Los autores desean dar las gracias al Programa Iniciativa Interdisciplinar de Innovación de la Universidad de Illinois, conceder 12035. SK fue financiado en UIUC de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF) de Grant 0965918 IGERT: Formación de la Generación de Investigadores Siguiente Celular y Molecular Mechanics y BioNanotecnología.

La fabricación de geles y funcionalización PA de diferente rigidez con microesferas fluorescentes incrustados cerca de la superficie de cultivo de células. 1. funcionalizar los Cubreobjetos Top Glass <ol><li> Limpie cubreobjetos de vidrio (# 1.0, 12 mm diam.) Con agua y jabón, seguido de etanol para eliminar el polvo extraño. </li><li> Coloque la cubierta de vidrio se desliza en un (es decir, soporte de punta de pipeta) superficie de rallado de tal manera que no se toquen para facilitar la facilidad de interacción con los cubreobjetos. </li><li> Escudo toda la superficie de la cubierta se desliza con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) durante 1 h (Figura 1A). </li><li> Durante este tiempo, realizar una dilución de 1: 10.000 de la solución coloidal de 0,1 m de diámetro, las microesferas fluorescentes rojas con agua desionizada (DI) agua para obtener una densidad de partícula de aproximadamente 1 microesfera por 20 m 2 en la superficie del gel. Ver Figura 2 para los resultados de varias diluciones. Esta dilution puede ser modificado para satisfacer la necesidad de experimentos específicos. </li><li> Coloque la solución diluida en un baño de agua ultrasónico durante 30 min. </li><li> Después de 1 hora, utilizar pinzas para levantar cuidadosamente cada hoja de la cubierta y secar con aire. Devolver los cubreobjetos secos a la superficie rallada. </li><li> Retire la solución coloidal diluida del baño ultrasónico y pipeta de 150 l en cada hoja de la cubierta. Dejar durante 10 min (Figura 1B). </li><li> Utilice las pinzas para levantar cuidadosamente cada hoja de la cubierta y secar con aire. Volver la cubierta seca se desliza sobre la superficie rallada y almacenar en la oscuridad hasta que la necesite. </li></ol> 2. Preparación de Gel PA Directamente en placas de Petri de vidrio de fondo <ol><li> Placa Precalentar a 100 ° C. </li><li> Coloque el número deseado de fondo de cristal cajas de Petri (35 mm plato con 14 mm micro-bueno, # 1.0) sobre una superficie plana en una campana para vapores químicos. </li><li> Cubra la parte de vidrio de cada plato micro-así Petri con 97% de 3-aminopropil-trimethoxysLiane (3-APTES) durante 7 minutos para la activación química. Tome precauciones para evitar el goteo involuntario de los 3-APTES a la superficie del plástico en la placa de Petri para evitar la degradación del poliestireno. </li><li> Después de 7 min, llenar la cápsula de Petri con agua DI y disponer en el recipiente de residuos. </li><li> Repita el paso 2.4 3x para cada plato, y luego agitar la placa de Petri para eliminar el exceso de agua. Colocar las cápsulas de Petri en la placa caliente hasta que la parte de vidrio es seco. </li><li> Retire las placas de Petri de la placa caliente y volver a una superficie plana en una campana para vapores químicos. </li><li> En una campana de humos químicos, hacer una solución de 0,5% de glutaraldehído y para abarcar la parte de vidrio de cada placa de Petri bien con la solución durante 30 min. Tome precauciones para evitar el goteo involuntario del glutaraldehído a la superficie del plástico en la placa de Petri para evitar la degradación del plástico. </li><li> Después de 30 min, llenar la cápsula de Petri con agua DI y disponer en un contenedor de residuos para enjuagar y eliminar el glutaraldehyde. </li><li> Repita el paso 2.4 3x para cada plato, y luego agitar la placa de Petri para eliminar el exceso de agua. Colocar las cápsulas de Petri en la placa caliente hasta que la parte de vidrio es seco. </li><li> Antes de mezclar los componentes de la solución de gel de PA, mover los portaobjetos de vidrio funcionalizadas en la campana de humos química tal que sean fácilmente accesibles, lo que permite la intercalación rápida del gel con el fondo de cristal placas de Petri después de mezclar la solución de gel. </li><li> En un tubo de centrífuga de 15 ml, mezclar 40% de bisacrilamida, 2% de acrilamida y ácido acrílico en sucesión inmediata en las concentraciones que se indican en la Tabla 1 (adaptada de protocolo publicado 10) para lograr la elasticidad de la matriz deseada. </li><li> Añadir HEPES 100 mM, persulfato de amonio al 10%, y TEMED en cantidades enumeradas en la Tabla 1 correspondientes a la elasticidad matriz deseada para completar la solución de gel. </li><li> Inmediatamente pipetear 15 l de solución de gel en el centro de la parte de vidriode los platos de Petri. </li><li> Recoger inmediatamente una hoja de cubierta de vidrio funcionalizado con pinzas. <ol><li> Voltear la hoja de la cubierta de vidrio sobre tal manera que las perlas fluorescentes son en la toma de contacto lateral con solución de gel. </li><li> Coloque la hoja de la cubierta suavemente en la parte superior del gel líquido ahora-PA tal que el lado funcionalizado está en contacto con el gel (Figura 1C). Nota: Para obtener los mejores resultados, una segunda persona se recomienda para el papel de la adición de la hoja de la cubierta con el fin de evitar la posibilidad de polimerización parcial mientras pipeteo solución de gel PA líquido sobre varias placas de Petri. </li></ol></li><li> Voltear todos los platos de Petri a ayudar con evitar los efectos de la gravedad sobre nanopartículas fluorescentes de polimerización en niveles inferiores del gel de PA. </li><li> Espere por lo menos 35 minutos, o hasta que la solución madre de PA gel ha polimerizado visiblemente en su tubo de centrífuga. </li><li> Voltear las cajas de Petri volver una y llenarlos con PBS para ayudar con la eliminación de la hoja de la cubierta. </li><li> Cuidadosamente hacer contacto con la parte de vidrio de la placa de Petri y el contorno de la hoja de la cubierta, con unas pinzas para raspar la circunferencia de la hoja de la cubierta. Realice varios ciclos hasta que se desprendió la hoja de la cubierta. Retire la hoja de la cubierta y deseche en un contenedor para desechos cortopunzantes adecuada. </li><li> Después de eliminar todos los cubres, perlas fluorescentes se han transferido al gel (Figura 1D). Cubra los geles PA completo con PBS, coloque el plato de Petri tapa en cada plato, y se almacenan a 4 ° C. </li></ol> 3. de funcionalización PA gel con fibronectina <ol><li> Preparar las siguientes soluciones premezcladas como se describe en un protocolo establecido 11: Empapar solución (NaCl 137 mM, 5% (v / v) de glicerol) y tampón 2x conjugación (0,2 M 2 (N morfolino) etanosulfónico (MES), 10 % (v / v) de glicerol, pH 4,5). </li><li> Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar todo el PBS de los platos con fondo de vidrio que contienen los geles PA. </li><li> PipetTE remojo solución sobre cada gel tal que el gel esté completamente sumergido. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h. </li><li> 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida caliente (EDC) y N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar 10x soluciones de EDC (150 mM, 19 mg / ml en agua DI) y NHS (250 mM, 29 mg / ml en agua DI). </li><li> Mezclar 1 parte 10x EDC, 1 parte de 10x NHS, 3 partes de agua DI, y 5 partes 2x tampón de conjugación. </li><li> Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar la solución de remojo. Asegúrese de que todo el fluido se retira de la superficie del gel. </li><li> Agregue suficiente solución NHS / EDC para cubrir la superficie del gel y llenar el pozo con fondo de cristal de la placa de Petri (150-250 l). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. </li><li> Fibronectina Descongelar a temperatura ambiente. Una vez descongelada, la mezcla de agua DI estéril para crear una solución de fibronectina 50 g / ml. </li><li> Utilice una bomba de vacío en una campana biológica para eliminar las solu NHS / EDCción. Asegúrese de que todo el fluido se retira de la superficie del gel. </li><li> Añadir 150 l de solución de fibronectina a cada gel. Incubar a temperatura ambiente durante 35 min para permitir la unión de la fibronectina. </li><li> Después de 35 min, añadir PBS a cada placa de Petri y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. </li></ol> 4. Experimentos de tracción Fuerza <ol><li> Medios de calentamiento de células, PBS, y tripsina a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Enjuague geles 5x con PBS estéril, aspirar el PBS entre enjuagues, y dejar tapado en la campana. </li><li> Añadir 1 ml de tripsina por 25 cm 2 a las células del frasco que contiene. Después las células se levantan de matraz, diluir la tripsina con medio celular y contar las células. Basado en el área de superficie del gel, determinar el número de células requeridas por gel para una densidad de siembra de células final de 3000 células / cm 2. Diluido o concentrado de suspensión de tal manera que 150 l de la mezcla de células-media contiene este número de células. Alícuotas de 150 l de suspens celularesde iones a cada gel. </li><li> Colocar las cápsulas de Petri que contenían las células en una incubadora durante 30 min. A continuación, retirar con cuidado las placas de Petri y llenar el resto de la placa de Petri con los medios de comunicación (aproximadamente 2 ml) tal que la superficie de la placa está completamente sumergido. </li><li> Colocar las placas de Petri de nuevo en la incubadora hasta que la adquisición de imágenes. </li><li> Prepare el sistema de adquisición de microscopio y datos para la imagen: inserte el objetivo de inmersión en agua 40x, inserte el contraste de interferencia diferencial (DIC) de prisma, seleccione el mCherry o filtro fluorescente equivalente, y encienda la cámara ambiental. </li><li> Cuando se prepara para la imagen, retire una placa de Petri de la incubadora y colóquelo sobre la platina del microscopio. Retire la tapa de la placa de Petri para imágenes DIC. </li><li> Localice una sola célula y capturar una imagen fija de la celda en la DIC. </li><li> Sin mover la platina del microscopio, cambiar el modo de imagen a la fluorescencia. Centrarse en las microesferas fluorescentes y recOrd una imagen de las microesferas. </li><li> Retire cuidadosamente los medios de comunicación célula a partir de la placa de Petri con una pipeta y añadir 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Imagen de las microesferas bajo la celda después de que las células han desprendido. </li><li> El uso de imágenes de partículas velocimetría (PIV) Análisis en ImageJ 12 para calcular el campo de desplazamientos debido a las fuerzas celulares. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Complaint+Matrices+for+Quantifying+Cellular+Contraction.">Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction.</a> JoVE. , (2010).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+Hydrogels+for+Cell+Mechanics:+Steps+Toward+Optimization+and+Alternative+Uses.">Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses.</a> Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+throughput+traction+microscopy+reveals+pivotal+role+for+matrix+stiffness+in+fibroblast+contractility+and+TGF-&#946;+responsiveness.">Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-&#946; responsiveness.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).</li><li>Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micropatterning+and+image+processing+approach+to+simplify+measurement+of+cellular+traction+forces.">A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces.</a> Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties.">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).</li><li>Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Patterning+Polyacrylamide+Substrates+Functionalized+with+N-Hydroxysuccinimide.">Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide.</a> Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).</li><li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell&#8211;cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell&#8211;cell junction positioning.</a> PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate.">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li><li>Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+chemistry,+topography,+and+mechanics+at+the+cell-biomaterial+interface:+Issues+and+challenges+for+assessing+the+role+of+substrate+mechanics+on+cell+response.">Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response.</a> Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).</li><li>Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinkovic&#769;, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiwell+Platform+for+Studying+Stiffness-Dependent+Cell+Biology.">A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology.</a> PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).</li><li>Butler, J. P., Tolic&#769;-N&#248;rrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).</li><li>Tolic&#769;-N&#248;rrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells.">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).</li><li>Atanackovic, T., Guran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Cuando se utiliza esta técnica, es esencial que la solución de bolas se diluye apropiadamente y las perlas se eligen basándose en diámetro deseado, PA rigidez sustrato gel, y la escala de tamaño de los fenómenos que se explora en el experimento deseado. Se debe tener cuidado al diluir la solución del grano antes de la funcionalización de los mejores cubreobjetos de vidrio. La separación entre los granos en la superficie del gel puede ser alterado cambiando el factor de dilución de ...

La interacción mecánica de una célula viva con su medio ambiente local comúnmente se ha estudiado el uso de geles PA. Estos sustratos se basan en un protocolo simple, bien caracterizado establecido por Dembo y Wang en 1997 1. Una de las principales ventajas de estos sustratos es que su rigidez puede ser sintonizada mediante la modificación de las concentraciones de los componentes específicos de la solución de gel. Esto proporciona una plataforma conveniente para estudiar la interacción células con ambientes de diferentes rigideces. Cuando geles PA se recubren con la matriz extracelular (ECM), las proteínas, las células se adhieren a ellos, la generación de la fuerza. Como resultado de la fuerza de células, el gel se deforma como un cuerpo elástico. Esta deformación depende de la magnitud de la fuerza aplicada por las células y las propiedades elásticas del gel. Varios estudios han empleado geles PA para investigar las fuerzas de tracción celulares. En una variación de la fabricación de gel de PA, microesferas fluorescentes (bolas) están incrustados turante el gel para cuantificar las fuerzas de tracción de células en geles de diferentes rigideces 2. Tras la aplicación de la fuerza de células, las bolas se desplazan desde su ubicación inicial después de la deformación gel. El campo de la deformación se mide a partir de los desplazamientos de cuentas individuales. Este campo se utiliza la deformación con la teoría de la elasticidad y las propiedades elásticas del gel para calcular las fuerzas de tracción. Estas mediciones proporcionan una idea de cómo las células detectan mecánicamente e interactuar con su microambiente local de 3. En muchos protocolos de fabricación gel ampliamente utilizados PA, las perlas se entremezclan en todo el gel de PA en su estado no polimerizado líquido. Un gel de PA totalmente polimerizado contiene perlas fluorescentes en todo su volumen. Al calcular las fuerzas de tracción de células, la mayoría de los granos cerca de la superficie del gel (interfaz célula-sustrato) son monitoreados. Los desplazamientos de estas perlas se supone que se produzca en la superficie de cultivo celular para la simplicidad en la fuerza CÁLCULOn. Se tiene en cuenta la ubicación real de las perlas dentro de la profundidad del gel. Sin embargo, en un medio elástico (como PA gel), un cordón más cerca de un punto de aplicación de la fuerza se moverá más de un cordón que está más lejos del punto. Por lo tanto, el tratamiento de la desplazamiento de un punto (en la ubicación del talón) distal de la superficie como que los resultados de superficie en una subestimación de tracciones celulares. El grado de error depende de la distancia del talón de la superficie. El error no puede ser estimada sin el conocimiento de la ubicación de la perla. La necesidad de un método simple para confinar perlas muy cerca de la superficie de cultivo celular ha sido abordada por algunas técnicas. Una forma es aumentar la densidad de los granos a través de todo el gel de tal manera que hay un número suficiente de perlas en el plano focal superior para medir el movimiento muy cerca de la superficie. Otra técnica consiste en la construcción de una cámara de imagen confocal de imágenes de células vivas de tal manera que la luz desólo las perlas en el plano superior más focal se recoge 4. Un método diferente implica la superposición de una capa extremadamente delgada de gel de PA que contiene perlas en la parte superior de un gel ya polimerizado sin talones 5. Un inconveniente de cada una de estas técnicas es que no se conoce la ubicación exacta de las perlas dentro del gel. Esto introduce un error en el cálculo del campo de desplazamiento de las perlas, y por lo tanto el cálculo de las fuerzas de células. Otra técnica implica la conjugación de perlas a la superficie superior de un gel de PA ya polimerizado usando sulfo-SANPAH 6. Esta técnica asegura las perlas son de hecho sólo en la parte superior del gel de PA, pero el grado en que están incrustados en la profundidad del gel es desconocido. Esto podría crear una topografía local para las células, lo que podría alterar el comportamiento de células, como el trabajo previo ha sugerido que las células pueden sentir la fuerza de varias micras de distancia 7. Recientemente, una técnica para modelando geles PA con 1 m de diámetro fluorescent marcadores de puntos de fibronectina en una matriz regularizado se estableció 8. En este caso, la profundidad de los marcadores fluorescentes se conoce, y es esencialmente cero, como el patrón de fibronectina se imprime indirectamente sobre la superficie del gel. Sin embargo, este método no proporciona un medio continuo en el que las células pueden adherirse, como la proteína ECM se limita a 1 m de diámetro puntos. Un método para la plena integración de los granos de seguimiento dentro de los geles de PA y confinarlos en una ubicación conocida muy cerca de la superficie aún no se ha establecido. Aquí, desarrollamos una técnica para limitar sub-micras de perlas fluorescentes de diámetro micras a un plano focal muy cerca de la superficie de cultivo de células dentro PA gel. Un gel se curan típicamente intercalando solución de gel líquido no polimerizado entre dos placas de vidrio. Una de las placas se funcionaliza para que el gel se adhiere fuertemente a él. La otra es sin funcionalizar y se retira después de las curas de gel. Modificamos este vidrio extraíble dorface por recubrimiento con una capa de perlas. Al intercalar el gel líquido entre el funcionalizado y la superficie de cristal bola recubierta, la transferencia de los granos al gel mientras se está curando. Esto limita la distancia de la integración de las perlas &#39;en el gel dentro de 1,6 m de la superficie. Platos de Petri con fondo de vidrio se utilizan como la superficie adherente en la que se cura el gel. Para formar una superficie superior plana de gel durante la polimerización, un cubreobjetos de vidrio circular se utiliza para intercalar el gel con la placa de Petri con fondo de vidrio. Antes de la fabricación del gel, el cubreobjetos de vidrio superior está recubierta con poli-D-lisina (PDL), produciendo una carga superficial positiva. La PDL se sopla con aire comprimido, y una solución de perlas en agua se deposita sobre los cubreobjetos. Utilizamos microperlas fluorescentes carboxilados, que llevan una carga negativa, e interactuar con la superficie de carga positiva creada por el tratamiento con PDL. Después de soplar la solución del grano de la cubreobjetos con aire comprimido, una sola capa decuentas sigue siendo electrostáticamente acoplan a la hoja de la cubierta seca. El recubrimiento PDL no afecta a la adhesividad de la copa a la superficie del gel, ya que los portaobjetos de vidrio no están dañados y se retira del gel de PA completamente intacto. Los platos de Petri con fondo de cristal se hacen adherentes mediante tratamiento con 97% 3-aminopropil-trimethoxysliane y 0,5% de glutaraldehído. PA geles de rigideces deseadas se crean mediante la mezcla de concentraciones apropiadas de bisacrilamida y acrilamida a través de un procedimiento estándar 9. Una gota de la solución de gel se pipeta en la placa de Petri con fondo de cristal. La hoja de la cubierta de vidrio que contiene las perlas se utiliza para intercalar el gel con la placa de Petri. Cuando se cura el gel, la hoja de la cubierta superior se retira dejando las microesferas incrustadas en el gel de PA dentro de 1,6 m desde la superficie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">70% Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>111-30-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1M HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">2% Bisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fibronectin, Human, 1mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0700</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acrylic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>147230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-14-1-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glass cover slips, 12 mm diam.</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

Geles de PA han sido utilizados como plataforma para estudiar las fuerzas de tracción de células debido a la facilidad de fabricación y la capacidad de sintonizar sus propiedades elásticas. Cuando el sustrato se recubre con una proteína de la matriz extracelular, las células se adhieren al gel y se aplican fuerzas, haciendo que el gel se deforme. La deformación depende de la tracción celular y las propiedades elásticas del gel. Si se conoce el campo de deformación de la superficie, la superficie de tracción puede calcularse utilizando la teoría de la elasticidad. La deformación del gel se mide comúnmente mediante la incorporación de perlas de marcador fluorescente de manera uniforme en el gel. Las sondas desplazan como el gel se deforma. Las sondas cerca de la superficie del gel se realiza un seguimiento. Los desplazamientos reportados por estas sondas se consideran como desplazamientos de superficie. Se ignoran sus profundidades desde la superficie. Esta suposición introduce un error en la evaluación de la fuerza de tracción. Para la medición precisa de las fuerzas de células, es crítico para la ubicación de las perlas para ser conocida. Hemos desarrolladouna técnica que utiliza la química sencilla para confinar perlas de marcadores fluorescentes, 0,1 y 1 m de diámetro, en geles de PA, dentro de 1,6 m de la superficie. Nos capa de un cubreobjetos con poli-D-lisina (PDL) y perlas fluorescentes. PA solución de gel se intercala después entre el cubreobjetos y una superficie adherente. Las perlas fluorescentes se transfieren a la solución de gel durante el curado. Después de la polimerización, el gel PA contiene perlas fluorescentes en un plano cerca de la superficie del gel.

Confocal de imágenes se utilizó para determinar que las perlas eran de hecho por debajo de la superficie del gel y para cuantificar su ubicación precisa dentro de la profundidad de gel. Perlas fluorescentes de una longitud de onda diferente que aquellos en el interior del gel se dejaron sedimentar en la superficie, y la distancia entre las nanopartículas fluorescentes embebidos y los de la superficie se calculó utilizando un algoritmo de identificación centroide. La ubicación del talón sobre la superficie del ge...

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A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Las técnicas tradicionales para la fabricación de poliacrilamida (PA) geles que contienen sondas fluorescentes implican intercalando un gel entre una superficie adherente y un portaobjetos de vidrio. Aquí, mostramos que el revestimiento de esta diapositiva con poli-D-lisina (PDL) y sondas fluorescentes localiza las sondas dentro de 1,6 m de la superficie del gel.

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K vistas.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Las técnicas tradicionales para la fabricación de poliacrilamida (PA) geles que contienen sondas fluorescentes implican intercalando un gel entre una superficie adherente y un portaobjetos de vidrio. Aquí, mostramos que el revestimiento de esta diapositiva con poli-D-lisina (PDL) y sondas fluorescentes localiza las sondas dentro de 1,6 m de la superficie del gel. 

Video: A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Investigación

Bioingeniería

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie de medición de potencial de bacterias usando Kelvin Sonda de Microscopía de Fuerza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Fabricación e implementación de una plataforma de microscopía de fuerza de tracción sin referencia

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Microscopía de tracción integrada con microfluídicos para la migración colectiva quimiotáctica

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

Microscopía de fuerza de tracción para estudiar la activación de linfocitos B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...