Este método permite medir la distribución temporal espacial de las fuerzas aplicadas por las células B en la sinapsis inmune y correlacionarlas con el reclutamiento de proteínas específicas. La microscopía de fuerza de tracción con geles de poliacrilamida es fácil de implementar. Este protocolo se puede utilizar para configurar rápidamente la medición de las capacidades mecánicas de muchas células B.
Este método es flexible y se puede adaptar para graficar otros ligandos como las integrinas o para estudiar otros tipos de sinapsis inmune como las células T o la fagocitosis frustrada. Debido a las propiedades físicas y químicas de los geles requeridos por este experimento, la adaptación de los métodos clásicos de microscopía de fuerza de tracción a las células B puede ser difícil. Comience por salinizar el soporte del gel.
Activar el cubreobjetos o fondo de cristal Petri plato con una lámpara UV durante dos minutos, luego salinizarlo con 200 microlitros de APTMS durante cinco minutos. Esto preparará el soporte para la unión covalente del gel. Lave bien el cubreobjetos o el plato de fondo de cristal con agua ultra pura y séquelo con aspiración al vacío.
Para preparar los cubreobjetos para aplanar el gel, colóquelos en un soporte de cubierta de cerámica, coloque el soporte en un vaso de precipitados pequeño y vierta el reactivo de silicona sobre los cubreobjetos asegurándose de cubrirlos por completo. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y déjelo a temperatura ambiente durante tres minutos. Mientras tanto, llene un vaso grande con agua ultra pura.
Después de tres minutos de incubación en reactivo de silicona, transfiera el soporte de cubreobjetos con los cubreobjetos al vaso de precipitados con agua. Enjuague bien los cubreobjetos con agua ultra pura. Séquelos bien y colóquelos en toallitas de papel.
Para obtener los mejores resultados, proceda inmediatamente con la polimerización en gel. Prepare una premezcla de gel 500 Pascal según las instrucciones del manuscrito y, a continuación, combine 167 microlitros de la premezcla con 1,67 microlitros de cuentas. Vortex y sonicar la mezcla en un sonicador de baño durante cinco minutos.
Proteja la mezcla de la luz con papel de aluminio. Para capitalizar la polimerización, añadir 1,67 microlitros de 10% de persulfato de amonio a la mezcla de gel, luego iniciar la polimerización añadiendo 0,2 microlitros de TEMED y mezclando el gel con una pipeta. Para lanzar el gel, pipetee nueve microlitros de gel se mezclan en cada cubreobjetos salinizado o plato de fondo de vidrio.
Inmediatamente aplanar el gel con el cubreobjeto siliconizado, presionando hacia abajo con fórceps para asegurarse de que el gel se extiende a través de toda la zona del cubreobjetos y que parte de él se filtra hacia fuera. Invierta el cubreobjetos o el plato de fondo de vidrio en un plato grande de Petri y tóquelo en el banco para forzar las cuentas hacia la superficie del gel. Coloque un tejido humidificado en el plato para crear una cámara húmeda.
Cubrirlo con papel de aluminio e incubarlo durante una hora. Después de la incubación, facilitar la liberación de cubrelip añadiendo PBS a la muestra. Retire cuidadosamente el cubreobjetos con una aguja, inclinando ligeramente el plato pero asegurándose de que el gel esté sumergido en el PBS.
El agente de silicio, la acrilamida, la acrilamida base y TEMED pueden ser tóxicos por inhalación. Use equipos de protección personal estándar y manipule estos productos bajo una capucha química. Aspirar el PBS de los geles y añadir 150 microlitros de Sulfo-SANPAH a temperatura ambiente.
Exponga el gel al tratamiento UV durante dos minutos y luego lave el gel tres veces con PBS. Repita el tratamiento con Sulfo-SANPAH y los lavados PBS, luego agregue 250 microlitros de lysozyme o HEL al gel y cocine durante la noche en una cámara de humedad a cuatro grados centígrados cubierto con papel de aluminio. Después de la incubación, retire el antígeno HEL y lave el gel con PBS tres veces.
Por último, cubra el gel con 500 microlitros de medios de cultivo celular B y déjelo a temperatura ambiente. Utilice un microscopio confocal con control térmico y de dióxido de carbono para la toma de imágenes. Aspirar los medios del gel, dejando aproximadamente 200 microlitros.
Coloque el gel en el microscopio. Dos capas principales de cuentas aparecerán en la parte inferior y superior del gel. Concéntrese en el plano de gel y encuentre un área uniforme para la imagen.
Elija el área de imágenes con cuidado y asegúrese de mantenerse enfocado. Una densidad de perlas adecuada y una superficie uniforme son clave para obtener mediciones de fuerza robustas y confiables. Añadir 80 microlitros de linfocitos B primarios de ratones MD4 al gel, evitando tocar el gel para mantener el enfoque.
Asegúrese de que el foco sigue siendo correcto y de que las celdas se pueden ver descendiendo en el área. Inicie la adquisición antes de que las células lleguen al gel. Abra la película como una pila de imágenes en ImageJ y, a continuación, ejecute la macro cropandsave.ijm.
Elija un directorio de salida y configure los ajustes del canal de atributos. Seleccione las regiones de interés con la herramienta rectángulo y agréguelas a la lista de ROI mediante la tecla T. Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar. Cuando la macro proponga una máscara de la celda, haga clic en Aceptar si es satisfactoria.
Si no es satisfactorio, haga clic en No Aceptar y, a continuación, seleccione manualmente una región cerrada con cualquier herramienta de selección y, a continuación, haga clic en Continuar. Abra MATLAB y ejecute tfmv1.m. Introduzca los parámetros necesarios.
En concreto, compruebe las propiedades de la imagen, como el tamaño de píxel y el intervalo de tiempo de adquisición y las propiedades del gel, como la relación de móduloS young E y Poisson. Cuando haya terminado, localice las salidas del software en el mismo directorio que el archivo original. Las imágenes correctas de cuentas parecen una distribución uniforme y aleatoria de puntos brillantes similar a un cielo estrellado.
Los datos y el análisis no son fiables cuando el número de cuentas es demasiado bajo o la imagen está desenfocada. Es posible observar el movimiento de las perlas por ojo utilizando un marco de referencia que precedió al primer contacto de la célula con el sustrato. Los resultados aproximados se pudieron obtener a partir del seguimiento de partículas individuales.
El análisis proporciona una segmentación de los cordones de la imagen de referencia como un control. Utilizando software, también es posible obtener el campo de desplazamiento y tensión, que es el vector de la tensión local en cada píxel y cada punto de tiempo. El producto escalar de los campos de desplazamiento y fuerza integrados en el área de la célula proporciona el trabajo total ejercido por la célula sobre el sustrato.
Al comparar dos condiciones biológicas, se puede calcular una curva media o un valor medio en los últimos puntos de tiempo donde la energía alcanza una meseta. Cuando la información espacial de las fuerzas es relevante, también es posible comparar puntos de tiempo únicos de cada condición. Un ejemplo de lapso de tiempo de extracción de antígeno de fluorescencia se muestra aquí.
La aparición progresiva de señales fluorescentes en la sinapsis indica el desprendimiento de antígeno del gel. Los datos de fluorescencia se pueden utilizar para construir una curva de extracción media. El paso más delicado en el protocolo es la polimerización del gel bajo el cubreobjetos.
Este paso debe realizarse con relativa rapidez y cuidado asegurando que el gel se apriete uniformemente debajo del cubreobjetos. Después de este procedimiento, la proteína fluorescente que expresa linfocitos B se puede utilizar para evaluar simultáneamente la localización de estructuras intracelulares y el patrón de fuerza. Esta técnica se puede combinar con perturbaciones genéticas o químicas para evaluar el papel de proteínas específicas en la contractilidad celular y la absorción de antígenos.
