Este trabalho foi apoiado pela divisão de pesquisa intramural no National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) e um Lenfant Biomédica bolsa pós concedidos a DAL.

1. Preparação de materiais necessários para Explante Brains terceiro instar larval <ol><li> Preparar as ferramentas necessárias para a microdissecção. <ol><li> Forjar duas ferramentas de dissecação (um bisturi e um gancho), colocando primeiro um único pino de dissecação em cada titular pino. Prenda os pinos firmemente com a mão ou com um alicate (Figura 1C). </li><li> Use um par de pinças de idade para dobrar um pino de dissecação de um ângulo de aproximadamente 120 °. Faça isso sob um microscópio de dissecação para garantir que a metade superior do pino fica plana quando o titular do pino é segurado na mão. Esta ferramenta deverá ser utilizada como um bisturi para soltar ou cortar através do tecido. </li><li> Utilizar um par de pinças de idade para dobrar o segundo pino para um gancho que vai ser utilizado para segurar e raspar o tecido. </li><li> Cobrir cada uma das ferramentas de dissecação com uma ponta de pipeta para proteger as ferramentas de danos. Com cuidado, ferramentas bem formadas podem ser usados ​​para dissecção indefinidamente. Substitua pinos danificados ou deformados, se necessário. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Prepare dissecando médio. <ol><li> Em uma capa de cultura de tecidos, diluir o suplemento de antibiótico-antimicótico em meios de cultura da Schneider. Agitar os meios de incorporar o suplemento. </li><li> Prepare várias alíquotas de 5 ml de meio suplementado. Guarde todos os meios a 4 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Aquecer-se uma alíquota de 5 ml de meio de cultura suplementado para a temperatura ambiente. Desenhe o meio em um estéril seringa de 5 ml e parafuso em um filtro estéril seringa 0,2 m. </li></ol></li><li> Selecione larvas para dissecção. Use uma sonda dissecando para selecionar o rastreamento de larvas de terceiro estádio como o cérebro vai ser mais fácil de dissecar. Opcional: larvas de depósito em uma placa de ágar de uva. Nota: Não use frascos excessivamente cheia ou as garrafas com &quot;comida molhada&quot;, uma vez que estes tendem a forçar segundo ou primeiro larvas se arrastar para fora prematuramente. Nota: Algumas origens genéticas exigirá usando larvas mais jovens. Isso não afeta o protocolo, mas faz a dissection mais difícil. </li></ol> 2. Dissecção do Sistema Nervoso Central <ol><li> Em uma única lâmina de vidro, criar duas piscinas de 50 ml de meio de dissecação quentes, separadas por cerca de 3 cm. Uma piscina será utilizada para dissecção e outros utilizados para dissecção fina (Figura 1C). </li><li> Transferir várias larvas de uma das gotas de comunicação. </li><li> Mova a lamela com larvas de um microscópio de dissecação. Zoom na piscina contendo as larvas de tal modo que as extremidades anterior e posterior das larvas são discerníveis. </li><li> Use um pares de fórceps para apreender o meio-região de uma única larva. Tome um segundo par de pinças na outra mão e agarrar a larva perto da mesma região. Puxe os dois pares de fórceps para além de rasgar delicadamente a larva ao meio. Repita os dois passos acima para todas as larvas na lamela. </li><li> Descarte as metades posterior do corpo larval, transferindo-os para um tecido. </li><li> Zoom em uma larva de modo que poe mouthhooks anteriores são claramente visíveis. Usar dois pares de forceps para criar uma pequena incisão, ou entalhe, em lados opostos das mouthhooks larvais entre o terceiro torácica e bandas denticle primeiros anterior. </li><li> Segure as mouthhooks com a pinça na mão não-dominante. Use a pinça na outra mão para descascar suavemente a cutícula em uma direção ântero-a-posterior. Continue a remover lentamente cutícula até que o sistema nervoso central está exposta. </li><li> Isolar o sistema nervoso central, a partir do resto da larva por rasgar os tecidos com a pinça. Tenha cuidado para não perturbar o sistema nervoso central. Passo crítico: Não puxe o sistema nervoso central! Descarte amostras danificadas com um cabo rompido ventral do nervo (Figura 2A) ou lóbulos ópticos distorcidas (Figuras 2B e 2B). </li><li> Repita os dois passos acima para todas as larvas na lamela. Transferir o tecido enxertado saudável para osegunda (limpo) piscina de meio na lamela para a fase de dissecação bem. </li><li> Use as ferramentas de pinos de dissecação para limpar os tecidos periféricos (por exemplo, olhos, asas e pernas discos) do cérebro. Deslize o bisturi entre o queria (cérebro) eo tecido indesejado, prendendo o tecido conjuntivo para a lamela. Use o gancho para provocar suavemente o tecido indesejado enquanto pressiona simultaneamente o bisturi para a lamela em movimentos de serra-like. </li><li> Passo crítico: Trabalhe lentamente e deliberadamente para remover todos os discos de cada cérebro. Tenha cuidado para não perturbar a morfologia do cérebro. Um cérebro saudável terá um cordão intacto ventral do nervo e simétrica, lobos ópticos redondos (Figura 2C). </li></ol> 3. Montagem Brains explantado for Imaging ao vivo <ol><li> Inverta a placa de cultura de 50 milímetros permeável ao gás com a película transparente virada para cima (Figura 2D). Pressione a seringa para depositar uma pequena queda (cerca de 30 mL) de meio em tele o centro do prato. </li><li> Transferir os cérebros isolados, um de cada vez, para a gota do meio do prato. Use a ferramenta gancho para pegar um cérebro sob os lóbulos ópticos. Em alternativa, utilize uma pinça para agarrar axônios se projetam a partir do cordão nervoso ventral. </li><li> Colete 5-10 cérebros na queda de meio. Submergir os cérebros usando as ferramentas de pinos de dissecação para empurrar cérebros individuais para a parte inferior da gota de meio como muitos deles serão presos no menisco (Figura 2E). </li><li> Orientar os cérebros utilizando as ferramentas de pinos de dissecação para alinhar cérebros dependendo do RN a ser trabalhada (Figura 3A). Para a imagem do RN dorsal, coloque o cordão nervoso ventral virada para baixo (ao longo da membrana). Para os RN imagem Antério-ventral, coloque o cérebro com o cordão nervoso ventral voltada para cima (longe de membrana). Alinhar o cérebro de modo a que todos os cordões nervosos ventrais apontam na mesma direcção no plano xy. </li><li> Use uma seringa ou de transferência de plástico pipette colocar 4 halocarboneto (HC) gotas de óleo (cerca de 30 mL cada) para a membrana permeável a gás. O volume de cada gota de óleo deve ser equivalente ao outro e para a gota de meio. Espaço as gotas de óleo correspondem aos quatro cantos de uma lamela centrado ao redor da gota de meio de cultura. Uma vez concluída, as cinco gotas (quatro gotas de óleo e uma gota de meio no centro) será semelhante as cinco facetas em estilo ocidental dados (Figura 3B). </li><li> Diminuir a # 1,5 22 milímetros lamela sobre a montagem de tal forma que ela atinge todos os 5 gotas, ao mesmo tempo. A manutenção de uma pressão uniforme através das amostras reduz a probabilidade de que eles serão interrompidos. Espera cerca de 3 minutos, como o petróleo e meio dispersar sob o peso da lamela. A forma de cruz-como dos meios de comunicação formarão (Figuras 3C e 3D). </li><li> Passo crítico: Abaixe a lamela sobre a superfície do cérebro, removendo o excesso de mídia usando um pavio de papel tissue (Figure 3C). Faça isso enquanto assistia a amostra sob o escopo de dissecação. Como a mídia é removido, a lamela vai diminuir. Pare de uma vez a lamela toca os cérebros. Não excesso de pavio, pois isso fará com que a distorção do tecido do cérebro ou explosões. </li><li> Se imagem dorsal RN (Figura 3E), passar para o passo 3.9. Se imagem RN Antério-ventral, a lamela deve ser ligeiramente movido (por gentilmente empurrando-o com uma pinça) na direção das pontas do cordão nervoso ventral. Isso faz com que o cérebro a girar, que traz os lóbulos cerebrais em contato direto com a lamela para facilitar a imagem (Figura 3F). </li><li> Selar a câmara cercando a lamela com pequenas quantidades de óleo de hidrocarbonetos halogenados (Figura 3D). O excesso de exsudação do óleo lamela deve ser minimizado e apagou afastado com um lenço de papel. </li></ol> 4. Imagens ao vivo da Central Neuroblastos cérebro Nota: Para este trabalho, a fiação de disco Nikon Eclipse Timicroscópio confocal (microscópio invertido) foi usado para imagens em tempo real; detalhes de nossa configuração foi publicado anteriormente 31. Alternativamente, a amostra pode ser visualizada usando um sistema vertical. <ol><li> Adicionar uma gota de óleo de imersão para a lamela logo acima dos cérebros montados. Isso ajudará a centrar o objetivo diretamente acima da amostra. </li><li> Passo crítico: Manter os cérebros a uma temperatura constante de 25 ° C, com uma fase de incubadora. Suavemente posicionar a amostra montada na incubadora fase e cobrir a câmara com a sua tampa. </li><li> Localize RN cerebrais centrais usando luz transmitida, concentrando-se sobre as células grandes e redondas que residem nas áreas centrais e mediais dos lobos ópticos, não use epi-fluorescência. Isto torna-se mais fácil com a prática. É muito importante para expor a amostra para a menor quantidade de luz possível. Não perca tempo cérebros de imagem que estão danificados. </li><li> Uma vez no local, tomar posições rápidas usando o confocal adeterminar a localização adequada e profundidade. Limitar a profundidade para o primeiro de 10-15 ^ m. Ajuste conforme o necessário, e ter outra imagem de teste. <ol><li> Etapa opcional: Colete um filme teste do cordão nervoso ventral para garantir que não haja desvio xy. Se deriva é detectado, esperar 15-30 min para a amostra para resolver. Se a deriva não resolve em 30 minutos, preparar uma nova amostra. Maior deriva geralmente pode ser rastreada até a adição de excesso de óleo, ou o tamanho desigual de gotas de óleo durante a montagem. </li></ol></li><li> Para eliminar desvio axial (z-drift) usar um dispositivo com foco automático contínuo que usa um LED infravermelho. Alternativamente, corrigir manualmente o plano focal. </li><li> Uma vez que um NB de interesse é identificado, prossiga com regime de imagem. Tal como acontece com todas imagens de células vivas, a quantidade de luz laser, tempo de exposição, câmera binning, ampliação objetiva, tempo e / ou intervalo z-passo devem todos ser empiricamente otimizado para uma experiência particular para responder à pergunta em questão. O objetivo é minimizar barragem luzidade, enquanto ainda a coleta de dados úteis. Veja a discussão para orientação adicional. <ol><li> Imagem de todo o volume do RN através da recolha de 12-14 imagens espaçadas de 1 mícron no eixo z. Ajustar o tempo de resolução para captar os ciclos celulares simples ou múltiplos de um mesmo NB. Como orientação geral, use 10-30 intervalos seg para a imagem latente do ciclo celular única e 1-3 minutos de intervalo para vários ciclos celulares. </li></ol></li><li> Passo crítico: Confirme se a amostra é saudável, monitorando a duração da mitose. Se mitose leva mais de 15 minutos, passar para outro cérebro. Um cérebro saudável vai mostrar muitos RN dentro do mesmo campo de visão passando por várias rodadas de mitose. Note-se que cada ciclo celular é ligeiramente mais longo do que o anterior, devido a danos provocados pela luz. </li><li> Depois de imagens estiver concluída, desmontar a câmara de incubação, e descartar tudo, mas os pratos de cultivo gás-permeáveis. Lavar superfície prato da cultura com 95% de etanol e limpar bem com um tecido. Repita mais duas vezes. </li&gt; </ol> 5. Preparação de cérebros para Imunofluorescência <ol><li> Colete 20 ou mais explantes cérebros em um tubo de 1,5 ml contendo aproximadamente 0,2 ml de meio suplementado. </li><li> Remova o meio a partir do tubo e lavar uma vez com cérebros 0,5 ml PBSTx (Tampão fosfato salino, PBS, com 0,3% de Triton X-100). Vamos cérebros assentar no fundo do tubo de entre todas as trocas de líquido. O detergente Triton X-100 é usado para permeabilizar o tecido. A lavagem geralmente leva menos de 30 seg; simplesmente remover o PBSTx uma vez cérebros se instalaram para o fundo do tubo. </li><li> Substitua a solução com 0,5 ml de 9% elétron paraformaldeído grau microscopia diluído em PBSTx. Incubar com nutação durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Descarte de fixador acordo com os regulamentos de resíduos perigosos. </li><li> Lavar as amostras com 0,5 ml PBSTx durante 15 min. Repita o passo de lavagem com PBSTx fresco mais duas vezes. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de PBT (PBS, 1% Albumina de Soro Bovino (BSA), e 0,1% de Tween-20). Incubar com nutação durante 1 hora à temperatura ambiente. Bloqueia a ligação não específica de anticorpos para o tecido esta etapa. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de anticorpo primário diluído em PBT suplementado com 4% de soro de cabra normal (NGS). Incube com nutação durante a noite a 4 ° C. </li><li> Descarte ou salvar o anticorpo primário diluído. </li><li> Lavar as amostras com 0,5 ml de PBT durante 15 min. Repita o passo de lavagem com PBT fresco mais duas vezes. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de modificada PBT (PBS, BSA a 2%, 0,1% de Tween-20 e 4% de NGS). Incubar com nutação durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de anticorpo secundário diluído em PBT modificado. Incubar com nutação durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Substituir a solução com 0,5 ml de PBST (PBS com 0,1% de Tween-20). Incubar com nutação durante 15 minutos à temperatura ambiente. Repita o passo de lavagem com PBST fresco mais duas vezes. </li></ol><ol><li> Transferir cuidadosamente as amostras, tal como uma gota sobre uma lâmina de vidro, limitando a queda para o lado esquerdo do centro da lâmina. </li><li> Adicionar uma grande gota (cerca de 2 cm de diâmetro) de meio de montagem (por exemplo, Aqua-Poly/Mount) para o centro da lâmina. Evite a piscina de PBST que é para a esquerda. </li><li> Use uma pinça para transferir os cérebros a partir da piscina de PBST para o tanque de meio de montagem. A adição de meio de montagem directamente na parte superior do cérebro pode perturbar a sua orientação e deve ser evitada. </li><li> Sob um microscópio de luz, providenciar as amostras no meio de montagem com o lado que vai ser trabalhada voltada para cima. </li><li> Com a lâmina sob o microscópio de luz, abaixe lentamente uma lamela de vidro # 1.5 no topo das amostras. Etapa opcional: Desalojar bolhas de ar menores levemente empurrando a lamela. </li><li> Permitir que o meio de montagem para polimerizar por várias horas, ou durante a noite, por mentir lâminas planas, de luzprotegida, à temperatura ambiente. </li><li> As lâminas podem ser visualizados no dia seguinte, ou armazenados para imagem. </li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li><li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+the+model+to+the+test:+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity,+axon+outgrowth,+and+axon+targeting.">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li><li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells.">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li><li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia/flagella+function,+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis.">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole,+but+is+dispensable+for+centriole+duplication.">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li><li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila.">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li><li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares.">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Imagens de células vivas é uma abordagem valiosa usada para estudar os mecanismos que regulam a ACD de células-tronco, a diferenciação de linhagens celulares, ea morfogênese de tecidos complexos. Embora os grupos de pesquisa têm historicamente utilizada uma variedade de técnicas para visualizar NB ACD, estas abordagens podem ser geralmente agrupadas em duas categorias que diferem principalmente no que diz respeito ao facto de o tecido cerebral é deixada intacta ou dissociada. Imagem...

As células-tronco manter um equilíbrio de diferenciação e auto-renovação para gerar diversidade celular durante o desenvolvimento precoce e substituir as células danificadas em tecidos adultos. A regulação deste homeostase impede tanto a perda como sobre-expansão da população de células estaminais, o que pode resultar em degeneração de tecido nocivo ou tumorigénese. Os neuroblastos (RN), são as células estaminais neurais amplamente estudadas do sistema nervoso central de Drosophila (Figura 1A), que durante a primeira forma estágios embrionários 1, 2. RN submetidos a repetidos ciclos de divisão celular assimétrica (ACD) para produzir duas células desigualmente predestinadas: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação celulares. ACD é guiado por centrossomas, as organelas não-membranosas que atuam como centros de microtúbulos-organização da maioria das células 3. Durante a mitose, centrossomas NB organizar e orientar o fuso mitótico bipolar ao longo do apical-basal polareixo dade. Após a clivagem da NB dividindo, determinantes destino apicais que especificam o destino de células-tronco, e determinantes destino basais que especificam diferenciação, são segregados em células filhas desiguais. No cérebro central larvar, dois tipos de RNs podem ser distinguidas pelo seu número, posição, expressão do factor de transcrição, e da linhagem de células (Figura 1A) 4-6. Tipo I RN são os mais abundantes, e cerca de 90 deles preencher os anteriores e posteriores lados de cada lóbulo óptico do cérebro 7. Estes RN expressar o fator de transcrição Asense (ASE), e eles caracteristicamente se dividem em uma auto-renovação NB e um menor célula-mãe gânglio (GMC; Figura 1B). Cada GMC passa por uma única divisão terminal para gerar dois neurônios ou células gliais (Figura 1B). Em contraste, os RN oito do tipo II que povoam o lado posterior de cada lobo óptico falta Ase expressão 5. Eles sofrem ACDpara produzir um NB auto-renovação e um progenitor neural intermediária (INP). O INP, por sua vez, divide assimetricamente três a cinco vezes. Cada uma dessas divisões conduz à regeneração do INP e a produção de um único GMC 4. Colectivamente, a identidade específica NB e a ordem temporal de GMC nascimento dá origem à diversidade surpreendente neuronal do sistema nervoso central adulto. Compreender a biologia das células que subjaz NB ACD foi vastamente melhorada através do uso de técnicas de imagem de células vivas. Publicado protocolos utilizados pelos pesquisadores para a imagem RN ao vivo variam muito. Em geral, no entanto, estes métodos podem ser agrupados em duas categorias gerais que se distinguem pelo facto do cérebro larval é deixada intacta ou mecanicamente dissociadas. Ambas as técnicas apresentam vantagens e desvantagens distintas, dependendo da aplicação do pesquisador. Os primeiros relatos revelam divi célula NB ao vivoes envolvem um certo grau de dissociação Manual do cérebro larval. Estes protocolos detalhes manchas 8 ou 9 provocando além do cérebro, a fim de crescer culturas primárias de curto prazo do RN em lamínulas. Para melhorar a imagem, os RN redondas são geralmente achatado nas lamelas em que suas lâminas de vidro 8 ou almofadas de agarose 9. Embora as células achatadas têm melhorado óptica, estas técnicas conduzem frequentemente a defeitos mitóticas RN, incluindo a regressão do sulco de clivagem e a incapacidade para se dividem mais do que uma vez. Por conseguinte, os protocolos que envolvem a dissociação manual e distorção física do tecido cerebral de larvas são geralmente apenas adequados para a muito curto prazo (isto é., Um ciclo de célula ou menos) aplicações. Da mesma forma, semi-esmagamento ou achatamento completamente cérebros intactos entre lâminas de vidro e lamelas limita o tempo pode-se passar a imagem de um dado espécime para um período de 10 minutos, aproximadamente, 30. Apesar desta limitação, this abordagem tem sido utilizada com sucesso 11-14. Esforços recentes para a imagem ao vivo dissociada limite RN distorção física das células isoladas. Estas técnicas são particularmente úteis para aplicações em que é necessária para sustentar a culturas de células de múltiplos ciclos de divisão celular. Por exemplo, as células dispersas do cérebro dissociados manualmente pode ser parcialmente incorporado num coágulo feita a partir da mistura de fibrinogénio e trombina 15 para geração de imagens de longo prazo 16. Alternativamente, os cérebros explantados pode ser primeiro quimicamente dissociados com a enzima colagenase, próximo interrompido manualmente, por passagem repetida através de uma ponta de pipeta, e subsequentemente semeadas em poli-L-lisina-revestidas de vidro pratos de fundo 17, 18. Revestimento pratos de vidro com ou fibrinogênio ou poli-L-lisina promove o anexo e leve disseminação de células redondas, trazendo-o mais próximo da lamela quanto possível, sem grande distorção física. Em comum, alémem, estes métodos envolvem a cultura da RN em meio que pode ser facilmente trocado por experimentos de perturbação farmacológicas 18. No geral, chapeamento diretamente dispersa RN melhora óptica de imagem sem sacrificar a capacidade de imagem de longo prazo. Recentemente, um protocolo descrevendo a cultura de longo prazo de dissociada RN foi detalhado 19. No entanto, esta abordagem não é sem as suas limitações. Existem várias ressalvas à imagem RN ao vivo dissociados. Num campo de células dispersas, por exemplo, é difícil identificar linhagens NB específicos que são espacialmente organizadas no cérebro intacto 1. Da mesma forma, distinguir o tipo I versus Tipo II RN no tecido dissociado é também um desafio, sem a expressão de marcadores de linhagem ou transgenes específicos do subtipo, como worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Embora esses transgenes são bastante úteis para algumas aplicações, eles não limitam aos investigadores transgenes expressionado sob o controlo do elemento intensificador UAS 21 e exigem sistemas genéticos mais complexos. Estudos que dizem respeito ao desenvolvimento espacial ou temporal de RN, portanto, exigem in vivo de imagens no contexto de um tecido intacto. Além disso, estudos de RN embrionárias dissociadas indicam que o contacto físico das células adjacentes é crítica para a localização da interfase de polaridade chave determinantes 22, 23. Esses estudos mostram completamente isolado RN não mais manter o eixo do fuso mitótico invariante. Em vez disso, estas células apresentam um eixo de fuso mais aleatórios e largos ângulos de separação entre as sucessivas gomos GMC, talvez devido à perda de apicais posicionamento centrossoma 22. Embora a relação entre os RN de larvas e suas células vizinhas não tem sido extensivamente estudada, vale a pena considerar que o microambiente de células-tronco larval pode invadir a polaridade celular ou outrocomportamentos. Para manter o contexto fisiológico de larvas RN, que imagem a partir de cérebros inteiros de ACD. Dadas as limitações inerentes a imagem dissociada RN, o nosso laboratório e outras estabeleceram protocolos de imagem sucessivas rondas de NB ACD de cérebros larvas inteiras. Técnicas para a imagem cérebros intactos, muitas vezes substituir a superfície rígida de vidro de um lado da câmara de cultura com uma membrana flexível, para evitar a distorção do tecido ou danos e para permitir a troca de gás. Alguns métodos envolvem a montagem cérebros explantados em uma mistura de meio de insecto de cultura, soro, e ácido ascórbico com os corpos gordos isolados a partir de dez larvas 24. Os corpos gordos isolados são adicionados porque eles secretam um mitógeno conhecido por estimular a divisão celular NB 25. Este protocolo preserva a integridade do tecido por mais de 3 horas e é, por isso, passíveis de imagens de longo prazo 24, 26-28. Recentemente, um protocolo descrevendo o lonimagiologia g prazo de cérebros larvais intactas na presença de ácido ascórbico, o soro, e corpos gordos foi detalhado 29. Importante, porque o tecido é exposto nem nem imobilizados, esta abordagem é menos útil para aplicações onde o meio de cultura é trocado (por exemplo, estudos de drogas, imunodepleção, etc.). Nosso laboratório simplificou toda a preparação monte de cérebros de larvas vivas para imagens de longo prazo 30, 31. A principal vantagem para o nosso protocolo sobre os outros é a sua simplicidade: as nossas observações indicam nem soro, ácido ascórbico, a insulina, nem corpos gordos são aditivos necessários à Imagem sucessivas rondas de NB ACD. Apesar de aditivos, tais como insulina, têm sido úteis para a imagem prolongado de divisões de células-tronco 32 e migração celular colectivo em Drosophila ovários 33, eles parecem ser dispensável para NB ACD, como nosso meio de imagem consiste de uma mistura simples de standard meio de cultura de células de inseto suplementado com antibiótico-antimicótico para evitar a contaminação. Através do uso de placas de cultura de fundo gás-permeáveis ​​ou de vidro reutilizáveis, temos sido capazes de sustentar várias rodadas de sucessivas NB DACs. As mesmas amostras de explante pode ser prontamente utilizado para imunofluorescência e outros procedimentos com tecido fixado. Neste protocolo, detalhamos a dissecação de cérebros de larvas intactas, bem como a preparação de cérebros para a análise tanto ao vivo e fixo.

<table><tbody><tr><td>Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 &amp;#956;g/ml), and amphotericin B (25 &amp;#956;g/ml) that is added to Schneider&#039;s S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>A high viscosity inert oil that is clear and colorless.</td></tr><tr><td>Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting needle/probe with plastic handle</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, 0.22 &amp;#956;m pore size</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 32% EM-grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>A dye that labels DNA and is excited by UV light.</td></tr></tbody></table>

live imaging of drosophila larval neuroblasts

As células-tronco se dividem de forma assimétrica para gerar duas células de progênie com desigual potencial destino: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação de uma célula. Dada a sua relevância para o desenvolvimento e da doença, compreender os mecanismos que regem a divisão de células-tronco assimétrico tem sido uma área forte de estudo. Porque eles são geneticamente tratável e submetidos a ciclos sucessivos de divisão celular uma vez a cada hora, as células estaminais do sistema nervoso central, de Drosophila, ou neuroblastos, são modelos indispensáveis ​​para o estudo da divisão de células estaminais. Cerca de 100 células estaminais neurais estão localizadas próximo da superfície de cada um dos dois lobos cerebrais larvais, tornando este sistema modelo particularmente útil para estudos de microscopia de imagens em tempo real. Neste trabalho, nós revisamos várias abordagens amplamente utilizado para visualizar as divisões de células-tronco, e abordar as vantagens e desvantagens relativas as técnicas que empregam dissociados contra tecidos cerebrais intactas. Nós também detalhar nossa simplifprotocolo IED usado explantar cérebros inteiros a partir de larvas de terceiro estádio de imagens de células vivas e aplicações de análise fixos.

Imagens ao vivo elucidou uma série de mecanismos que regulam NB ACD. Antes da aquisição da imagem, é necessário determinar as condições de imagem ideal. É necessário equilibrar a taxa de captura de quadro com a duração de imagens de células vivas. Para a análise celular fina, por exemplo, o aumento temporal e resolução óptica pode ser necessária. Ao visualizar um único ciclo celular NB (Figura 4A), a taxa na qual as imagens são captadas pode ser aumentada, sem a introdução de fotoen...

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Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

14.8K visualizações.  National Institutes of Health.  Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados. 

Vídeo: Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Neurociência

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengenharia

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Imagem de explantes cerebrais vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor em destaque: Investigando a dinâmica assimétrica da divisão celular: um protocolo para imagens ao vivo de explantes cerebrais de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Imagens ao vivo de

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Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

Imagem de células vivas de cérebros de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster

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