Name: live imaging of drosophila larval neuroblasts
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Bu çalışma DAL ödüllendirildi Sağlık / enstitünün (1ZIAHL006126) ve bir Lenfant Biyomedikal Doktora Sonrası Araştırma Bursu National Institutes intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.

1.. Malzemeler Gerekli hazırlanması Üçüncü Instar Larva Brain eksplantasyona <ol><li> Mikrodiseksiyon için gerekli araçları hazırlamak. <ol><li> Öncelikle her pim yuvasına bir tek diseksiyon pimi koyarak iki diseksiyon araçları (bir neşter ve bir kanca) kurma. Elle veya pense (Şekil 1C) ile sıkıca işaretçilerine sabitleyin. </li><li> Yaklaşık 120 ° açı bir diseksiyon pin bükmek için eski bir çift forseps kullanın. Pim tutucu elinde olduğunda pimin üst yarısı düz yatıyor sağlamak için bir mikroskop altında bunu yapın. Bu araç, basılı veya doku yoluyla dilim bir neşter olarak kullanılacaktır. </li><li> Tutun ve doku kazımak için kullanılan bir kanca içine ikinci pimi bükmek için eski bir çift forseps kullanın. </li><li> Hasardan araçları korumak için bir pipet ile her kesme aletini örtün. Bakım, iyi-oluşturulmuş araçları süresiz diseksiyon için kullanılabilir. Gerektiğinde hasarlı veya deforme işaretçilerine değiştirin. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Orta diseksiyon hazırlayın. <ol><li> Bir doku kültürü kaputu, Schneider&#39;in kültür ortamı içine antibiyotik-antimikotik ek sulandırmak. Ek dahil medyayı girdap. </li><li> Takviye edilmiş ortam bir çok 5 ml&#39;lik numuneler hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C&#39;de tüm medya saklayın. </li><li> Oda sıcaklığına kadar takviye edilen ortam içinde, 5 ml&#39;lik bir şişe ısıtın. Steril bir 5 ml şırınganın içine orta çizin ve bir steril 0.2 mikron şırınga filtresi üzerindeki vida. </li></ol></li><li> Diseksiyon için larva seçin. Beyin incelemek için kolay olacak gibi sürünerek üçüncü larva evresindeki seçmek için bir diseksiyon prob kullanın. İsteğe bağlı: Bir üzüm agar plaka üzerinde mevduat larvalar. Not: Bu erken dışarı tarama için ikinci veya birinci larva evresindeki zorlamak eğilimi olarak &quot;ıslak gıda,&quot; ile aşırı kalabalık şişeleri veya şişeleri kullanmayın. Not: Bazı genetik arka genç larvaları kullanılarak gerektirecek. Bu protokol etkilemez, ama d yapmak yokissection daha zor. </li></ol> Merkezi Sinir Sistemi 2. Diseksiyon <ol><li> Tek bir cam slayt üzerine, yaklaşık 3 cm ayırarak sıcak diseksiyon medyanın iki 50 ml havuzu oluşturun. Bir havuz ince diseksiyon (Şekil 1C) için kullanılan brüt diseksiyon ve diğer için kullanılacaktır. </li><li> Ortam damla birine çeşitli larva aktarın. </li><li> Diseksiyon mikroskop larvaları ile lamel taşıyın. Larvaların ön ve arka uçlarının fark edilebilir olduğu bu tür larvaları ihtiva eden havuza büyüt. </li><li> Tek bir larva orta bölgeyi kavramak için forseps bir çift kullanın. Öte yandan forseps ikinci bir çift almak ve aynı bölgeye yakın larva kavramak. Yavaşça yarısında larva gözyaşı ayrı forseps iki çift çekin. Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. </li><li> Bir dokuya aktararak larva vücudun posterior yarısı atmayın. </li><li> Bir larva yakınlaştırmak inci böyleceE anterior mouthhooks açıkça görülebilir. Üçüncü torasik ve birinci ön denticle bantlar arasındaki larva mouthhooks ters tarafta küçük bir kesik veya çentik oluşturmak için forseps iki çift kullanın. </li><li> Baskın olmayan el forseps ile mouthhooks kavrayın. Nazikçe bir ön-to-posterior yönde manikür soyulmaya, diğer yandan forseps kullanın. Merkezi sinir sistemi ortaya çıkıncaya kadar yavaş yavaş manikür soyulmaya devam ediyor. </li><li> Dokular forseps ile yırtılarak larva geri kalanından merkezi sinir sistemine izole edin. Merkezi sinir sistemini bozmayacağı dikkatli kullanın. Kritik adım: merkezi sinir sistemi üzerinde çekmeyin! Yırtık bir ventral sinir kablosu (Şekil 2A) veya bozuk optik loblar (Şekil 2B ve 2B &#39;) ile hasarlı örnekleri atın. </li><li> Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. Için sağlıklı eksplante doku aktarınince diseksiyon aşaması için lamel orta ikinci (temiz) havuz. </li><li> Beyinden periferik dokuyu (örneğin, göz, kanat ve bacak diskler) temizlemek için diseksiyon pin araçlarını kullanın. Coverglass için bağ dokusu çivileme, istediği (beyin) ve istenmeyen doku arasındaki neşter kaydırın. Aynı anda testere gibi hareketlerle lamel neşter basarken hafifçe istenmeyen doku uzak kızdırmak için kanca kullanın. </li><li> Kritik adım: Her beyinden gelen tüm diskleri kaldırmak için yavaş yavaş ve bilinçli çalışın. Beyin morfolojisini rahatsız dikkatli kullanın. Sağlıklı bir beyin bozulmamış bir ventral sinir kablosu ve simetrik, yuvarlak optik lobu (Şekil 2C) sahip olacaktır. </li></ol> 3.. Canlı Görüntüleme Brain Eksplante Montaj <ol><li> (Şekil 2B) yukarı bakacak net film ile 50 mm gaz-geçirgen kültür çanak ters çevirin. T ortamı üzerine küçük bir damla (yaklaşık 30 ul) biriktirilmesi için şırıngayı basınızyemeğin o merkezi. </li><li> Çanak orta damlasına kadar izole edilmiş beyinleri, bir defada, aktarın. Optik lobu altında bir beyin kaldırsanız kanca aracını kullanın. Alternatif olarak, ventral sinir kablosu uzanan aksonları kavramak için forseps kullanabilir. </li><li> Orta damla 5-10 beyinleri toplayın. Birçoğu gibi orta damla dibine tek beyinleri itmek için kesme pim araçlarını kullanarak beyinleri daldırın menisküs (Şekil 2E) tuzak olacaktır. </li><li> Yansıması için NB&#39;ler (Şekil 3A) bağlı olarak beyin hizalamak için diseksiyon pin araçlarını kullanarak beyinlerini yönlendirin. Görüntü dorsal Onaylanmış, (membran boyunca) aşağı bakacak ventral sinir kablosu yerleştirin. Görüntü anterio-ventral NBs, (uzakta membran) yukarı bakacak ventral sinir kablosu ile beyinleri yerleştirin. Tüm ventral sinir kordonları xy düzlemi içinde aynı yöne işaret etmektedir, öyle ki beyin hizalayın. </li><li> Bir şırınga ya da plastik transferi p kullanipette gaz geçirgen zar üzerine 4 halokarbon (HC) yağ damlaları (yaklaşık 30 ul her) yerleştirmek için. Petrol her damla hacmi birbirine ve orta damla eşdeğer olmalıdır. Uzay yağı damla kültür ortamının damla etrafında bir lamel dört köşesine tekabül edecek şekilde. Tamamlandığında, beş damla (yağ dört damla ve merkezi orta biri damla) Batı-tarzı zar (Şekil 3B) beş yönleriyle benzer olacaktır. </li><li> Bu aynı zamanda tüm 5 damla vurur şekilde montajı üzerinde bir # 1.5 22 mm lamel indirin. Örneklerin arasında eşit bir basıncın korunması da bozulacak olasılığını azaltır. Yağ ve orta lamel ağırlığı altında dağıtmak üzere yaklaşık 3 dakika bekleyin. Bir ortam çapraz-benzeri şekil (Şekil 3C ve 3D) oluşturacaktır. </li><li> Kritik adım: ince kağıt fitil (Figu kullanarak fazla ortamı kaldırarak beyinlerinin yüzeyi üzerine lamel Alt) 3C yeniden. Diseksiyon kapsamında örnek izlerken bunu. Ortam çıkarılır olarak, lamel daha düşük olacaktır. Lamel beyinleri dokunduğunda durdurun. Aşırı-fitil bu doku bozulması ya da beyin patlamalara neden olacak gibi. </li><li> Görüntüleme dorsal Onaylanmış (Şekil 3E), 3.9 adıma taşıyın. Görüntüleme anterio-ventral Onaylanmış ise, lamel biraz ventral sinir kablosu ipuçları yönünde (forseps ile yavaşça onu dürtmek) taşınmalıdır. Bu görüntüleme (Şekil 3F) kolaylaştırmak için lamel ile doğrudan temas halinde beyin lobları getiren döndürmek için beyin neden olur. </li><li> Halokarbonlu bir yağ (Şekil 3D), az miktarda lamel çevreleyen ile odası kapatın. Lamel sızma aşırı yağ küçültülmüş ve bir doku ile uzak lekelenen edilmelidir. </li></ol> Central Brain neuroblasts 4. Canlı Görüntüleme Not: Bu çalışma için, bir Nikon Eclipse Ti dönen diskkonfokal mikroskop (ters mikroskop) canlı görüntüleme için kullanılan; Bizim kurulum detayları önceden 31 yayınlanmıştır. Alternatif olarak, numune, bir dik sistemi kullanılarak görüntülenebilir. <ol><li> Sadece monte beyinleri üzerinde lamel daldırma bir damla yağ ekleyin. Bu, numunenin doğrudan üstünde amaç merkezi yardımcı olacaktır. </li><li> Kritik adım: bir sahne kuluçka 25 ° C&#39;lik sabit bir sıcaklıkta beyinleri koruyun. Yavaşça aşama inkübatör içine monte edilmiş örnek pozisyon ve kapak ile odasını kapsamaktadır. </li><li> Optik lobların merkez ve medial alanlarda ikamet büyük, yuvarlak hücreler odaklanarak iletilen ışık kullanarak merkezi beyin Onaylanmış bulun; epi-floresan kullanmayın. Bu uygulama ile daha kolay olur. Bu, mümkün olduğu kadar hafif olan en az miktarda için örnek göstermek için çok önemlidir. Zarar zamanlı görüntüleme beyinleri israf etmeyin. </li><li> Bir kez yerinde, konfokal kullanarak hızlı çekimlerininUygun yeri ve derinliği belirler. Ilk 10-15 mikron derinlik sınırlayın. Gerektiği gibi ayarlayın ve başka bir test görüntü almak. <ol><li> İsteğe bağlı adım: hayır xy kayma olmadığından emin olmak için ventral sinir kablosu bir test film toplayın. Sürüklenme tespit edilirse, yerleşmek için numune için 15-30 dakika bekleyin. Sürüklenme 30 dakika razı değilse, yeni bir örnek hazırlamak. Binbaşı sürüklenme genellikle aşırı yağ ilave geri takip edilebilir, ya da yağ eşitsiz boyutu montaj sırasında düşer. </li></ol></li><li> Eksenel kayması (z-drift) ortadan kaldırmak için bir kızılötesi LED kullanan bir sürekli otomatik odaklama aygıtı kullanın. Alternatif olarak, elle odak düzlemi düzeltin. </li><li> Ilgi konusu bir NB tanımlanır, görüntüleme rejimi ile devam edin. Tüm canlı hücre görüntüleme, lazer ışık miktarı, maruziyet süresi, kamera binning, objektif büyütme, zaman ve / veya z-adım aralığı ile tüm ampirik eldeki soruyu cevaplamak için belirli bir deney için optimize edilmelidir. Amacı ışık baraj en aza indirmek içinyaş iken yine de yararlı veri toplama. Ek rehberlik için açıklamalara bakın. <ol><li> Resim z-ekseninde 1 mikron aralıklı 12-14 görüntüleri toplayarak NB tüm hacmi. Aynı NB bir veya birden fazla hücre döngüsü yakalamak için zaman çözünürlüğü ayarlayın. Genel bir kural olarak, tek bir hücre döngüsü görüntüleme ve birden fazla hücre döngüsü için 1-3 dakika için 10-30 saniye aralıklarla aralıkları kullanın. </li></ol></li><li> Kritik adım: örnek mitoz süresini izleyerek sağlıklı olduğunu onaylayın. Mitoz fazla 15 dakika sürer, başka bir beyin geçmek. Sağlıklı bir beyin mitoz birkaç tur geçiren görüş aynı alanda bulunan birçok Onaylanmış gösterecektir. Her bir hücre döngüsü nedeniyle ışık hasarına biraz daha uzun bir öncekinden daha olduğuna dikkat edin. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, inkübasyon odası sökmeye ve gaz geçirgen kültürleme yemekler ama her atın. % 95 etanol ile kültür çanak yüzeyi durulayın ve bir doku ile de silin. Iki kez daha tekrarlayın. </li&gt; </ol> Immünofloresans için Brain 5. Hazırlanması <ol><li> Takviye edilen ortam içinde yaklaşık 0.2 ml ihtiva eden 1.5 ml tüp içine 20 ya da daha fazla eksplante beynini toplayın. </li><li> Tüpten Ortamı çıkarın ve (% 0.3 Triton X-100 ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, PBS) 0.5 ml PBSTx ile bir kez beyinleri yıkayın. Beyin sıvının tüm değişimleri arasında tüpün dibe olsun. Triton X-100, deterjan doku nüfuz edilebilir kılınması için kullanılmaktadır. Genellikle durulama en az 30 saniye sürer; beyin tüpün dibine yerleşmiş bir kere sadece PBSTx çıkarın. </li><li> PBSTx içinde seyreltilmiş% 9 elektron mikroskobu sınıf paraformaldehidin 0.5 ml çözelti değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> Tehlikeli atık yönetmeliklerine göre sabitleştirici bertaraf edin. </li><li> 15 dakika boyunca 0.5 ml PBSTx ile örnekleri yıkayın. Taze PBSTx iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> 0.5 ml PBT (PBS, 1 ile çözüm yerine% Bovine Serum Albumin (BSA) ve% 0.1 Tween-20). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın. Bu adım, blok dokuya antikorun spesifik olmayan bağlanma. </li><li> % 4 normal keçi serumu (NGS) ile desteklenmiş PBT içinde seyreltilmiş 0.5 ml birincil antikor ile çözüm değiştirin. 4 ° C de bir gece nutation ile inkübe </li><li> Seyreltilmiş primer antikor atın veya kaydedin. </li><li> 15 dakika boyunca 0.5 ml PBT ile örnekleri yıkayın. Taze PBT iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> 0.5 modifiye PBT ml (PBS,% 2 BSA,% 0.1 Tween-20 ve% 4 NGS) ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> Tadil edilmiş PBT ile seyreltilmiş 0.5 ml ikincil antikor ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> (% 0.1 Tween-20 ile PBS) 0.5 ml PBST ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın. Taze PBST&#39;de iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li></ol><ol><li> Dikkatlice slayt merkezinin soluna doğru sınırlayan damla bir cam slayt üzerinde bir damla olarak örnekleri aktarın. </li><li> Slaydın merkezine monte orta büyük bir düşüş (çapı yaklaşık 2 cm) (örneğin, Aqua-Poly/Mount) ilave edin. Sola doğru olan PBST havuz kaçının. </li><li> Montaj orta havuzuna PBST havuzundan beyinleri aktarmak için forseps kullanın. Beyinleri üstüne doğrudan montaj orta ekleyerek kendi yönünü bozabilir ve kaçınılmalıdır. </li><li> , Bir ışık mikroskobu altında, yukarı bakacak görüntüsü olacak yüzü montaj ortamı içinde örnekleri düzenlemek. </li><li> Işık mikroskobu altında sürgü ile, yavaş yavaş örneklerin üstünde bir # 1,5 daha düşük bir cam lamel. İsteğe bağlı adım: hafifçe lamel iterek küçük hava kabarcıklarını yerinden oynatın. </li><li> Montaj orta slaytlar yalan, bir gecede birkaç saat veya polimerize düz, ışık ver, oda sıcaklığında, koruma. </li><li> Slaytlar bir sonraki gün görüntü verilen ya da önceden görüntüleme için saklanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Truman, J. W., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+patterns+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+for+identified+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells+in+the+Drosophila+central+nervous+system.">Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system.</a> Development. 116, 855-863 (1992).</li><li>Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+asymmetry+for+proper+fitness,+function,+and+fate.">Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate.</a> Chromosome research. 21, 271-286 (2013).</li><li>Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+neural+stem+cell+proliferation+by+intermediate+progenitor+cells+in+Drosophila+brain+development.">Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development.</a> Neural development. 3, 5 (2008).</li><li>Bowman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressors+Brat+and+Numb+regulate+transit-amplifying+neuroblast+lineages+in+Drosophila.">The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila.</a> Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).</li><li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells.">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li><li>Savoian, M. S., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+primary+cultures+of+Drosophila+melanogaster+larval+neuroblasts.">Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts.</a> Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).</li><li>Fleming, S. L., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flattening+Drosophila+cells+for+high-resolution+light+microscopic+studies+of+mitosis+in+vitro.">Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).</li><li>Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Mad2+to+the+kinetochore+requires+the+Rod/Zw10+complex.">Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex.</a> Current biology. 15, 856-861 (2005).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li><li>Lucas, E. P., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+the+proper+connection+between+the+centrioles+and+the+pericentriolar+matrix+requires+Drosophila+centrosomin.">Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin.</a> J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+amplification+can+initiate+tumorigenesis+in+flies.">Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies.</a> Cell. 133, 1032-1042 (2008).</li><li>Conduit, P. T., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnn+dynamics+drive+centrosome+size+asymmetry+to+ensure+daughter+centriole+retention+in+Drosophila+neuroblasts.">Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome research. 6, 533-549 (1998).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat. Commun. 2, 243 (2011).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Live+Cell+Imaging+and+Automated+4D+Analysis+of+Drosophila+Neuroblast+Lineages.">Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells+by+transgenic+RNAi.">Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi.</a> Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Siegrist, S. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+cues+orient+the+cell+division+axis+in+Drosophila+embryonic+neuroblasts.">Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts.</a> Development. 133, 529-536 (2006).</li><li>Broadus, J., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+cues,+intrinsic+cues+and+microfilaments+regulate+asymmetric+protein+localization+in+Drosophila+neuroblasts.">Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).</li><li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila:+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms.">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li><li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis1/dynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Canlı hücre görüntüleme kök hücre ACD, hücre soylarının farklılaşmasını düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanılan çok değerli bir yaklaşım ve kompleks dokuların morfolojisi olan. Araştırma grupları tarihsel NB ACD görselleştirmek için çeşitli teknikler istihdam olmasına rağmen, bu yaklaşımlar genellikle öncelikle beyin dokusu bozulmadan sola veya ayrışmış olup olmadığını açısından farklılık iki kategoride toplanabilir. Görüntüleme ...

Kök hücreleri erken gelişim sırasında hücresel çeşitlilik oluşturmak ve yetişkin dokularda hasar gören hücrelerin yerine bir farklılaşma denge ve kendini yenileme korumak. Bu homeostazının düzenlenmesi kaybı ve zararlı doku dejenerasyonu ya da tümör oluşumu ile sonuçlanabilir kök hücre popülasyonunun aşırı genişlemesini hem de önler. Nöroblastomun (Onaylanmış) Drosophila merkezi sinir sistemi (Şekil 1A) embriyonik aşamalarında 1, 2 sırasında o ilk formu çok çalışılan nöral kök hücrelerdir. Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Onaylanmış iki eşitsiz kaderde hücreleri üretmek için asimetrik hücre bölünmesi (ACD) tekrarlanan mermi tabi. ACD sentrozom, çoğu hücre 3&#39;ün mikrotübül organizasyon merkezi olarak hareket olmayan zar organeller tarafından yönlendirilmektedir. Mitoz sırasında NB centrosomes düzenlemek ve apikal-bazal polar boyunca bipolar mitotik iğ yönlendirmekSığ ekseni. Bölünmesi NB ayrılması üzerine, kök hücre kaderini belirlemek apikal kader belirleyici ve farklılaşma belirtmek bazal kader belirleyici, eşitsiz kızı hücrelere ayrılmış olan. Larva orta beyinde, Onaylanmış iki tür bunların sayısı, konumu, transkripsiyon faktörü ifadesi ve hücre soyu (Şekil 1A) 4-6 ile ayırt edilebilir. I Onaylanmış en bol olan yazın ve yaklaşık 90 tanesi beyin 7 her optik lob ön ve arka tarafı doldurmak. Bu Onaylanmış transkripsiyon faktörü asense (Ase) ifade ve karakteristik bir kendini yenileyen NB bölmek ve bir küçük ganglion anne hücre (GMC; Şekil 1B). Her GMC iki nöron veya glia (Şekil 1B) oluşturmak için tek bir terminal bölümü uğrar. Buna karşılık, her bir optik lobun arka tarafını doldurmak sekiz Tip II NBs Ase ifadesini 5. yoksundur. Onlar ACD geçmesibir kendini yenileyen NB ve bir ara nöral progenitör (INP) üretmek. INP da, asimetrik 3-5 kez böler. InP rejenerasyonu ve tek GMC 4 üretiminde Bu bölümler bir sonuç her biri. Toplu olarak, özel NB kimliği ve GMC doğum zamansal sırası, yetişkin merkezi sinir sisteminin nöronal şaşırtıcı çeşitliliğine yol açar. NB ACD temelini hücre biyolojisi çok canlı hücre görüntüleme tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiştir Anlamak. Görüntü canlı NB&#39;ler için araştırmacılar tarafından kullanılan yayınlanan protokolleri yaygın olarak değişebilir. Genel olarak, bununla birlikte, bu yöntemler, larva beyin değişmeden kalır ya da mekanik olarak ayrışmış olup olmadığını ayırt iki genel kategoride toplanabilir. Her iki teknik araştırmacının uygulamaya bağlı olarak, farklı avantaj ve dezavantajları var. Canlı NB hücre Divi ortaya Erken raporlarları larva beyin manuel ayrışma bir dereceye içerir. Bu protokoller detay 8 bulaşıyor ya da cam lamelleri Onaylanmış kısa vadeli birincil kültürleri büyümek için ayrı 9 beyin alay. Görüntüleme geliştirmek için, yuvarlak Onaylanmış genellikle cam slaytlar 8 veya agaroz pedleri 9 ile ya lamelleri üzerinde düzleştirilir. Düzleştirilmiş hücreler optik geliştirilmiş olmasına rağmen, bu teknikler çoğu zaman bölünme karık gerileme ve birden çok kez bölmek için yetersizlik de dahil olmak üzere, NB mitotik kusurlarına yol açar. Bu nedenle, manuel Ayrışma ve larva beyin dokusunun fiziksel bozulmasını hem içeren protokolleri genellikle sadece çok kısa vadeli (yani., Bir hücre döngü ya da daha az) uygulamaları için uygundur. Aynı şekilde, yarı silinmesine veya tamamen cam slaytlar ve lamelleri arasındaki sağlam beyinleri düzleştirme birinin bir, yaklaşık 30 dakikalık bir süre için 10, belirli bir örnek görüntüleme harcayabilir zamanını sınırlar. Bu sınırlama, thi rağmenyaklaşımı başarıyla 11-14 kullanılmaktadır. Görüntü canlı için son çabalar NBs limiti izole hücrelerin fiziksel bozulma ayrışmış. Bu teknikler, birden fazla hücre bölünmesi devir için hücre kültürlerinin sürdürmek için gerekli olan uygulamalar için özellikle yararlıdır. Örneğin, el ile ayrışmış beyinlerinden alınmış dağılmış hücrelerden, kısmen uzun süreli görüntüleme 16 fibrinojen ve trombin 15 karışımından yapılan bir pıhtı gömülü olabilir. Seçenek olarak ise, eksplante beyin kimyasal olarak, enzim bir sonraki el ile bir pipet ucu ile tekrar geçirilerek kesintiye kolajenaz, ve daha sonra poli-L-lisin-kaplamalı cam alt yemekler 17, 18, ​​kaplama ile ayrıştırılmış ilk olabilir. Fibrinojen ya da poli-L-lisin ya cam yemekleri Kaplama önemli fiziksel bozulma olmadan mümkün olduğu lamel onları yakın getirerek, yuvarlak hücrelerin yayılmasını eki ve hafif teşvik etmektedir. Additi yılında, bu yöntemler, hali hazırda pertürbasyon farmakolojik deneyler 18 için değiş tokuş edilebilir bir ortam içinde kültür edilmesini Onaylanmış içerir. Genel olarak, doğrudan kaplama NBs uzun vadeli görüntüleme yetenekleri ödün vermeden görüntüleme optik geliştirir dağıldılar. Son zamanlarda, ayrışmış Onaylanmış uzun vadeli kültürlemenin açıklayan bir protokol 19 ayrıntılı olmuştur. Ancak, bu yaklaşım sınırlamaları olmadan değildir. Canlı ayrışmış Onaylanmış görüntüleme için çeşitli uyarılar vardır. Dağılmış bir hücre alanında, örneğin, uzamsal olarak sağlam bir beyin 1 düzenlenmesiyle belirli NB soy tespit etmek zordur. Aynı şekilde, Tip II ayrışmış doku içinde Onaylanmış karşı Tip I ayırt örneğin worniu-GAL4, asense Gal80-20 gibi soy ajanları ya da alt tip spesifik transgenlerin, ekspresyonuna olmadan da zordur. Bu transgenler, bazı uygulamalar için oldukça yararlı olsa da, bu eski transgenler için araştırmacılar sınırı yokturUAS güçlendirici elemanın 21 kontrolünde preslenmiş ve daha karmaşık genetik düzenleri gerektirir. Onaylanmış mekansal ya da zamansal geliştirilmesiyle ilgili çalışmalar, bu nedenle, bir sağlam doku bağlamında in vivo görüntüleme gerektirir. Ayrıca, ayrışmış embriyonik Onaylanmış çalışmaları önemli polarite interfaz lokalizasyonu 22, 23, belirleyicilerinin için bitişik hücrelerin fiziksel temas kritik olduğunu gösterir. Bu çalışmalar tamamen izole NBs artık değişmez mitotik iğ ekseni korumak göstermektedir. Bunun yerine, bu hücreler nedeniyle belki de apikal centrosome konumlandırma 22 kaybı daha randomize mili ekseni ve ardışık GMC tomurcukları arasındaki ayrılık, geniş açıları gösterilecek. Larva NB&#39;ler ve komşu hücreler arasındaki ilişki yaygın olarak incelenmiştir olmasına rağmen, bu larva kök hücre mikroçevresinin hücre polarite veya diğer değindiği olabileceğini dikkate değerdavranışları. Larva Onaylanmış fizyolojik içeriği muhafaza edilmesi için, tüm beyinlerinden biz görüntü ACD. Görüntüleme ayrışmış NB&#39;ler ile ilişkili doğal sınırlamalar dikkate alındığında, bizim laboratuvar ve diğerleri bütün larva beyinlerinden NB KHA görüntü ardışık tur protokolleri kurduk. Görüntü bozulmadan beyin teknikler genellikle doku bozulmasını veya zarar görmesini önlemek ve gaz değişimi için izin vermek için esnek bir membran ile kültür odasının bir tarafında cam sert yüzey değiştirin. Bazı yöntemler böcek kültür ortamı, serum ve on larva 24 izole edilmiş organlarla yağ, askorbik asit içeren bir karışım içerisinde eksplante beyinleri montaj içerir. Bu NB hücre bölünmesini teşvik 25 bilinen bir mitojen salgılayan için izole edilmiş yağ gövdeleri eklenir. Bu protokol üzerinde 3 saat için doku bütünlüğünü koruyan ve uzun süreli görüntüleme 24, 26-28 için uygun, bu nedenle,. Son zamanlarda, boylam açıklayan bir protokolaskorbik asit, serum ve yağ organlar mevcudiyetinde sağlam larva beyinlerin g İÇİ görüntüleme 29, ayrıntılı edilmiştir. Doku maruz ne de hareketsizleştirilir için önemlisi, bu yaklaşım kültürleme ortam değiştirilir uygulamalar için daha az faydalı olan (örneğin, vb, ilaç araştırmaları, imüno-,.). Bizim laboratuvar uzun vadeli görüntüleme 30, 31 canlı larva beyinlerinin bütün montaj hazırlanmasını kolaylaştırmıştır. Başkaları üzerinde bizim protokolüne ana avantajı basitliği: bizim gözlemler NB KHA görüntü ardışık tur için gerekli katkı maddeleri ne serum, askorbik asit, insülin, ne de yağ organları gösterir. İnsülin gibi katkı maddeleri, kök hücre bölünmesi 32 ve Drosophila yumurtalık 33 toplu hücre göçü uzun görüntüleme için yararlı olmuştur, ancak eden görüntüleme ortamı sta basit bir karışımından oluşur, onlar, NB ACD için önemsiz görünmektedirndard böcek hücre kültürü ortamı bulaşmasını önlemek için antibiyotik-antimikotik ile takviye edilmiştir. Yeniden gaz-geçirgen veya cam alt kültür yemekleri kullanımı sayesinde, biz ardışık NB acds birkaç tur sürdürmek mümkün olmuştur. Aynı eksplante örnekler hali hazırda, bağışıklık ve sabit dokusu ile diğer işlemler için de kullanılabilir. Bu protokol, biz detay sağlam larva beyinlerinin diseksiyonu, yanı sıra canlı ve sabit hem de analiz için beyin hazırlanması.

<table><tbody><tr><td>Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 &amp;#956;g/ml), and amphotericin B (25 &amp;#956;g/ml) that is added to Schneider&#039;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td></tr><tr><td>Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle/probe with plastic handle</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, 0.22 &amp;#956;m pore size</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 32% EM-grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td></tr></tbody></table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Kök hücreler, eşitsiz kader potansiyelli iki döl hücreleri üretmek için asimetrik bölün. Asimetrik kök hücre bölünmesi çalışmanın sağlam bir alan olmuştur yöneten mekanizmaların anlaşılması, geliştirilmesi ve hastalık onların alaka önüne alındığında. Bunlar genetik uysal ve bir kez, her saat hücre bölünmesinin ardışık mermi geçmesi için, Drosophila merkezi sinir sistemi veya neuroblasts kök hücreler, kök hücre bölünme çalışma için vazgeçilmez modellerdir. Yaklaşık 100 nöral kök hücre canlı görüntüleme çalışmaları için mikroskopi Bu model sistemi, özellikle faydalı bir hale getirir, her iki larva beyin lob her yüzeyine yakın olarak yerleştirilir. Bu çalışmada, yaygın kök hücre bölünmeleri görselleştirmek için kullanılan çeşitli yaklaşımlar gözden ve biz göreceli avantaj ve bozulmamış beyin dokularında karşı ayrışmış çalıştırırız bu tekniklerin dezavantajlarını ele. Biz de detay bizim simplified protokol canlı hücre görüntüleme için Üçüncü dönem larva ve sabit analiz uygulamaları bütün beyinleri eksplantasyona için kullanılır.

Canlı görüntüleme, NB ACD düzenleyen mekanizmalar bir dizi açıklamıştır. Önceki görüntü elde etme için, bu uygun görüntüleme koşulları belirlemek için gereklidir. Bu canlı hücre görüntüleme süresi ile kare yakalama hızını dengelemek için gereklidir. Ince hücre analizi için, örneğin, geçici artış ve optik çözünürlük gerekli olabilir. Tek bir NB hücre döngüsü (Şekil 4A) imgelerken, görüntüler yakalanır hangi hızı fotohasar tanıtan olmadan artabilir. T...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts at JoVE.com

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.8K Görüntüleme.  National Institutes of Health.  Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir. 

Video: Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Nörobilim

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Biyomühendislik

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biyoloji

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Canlı Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı-görüntüleme

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Canlı Görüntüleme ve Yaralanma Yanıtları Çalışması için Mikroakiskan Chips kullanma

Uzun süreli Canlı Görüntüleme

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi