildern 1 um die z-Achse angeordnet sind. Stellen Sie die Zeitauflösung, einzelne oder mehrere Zellzyklen der gleichen NB zu erfassen. Als allgemeine Richtlinie, verwenden Sie 10-30 Sekunden-Intervallen für Einzelzellzyklus-Bildgebung und 1-3 Minuten-Intervallen für mehrere Zellzyklen. </li></ol></li><li> Critical Schritt: Bestätigen Sie, dass die Probe durch die Überwachung der gesunden Dauer der Mitose ist. Wenn Mitose dauert mehr als 15 Minuten, gehen Sie zu einem anderen Gehirn. Ein gesundes Gehirn viele NBs im gleichen Sichtfeld zeigen läuft mehrere Runden von Mitose. Beachten Sie, dass jede Zelle Zyklus ist etwas länger als der vorherige aufgrund von Lichtschäden. </li><li> Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Inkubation Kammer, und entsorgen Sie alles, aber die gasdurchlässige Kultivierung Gerichte. Mit 95% Ethanol spülen Kulturschale Oberfläche und gut wischen mit einem Tuch. Vorgang zweimal wiederholen. </li&gt; </ol> 5. Vorbereitung der Gehirne für Immunfluoreszenz <ol><li> Sammeln 20 oder mehr explantierten Gehirn in ein 1,5 ml Röhrchen, enthaltend etwa 0,2 ml Medium, ergänzt. </li><li> Entfernen Medium aus dem Rohr und spülen Gehirne einmal mit 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS mit 0,3% Triton X-100). Lassen Gehirn setzen sich auf dem Boden der Röhre zwischen allen Austausch von Flüssigkeit. Der Triton X-100-Detergens verwendet wird, um das Gewebe zu permeabilisieren. Spülen typischerweise in weniger als 30 sec; entfernen Sie einfach den PBSTx einmal Gehirne wurden dem Boden der Röhre angesiedelt. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml 9% Elektronenmikroskopie Grad Para in PBSTx verdünnt. Inkubieren mit Nutation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entsorgen Fixiermittel nach gefährlichen Abfällen Vorschriften. </li><li> Mit 0,5 ml PBSTx 15 min Waschen der Proben. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBSTx zwei weitere Male. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml PBT (PBS, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Tween-20). Inkubieren mit Nutation für 1 h bei Raumtemperatur. Dieser Schritt Blöcke die unspezifische Bindung des Antikörpers an das Gewebe. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml primären Antikörper in PBT mit 4% normalem Ziegenserum (NGS) ergänzt verdünnt. Inkubieren mit Nutation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen oder speichern Sie die verdünnten primären Antikörpers. </li><li> Mit 0,5 ml PBT 15 min Waschen der Proben. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBT zwei weitere Male. </li><li> Ersetzen der Lösung mit 0,5 ml des modifizierten PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20 und 4% NGS). Inkubieren mit Nutation für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml sekundären Antikörper in modifizierte PBT verdünnt. Inkubieren mit Nutation für 2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml PBST (PBS mit 0,1% Tween-20). Inkubieren mit Nutation für 15 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBST zwei weitere Male. </li></ol><ol><li> Die Proben vorsichtig wie ein Tropfen auf einen Objektträger übertragen, die Einschränkung der Drop nach links von der Mitte der Folie. </li><li> Hinzufügen eines großen Tropfen (etwa 2 cm im Durchmesser) des Befestigungsträgers (z. B. Aqua-Poly/Mount) zu der Mitte der Folie. Vermeiden Sie den Pool der PBST, die in Richtung der linken Seite ist. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Gehirne aus dem Pool der PBST in den Pool der Montagemedium zu übertragen. Hinzufügen Montagemedium direkt auf die Gehirne können ihre Orientierung zu stören und sollten vermieden werden. </li><li> Unter einem Lichtmikroskop, ordnen Sie die Proben in der Montage Medium mit der Seite, die abgebildet wird nach oben werden. </li><li> Mit dem Objektträger unter dem Lichtmikroskop, langsam senken # 1.5 ein Deckglas auf der Oberseite der Proben. Optionaler Schritt: müssen entfernt werden kleinere Luftblasen durch leichtes Drücken auf dem Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Montagemedium für mehrere Stunden oder über Nacht polymerisieren, durch Lügen Folien flach, leicht-geschützt, bei Raumtemperatur. </li><li> Die Objektträger können abgebildet werden, am nächsten Tag, oder vor der Bildgebung gespeichert. </li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Live-Cell-Imaging ist eine unschätzbare Ansatz verwendet werden, um die Mechanismen, die ACD von Stammzellen, die Differenzierung von Zelllinien regulieren zu studieren, und die Morphogenese von komplexen Geweben. Obwohl Forschergruppen haben in der Vergangenheit verwendet eine Vielzahl von Techniken, um NB ACD visualisieren können diese Ansätze im Allgemeinen in zwei Kategorien, die in erster Linie mit Bezug darauf, ob das Hirngewebe intakt gelassen oder dissoziiert unterschiedlich gruppiert werden. <p class="jo...

Stammzellen ein Gleichgewicht der Differenzierung und Selbsterneuerung an zelluläre Vielfalt während der frühen Entwicklung zu generieren und ersetzen beschädigte Zellen in adulten Geweben. Verordnung dieser Homöostase verhindert sowohl den Verlust und die Überdehnung der Stammzellpopulation, die in schädlichen Gewebedegeneration oder Tumorentstehung führen kann. Neuroblasten (NBS) sind die häufigsten untersuchten neuralen Stammzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila (1A), die erste Form während der embryonalen Stufen 1, 2. NBs unterziehen wiederholte Runden der asymmetrischen Zellteilung (ACD), um zwei ungleich seligen Zellen produzieren: eine sich selbst erneuernde Stammzelle und eine differenzierende Zelle. ACD wird von Zentrosomen, die nicht-membranöse Organellen, die als Mikrotubuli-organisierende Zentren der meisten Zellen 3 handeln geführt. Während der Mitose, NB Zentrosomen zu organisieren und orientieren den bipolaren mitotischen Spindel entlang der apikal-basalen Polarkeit Achse. Nach der Spaltung des Teilungs NB, apikal Schicksal Determinanten, die die Stammzell Schicksal angeben und basalen Schicksal Determinanten, die eine Differenzierung angeben, werden in die ungleiche Tochterzellen getrennt. Im Larven zentrale Gehirn, können zwei Arten von NBs durch deren Anzahl, Lage, Transkriptionsfaktor-Expression und Zelllinie (Fig. 1A) 4-6 unterscheiden. Typ-I-BS sind die häufigsten, und etwa 90 von ihnen bevölkern die vorderen und hinteren Seiten jeder Optik Lappen des Gehirns 7. Diese NBs Ausdruck der Transkriptionsfaktor ASENSE (Ase), und sie charakteristisch in eine sich selbst erneuernde NB teilen und eine kleinere Ganglienmutterzelle (GMC; Abbildung 1B). Jeder GMC erfährt ein einziges Terminal Division zu zwei Neuronen oder Gliazellen (Abbildung 1B) zu generieren. Im Gegensatz dazu sind die acht Typ II NBs, die die hintere Seite jeder optischen Loben bevöl fehlt Ase Ausdruck 5. Sie durchlaufen ACDauf eine sich selbst erneuernde NB und eine Zwischen neuralen Vorläufer (INP) zu produzieren. Die INP wiederum teilt asymmetrisch drei-bis fünfmal. Jeder dieser Bereiche ergibt Regeneration des INP und der Herstellung eines einzigen GMC 4. Zusammen die spezifische NB Identität und die zeitliche Reihenfolge der GMC Geburt führt zur neuronalen erstaunliche Vielfalt der erwachsenen ZNS. Das Verständnis der Zellbiologie, die NB ACD zugrunde liegt, wurde erheblich durch den Einsatz von Live-Cell-Imaging-Techniken verbessert. Veröffentlicht Protokolle, die von Forschern, Live-Bild verwendet NBs sind sehr unterschiedlich. Insgesamt aber diese Verfahren können in zwei allgemeine Kategorien von, ob die Larven Gehirn intakt gelassen oder mechanisch dissoziiert unterschieden gruppiert werden. Beide Techniken haben unterschiedliche Vor-und Nachteile je nach Anwendung des Forschers. Frühe Berichte enthüllt Live-NB Zellteilunggen beinhalten ein gewisses Maß an Hand Dissoziation des Larven Gehirn. Diese Protokolle Detail Verschmieren 8 oder 9 Hänseleien abgesehen, das Gehirn, um kurzfristige Primärkulturen von der NBS auf Deckgläsern wachsen. Um Bildgebung zu verbessern, werden die runden NBs der Regel auf die Deckgläser entweder mit Glasobjektträger 8 oder 9 Agarose-Pads abgeflacht. Obwohl abgeflachten Zellen Optik verbessert, diese Techniken oft NB mitotischen Defekten führen, einschließlich Regression der Teilungsfurche und die Unfähigkeit, mehr als einmal zu teilen. Daher sind Protokolle, die sowohl manuelle Dissoziation und physische Verzerrung des Larvenhirngewebe beinhalten in der Regel nur geeignet, um sehr kurzfristige (dh., Ein Zellzyklus oder weniger) Anwendungen. Ebenso semi-Quetschen oder vollständig intakten Gehirn Abflachung zwischen Glasobjektträger und Deckgläser begrenzt die Zeit, ein verbringen Abbildung einer gegebenen Probe zu einer etwa 30-minütigen Zeitraum 10. Trotz dieser Einschränkung thiAnsatz erfolgreich 11-14 verwendet. Die jüngsten Bemühungen um Live-Bild dissoziiert NBs Grenze physischen Verzerrung der isolierten Zellen. Diese Techniken sind besonders nützlich für Anwendungen, bei denen es notwendig ist, um die Zellkulturen für mehrere Zellteilungszyklen aufrecht zu erhalten. Beispielsweise kann manuell aus dispergierten Zellen dissoziiert Gehirn teilweise in ein Gerinnsel aus dem Gemisch von Fibrinogen und Thrombin, 15 für die Langzeitabbildungs ​​16 eingebettet werden. Alternativ kann explantierten Gehirne zunächst mit dem Enzym Collagenase, neben manuell durch wiederholte Passage durch eine Pipettenspitze aufgebrochen und anschließend auf Poly-L-Lysin beschichteten Glasbodenschalen 17, 18 plattiert chemisch getrennt werden. Die Beschichtung Glasschalen entweder mit Fibrinogen oder Poly-L-Lysin fördert die Bindung und leichten Verbreitung von Rundzellen, bringen sie so nah an der Deck wie möglich, ohne große körperliche Verzerrung. In additiauf beinhalten diese Verfahren das Kultivieren der NBS in Medium, das leicht für pharmakologische Experimente Störungs 18 ausgetauscht werden können. Insgesamt Plattierung direkt verteilt NBs verbessert Abbildungsoptik, ohne dabei langfristigen Imaging-Funktionen. Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die langfristige Kultivierung von dissoziierten NBs wurde 19 beschrieben. Jedoch ist dieser Ansatz nicht ohne Einschränkungen. Es gibt mehrere Einschränkungen live dissoziiert NBs Bildgebung. In einem Feld von dispergierten Zellen, beispielsweise ist es schwierig, bestimmte NB Linien, die räumlich in der intakten 1 organisiert sind, zu identifizieren. Ebenso die Unterscheidung der Typ I gegen Typ-II-NBs in dissoziierten Gewebe ist auch ohne den Ausdruck der Abstammung oder Tracer-Subtyp-spezifischen Transgene, wie worniu-GAL4, asense-GAL80 20 herausfordernde. Obwohl diese Transgene sind sehr nützlich für einige Anwendungen, sie begrenzen Forscher diejenigen Transgene exunter der Kontrolle von UAS-Enhancer-Element 21 gedrückt und erfordern komplexe genetische Systeme. Studien, die die räumliche und zeitliche Entwicklung des NBs betreffen, erfordern daher in vivo-Bildgebung im Kontext eines intakten Gewebes. Außerdem haben Studien dissoziierter embryonaler NBs anzuzeigen, dass der physische Kontakt benachbarter Zellen ist für die Zwischen Lokalisierung von Schlüsselfaktoren Polarität 22, 23. Diese Studien zeigen, völlig isoliert NBs die invariante mitotischen Spindelachse nicht mehr aufrecht zu erhalten. Stattdessen werden diese Zellen zeigen eine weitere randomisierte Spindelachse und großen Winkeln der Trennung zwischen aufeinander GMC Knospen, vielleicht aufgrund des Verlustes der apikalen Zentrosom Positionierungs 22. Obwohl die Beziehung zwischen den Larven NBs und ihre Nachbarzellen nicht ausführlich untersucht worden, ist es eine Überlegung wert, dass die Larvenstammzellmikroumgebung kann von Zellpolarität oder andere treffenVerhaltensweisen. Um die physiologischen Kontext der Larven NBs halten wir Bild ACD aus ganzen Gehirne. Angesichts der inhärenten Einschränkungen mit bildgebenden dissoziiert NBs verbunden sind, haben unser Labor und andere Protokolle für Bild in aufeinanderfolgenden Runden der NB ACD aus ganzen Larven Gehirn etabliert. Techniken zur Bild intakten Gehirn ersetzen häufig die starre Oberfläche aus Glas auf der einen Seite der Kulturkammer mit einer flexiblen Membran, um Gewebe Verformung oder Beschädigung zu verhindern und eine für den Gasaustausch. Einige Verfahren beinhalten Montage explantierten Gehirne in einem Gemisch von Insektenkulturmedium, Serum und Ascorbinsäure mit den Fettkörpern von zehn Larven 24 isoliert. Die isolierten Fettkörper hinzugefügt werden, weil sie eine Mitogen bekannt, NB Zellteilung stimulieren 25 absondern. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität des Gewebes über 3 Stunden und ist daher offen für Langzeitabbildungs ​​24, 26-28. Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die long fristigen Abbildung des Larven intakten Gehirn in Gegenwart von Ascorbinsäure, Serum und Fettkörper wurde 29 detailliert. Wichtig ist, da das Gewebe nicht ausgesetzt oder immobilisiert ist dieser Ansatz weniger nützlich für Anwendungen, in denen Kulturmedium ausgetauscht wird (z. B. Arzneimittelstudien Immunodepletion usw.). Unser Labor hat die ganze Vorbereitung der Live-Halterung Larven Gehirne für langfristige Bildgebung 30, 31 vereinfacht. Der Hauptvorteil unseres Protokolls über andere ist seine Einfachheit: Unsere Beobachtungen zeigen, weder Serum, Ascorbinsäure, Insulin, noch Fettkörper sind notwendig, Zusatzstoffe Bild aufeinanderfolgende Runden NB ACD. Obwohl Additive, wie Insulin, wurden für die verlängerte Bildgebungs der Stammzellen Abteilungen 32 und kollektive Zellmigration in Drosophila Ovarien 33 nützlich erscheinen sie entbehrlich für NB ACD sein, wie unsere Abbildungsmedium besteht aus einer einfachen Mischung von STAndard Insektenzellkulturmedium mit Antibiotika-Antimykotikum ergänzt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Durch die Verwendung von wiederverwendbaren gasdurchlässige oder Glasboden Kulturschalen, haben wir in der Lage, mehrere Runden von aufeinanderfolgenden NB ACD zu erhalten. Die gleichen explantiert Proben können leicht für Immunfluoreszenz-und andere Verfahren mit festen Gewebe verwendet werden. In diesem Protokoll, die wir ausführlich die Präparation von intakten Larven Gehirn, sowie die Vorbereitung der Gehirne sowohl für Live-und Festanalyse.

<table><tbody><tr><td>Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 &amp;#956;g/ml), and amphotericin B (25 &amp;#956;g/ml) that is added to Schneider&#039;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td></tr><tr><td>Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle/probe with plastic handle</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, 0.22 &amp;#956;m pore size</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 32% EM-grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td></tr></tbody></table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

Stammzellen teilen sich asymmetrisch zu zwei Nachkommen Zellen mit ungleichen Schicksal Potenzial generieren: eine sich selbst erneuernde Stammzellen und differenzier Zelle. Angesichts ihrer Bedeutung für die Entwicklung und Krankheit, das Verständnis der Mechanismen, die regeln, asymmetrische Zellteilung Stamm hat eine robuste Bereich der Studie. Weil sie genetisch manipulierbaren und laufen aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung etwa einmal pro Stunde, die Stammzellen des Drosophila zentralen Nervensystems, Neuroblasten oder unverzichtbar sind Modelle für die Untersuchung von Stammzellteilung. 100 neurale Stammzellen sind in der Nähe der Oberfläche jedes der beiden Larvenhirnlappen angeordnet, so dass diese Modellsystem insbesondere für die Bildgebung mikroskopische Untersuchungen. In dieser Arbeit untersuchen wir einige Ansätze weit verbreitet, um Stammzell Divisionen zu visualisieren, und wir richten die relativen Vor-und Nachteile dieser Techniken, die im Vergleich zu intakten Hirngewebe dissoziiert beschäftigen. Wir haben auch unsere Detail simplifIED-Protokoll verwendet, um ganze Gehirn aus Drittlarvenstadium für Live-Cell-Imaging-und Festanalyseanwendungen Explantation.

Live-Bildgebung hat eine Reihe von Mechanismen, die NB ACD regeln aufgeklärt. Vor der Bildaufnahme ist es erforderlich, die optimalen Bilderzeugungsbedingungen zu bestimmen. Es ist notwendig, um den Rahmen Erfassungsrate mit der Dauer der Live Cell Imaging auszugleichen. Für feine Zellanalyse, zum Beispiel erhöhte zeitliche und optische Auflösung kann erforderlich sein. Bei der Visualisierung einer einzelnen NB Zellzyklus (Fig. 4A) kann die Geschwindigkeit, mit der Bilder aufgenommen werden, ohne da...

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.8K Aufrufe.  National Institutes of Health.  Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden. 

Serie: Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Neurowissenschaften

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Biotechnik

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologie

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Bildgebung von lebenden Hirnexplantaten von Drosophila melanogaster Larven des dritten Stadiums

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der asymmetrischen Zellteilungsdynamik: Ein Protokoll für die Live-Bildgebung von Drosophila-Larven-Hirnexplantaten 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Live-Imaging von

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Live-Bilder aus dem

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in

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Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns