Name: implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986) und Boston Kinderkrankenhaus Fakultät Career Development Fellowship (TM, PM) unterstützt. Die Autoren danken Amanda Jiang und Elisabeth Jiang für die technische Unterstützung.

HINWEIS: Die in-vivo-Tierstudie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde überprüft und von der Animal Care und Verwenden Committee von Boston Kinderkrankenhaus (Protokoll-Nummern: 13-10-2526R, 14-02-2568R) zugelassen. Alle Arzneistoffe in diesem Protokoll verwendet werden pharmazeutischer Qualität und diese Medikamente werden unter sterilen Bedingungen hergestellt. 1. Fibrin Gel Vorbereitung <ol><li> Bereiten Fibringel dass VEGF und bFGF enthält. <ol><li> Tau-Stammlösungen von Fibrinogen und Thrombin, die bei -80 ° C bis Raumtemperatur (25 ° C) gelagert werden. </li><li> Hinzufügen Thrombin (Endkonzentration: 2,5 U / ml), CaCl 2 (Endkonzentration: 45 mM), VEGF (Endkonzentration: 0-100 ng / ml) und bFGF (Endkonzentration: 0-100 ng / ml) zu der Fibrinogen -Lösung (Endkonzentration: 12,5 mg / ml in 0,9% sodium Chloridlösung 43-45) in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Vorsichtig mischen. </li><li> Gently Pipette 200 ul der Mischung auf einer sterilen Kunststoffschale in einer tropfenweise Mode mit p200 Pipettenspitze. </li><li> Die Tropfen bei 37 ° C für 30-60 min, bis sie sich verfestigen. ANMERKUNG: Das erstarrte Gel kann in dem verschlossenen Kunststoffschale bei Raumtemperatur (25 ° C) für mehrere Stunden vor der Implantation (1a) gehalten werden kann. </li></ol></li><li> Schneiden Sie die Fibrin-Gel in ca. 3 x 3 x 3 mm Würfel mit kleinen chirurgische Scheren vor der Implantation. </li></ol> 2. Maus Vorbereitung <ol><li> Anesthetize adulten Maus (8-12 Wochen) durch intraperitoneale (IP) Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) und bestätigen, dass die Maus ausreichend durch Einklemmen Zehe des Maus anästhesiert. <ol><li> Verwenden Tierarzt Salbe auf Augen der Maus bis zur Trockenheit während des Experiments zu verhindern. </li></ol></li><li> Shave fur auf der linken Seite des Brustkorbs der Maus. </li><li> Führen Intubation der Maus. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der Intubation stehen bei 70 ° abgewinkelt und halten Maus anstelle durch Einhaken seine oberen Schneidezähne in einem kleinen Gummiband an der Spitze des Stativs befindet. </li><li> Die Zunge vorsichtig zurückziehen, um eine Seite mit stumpfen Pinzette. </li><li> Visualisieren des Kehlkopfes mit Hilfe eines faseroptischen Gooseneck Mikroskopleuchte. </li><li> Legen endotrachealen elastischen Katheters (21 G) in die Luftröhre. </li><li> Überprüfen Sie, ob die Maus spontan atmenden eine reibungslose Umstellung (regular 100-150 Atemzüge / min, keine paradoxen oder flache Atmung). </li><li> Platzieren Sie die Maus in Bauchlage unter der Dissektionsmikroskop. </li><li> Die Maus mit einem Nagetier Ventilator mechanisch lüften (150 Atemzüge / min und 7 ml / kg Atemvolumen). </li><li> Graf Rippen Zwischenrippenraum zwischen 4 und 5. Rippe zu finden. </li><li> Erstellen Sie einen sterilen Bereich über den Bereich by gründlich Abwischen mit Alkohol und PVP-Jod. Decken Sie das Operationsfeld ausreichend mit einem sterilen Operationstuch. </li></ol> 3. Maus-Chirurgie <ol><li> Nachdem lokale Injektion von 0,25% Bupivacain (200 ul) in der Haut, machen Sie einen Querhautschnitt (ca. 1 cm Länge) über den Zwischenrippenraum mit Präparierscheren. </li><li> Nach Injektion von 0,25% Bupivacain (200 ul) in die Zwischenrippenmuskel, einen Muskel Einschnitt zwischen dem 4. und 5. Rippe mit feinen kleinen Schere. </li><li> Legen Sie eine Sezieren Aufroller zwischen den Rippen, um die linke Lunge vollständig zu visualisieren. <ol><li> Kratzen Sie einen kleinen Bereich (1 x 1 mm im Quadrat) der Pleura von der Mitte der linken Lunge mit feinen Pinzette. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf den Bereich mit einem sterilen Wattestäbchen bis Blutungen und Luftleckagen vollständig gesteuert. </li><li> Legen Sie kleine Menge frischer Mischung aus Fibrinogen / Thrombin (Fibrinkleber) (Schritt 20 1.1.2. &amp; #181; l) über den Bereich mit p200 Pipettenspitze. </li></ol></li><li> Legen Sie vorsichtig eine Fibrin-Gel (Schritt 1.2) mit kleinen Zange über den Bereich (Abbildung 1b). <ol><li> Bestätigen Sie, dass das Gel auch auf den Bereich während der Atembewegungen der Lunge fest. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, dass es weder massive Luft undicht oder Blutungen aus der Lunge. </li><li> Schließen Einschnitte (Muskel- und Hautschichten) mit einer absorbierbaren Naht, welches nicht entfernt werden. </li><li> Saugen Sie das Brusthöhle mit 27 G Nadel und 1-ml-Spritze zu Pneumothorax zu verhindern. </li><li> Beenden der mechanischen Beatmung. </li></ol> 4. Mauswiederherstellung <ol><li> Achten Sie darauf, die Maus spontan atmenden eine reibungslose Umstellung (regular 100-150 Atemzüge / min, keine paradoxen oder flache Atmung). </li><li> IP Injektion 1 ml vorgewärmtes, 0,9% NaCl, um Austrocknung zu verhindern. </li><li> Lassen Sie mit der Maus auf dem zirkulierenden Warmwasserpolster erholen. </li><li> Entfernen Sie die endotracheal Rohr nach der Bestätigung, dass die Maus über stabile Atmung. </li><li> Injizieren Meloxicam (5 mg / kg, subkutane Injektion (SC), für 3 Tage als postoperative analgetische. </li><li> Überwachen Sie die Bewegungen der Maus vorsichtig auf ein Minimum von 15 Minuten-Intervallen, bis es sternale (in der Lage, auf den Bauch rollen und bleiben aufrecht) und bei Bewusstsein. </li><li> Nach der Wiederherstellung zurück die Maus, um einen neuen Käfig aus Mäusen isoliert ohne Operation. </li><li> Überwachen Sie die Operationsstelle auf Anzeichen einer Infektion (Rötung, Schwellung, Ausfluss), grundlegende biologische Funktionen Tieres (Futter- und Wasseraufnahme, Wasserlassen, Stuhlgang, Gewichtszunahme) sowie klinische Anzeichen von Leiden (Piloerektion, reduziert Bewegungs) täglich im Anschluss an die chirurgischen Eingriffs. </li></ol> 5. Ernten der Lunge <ol><li> 7 bis 30 Tage nach der Implantation, euthanize der Maus unter Verwendung von CO 2 über Druckgasquelle. </li><li> Einen Einschnitt zwischen der Spitze des Schwertfortsatz und der BrustbeinKerbe (mediane Sternotomie) und Ernte ganze Lunge mit dem implantierten Gel zur histologischen und biochemischen Analyse, indem die Luftröhre und seziert alle Verbindungen zum Herz, Lunge und Luftröhre. </li><li> Fix implantierte Gel mit Lungenkrebs mit 4% Paraformaldehydlösung über Nacht bei 4 ° C, in OCT-Verbindung eingebettet werden, und nehmen Sie die Serienstufenabschnitte von 30 um Dicke. </li><li> Führen histologische (Hämatoxylin und Eosin-Färbung) und immunhistochemische Analysen (endotheliale Marker: CD31, epithelialen Marker: Aquaporin (AQP) 5 und Surfactant Protein (SP) -B) mit konfokalen Mikroskop 22,37,40. </li><li> Kompilieren Stapeln optischer Schnitte (30 um dick), um dreidimensionale Bilder der Lungen Endothel- und Epithelzellen mit 3D-Bildanalyse-Software 37 zu bilden. </li><li> Quantifizieren projizierten Flächen der neugebildeten Blutgefäßen mit Bildanalyse-Software 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dieser Artikel stellt eine neue Methode zur Biomaterialien auf der Lungenoberfläche lebender erwachsener Mäuse zu implantieren. Mit diesem System wird die Host-Lungen-abgeleitete Angiogenese erfolgreich im Material rekapituliert. Dieses System ermöglicht es den Forschern, um Übersprechen zwischen den Endothelzellen zu erforschen, andere Zellen (beispielsweise Epithelzellen, mesenchymale Zellen, Immunzellen) und verschiedene ECM-Komponenten, die für die lokale Angiogenese 50-53 und alveolären Regenerations 24,54 erforderlich. Obwohl herkömmliche Hydrogel in vivo subkutane Implantation wurde ausgiebig für Angiogeneseforschung 37-39 verwendet, müssen diese Methoden nicht rekapitulieren organspezifischen Angiogenese. Dieses System, in dem Hydrogel direkt auf der Lungenoberfläche implantiert werden, ermöglichen es den Forschern, die Rollen des lungenspezifischen Mikroumgebung in der Angiogenese und alveoläre Regeneration im erwachsenen Mauslunge zu erkunden. Diese Gele können aus verschiedenen ECM-reiche BIOMATE hergestellt werdenrialien (zB Kollagene, Fibrinen), die mit verschiedenen chemischen Faktoren (zB angiogenen Faktoren, Wachstumsfaktoren) 55,56, Vorläuferzellen und / oder iPS-Zellen ergänzt werden kann. Neben den chemischen Faktoren, mechanische Kräfte kontrollieren auch Angiogenese 23,37. Die Steifigkeit Fibringel Änderungen einer Fibrinogenkonzentration abhängig 57 und Manipulieren der Fibrinogenkonzentration die Angiogenese nicht nur durch chemische Signale, sondern auch durch körperliche Signale 58,59 beeinflussen. Daher müssen physikochemischen Eigenschaften der Fibringele sorgfältig optimiert werden, um physiologische organspezifischen Angiogenese in der Zukunft zu rekapitulieren. Wundheilung nach Abkratzen der Pleura produziert auch eine endogene Fibringerinnsel, die verschiedenen Arten von Wirtszellen beinhaltet und fördert den Heilungsprozess und Geweberegeneration. Diese natürliche Gerinnsel kann mit der exogen implantiert Fibringel interagieren und damit kontrollieren AngioUrsprung in der implantierten Gel. Fluoreszenzmarkierten Fibrinogen kann Forschern ermöglichen, zwischen natürlichen Fibringerinnsel und implantiert Fibringel unterscheiden und erkunden diese Mechanismen. Obwohl es sich um eine leistungsfähige Methode, um die Angiogenese bei erwachsenen Maus Lunge, Anwendung auf die Untersuchung von Lungenentwicklung und Krankheiten bei neugeborenen Mäusen würde wahrscheinlich vorhanden technischen Herausforderungen zu charakterisieren. Das ultimative Ziel der Studie ist es, funktionelle Blutgefäße in Fibringele auf kranke Lunge implantiert zu gewinnen und um die Matrix als ein medizinisches Gerät verwenden, um funktionelle Lungenstrukturen wiederherzustellen. Mögliche Kommunikation zwischen Wirtszellen und der vaskulären und alveolare Strukturen innerhalb der Gele als auch die Funktionalität dieser Struktur sollte in weiteren Experimenten untersucht werden. Da VEGF Ebenen in der Lunge bei Patienten mit BPD 60 und Emphysem 61 verringert, kann die Zugabe von VEGF an die Matrix Rekrutierung von Blutgefäßen in die Matrix impl verbessernauf diesen kranken Lunge anted. Die mechanischen Eigenschaften unterscheiden sich auch zwischen gesunden und kranken Lunge 23,62. B. Expression von Matrix-Metalloproteinasen und Lysyloxidase, die den Abbau und die Vernetzung von Kollagenen zu steuern, jeweils in verschiedene Lungenerkrankungen einschließlich COPD und Lungenfibrose 63-67 geändert. In lungen werden bestimmte Abstammungslinien von Vorläufern für Lungen endotheliale und epitheliale Zellen verarmt 68. Somit Manipulation dieser Faktoren (angiogene Faktoren, ECMs, ECM Steifigkeit) oder Implantieren Fibringele mit Vorläuferzellen ergänzt 69 wird wahrscheinlich an der Bildung funktioneller Blutgefäße innerhalb der Matrix und Rückgewinnung der Lungenfunktion bei verschiedenen pathologischen Zuständen führen. Da chemische Faktoren können innerhalb der Fibringele ergänzt um lokale Angiogenese zu modulieren, kann dieses System auch genutzt erforschen spezifischen Umweltsignale, die kranke Lunge bei chronischen Lungenerkrankungen normalisiert werden kann. </p&gt; Zusammenfassend diesem Artikel stellt eine Methode zur Fibrinhydrogel auf der Lungenoberfläche lebender Maus, die Forschern ermöglicht, lungenspezifischen Angiogenese in vivo zu charakterisieren zu implantieren. Modifikation von verschiedenen Faktoren (zB Zeitverlauf, Konzentrationen und Kombinationen von angiogenen Faktoren, verschiedene Arten von Hydrogelen, physikalisch-chemischen Eigenschaften von Hydrogelen) in diesem System werden die Mechanismen der Angiogenese und der Regeneration in der Lunge zu enthüllen. So wird dieses System erheblich voran wissenschaftlichen Kenntnisse der grundlegenden Gefäßbiologie, des Tissue Engineering sowie Lungenheilkunde.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verfahren einzuführen, um Fibrin-Gel auf der Lungenoberfläche der erwachsenen Maus, die Forscher die molekularen Mechanismen der Lungenkreislauf und alveoläre Entwicklung charakterisieren können implantieren, und dieses Wissen, um biomimetische Materialien zu entwickeln in der Lage zu nutzen von rekapituliert physiologische Lungengefäß und alveoläre Bildung auf verschiedene Lungenkrankheiten zu behandeln. Mehr als 35 Millionen Amerikaner leiden an chronischen Lungenerkrankungen wie chronisch obstruktive Lungenerkrankung und Lungenfibrose. Diese Patienten haben lang anhaltende chronische respiratorische Symptome wie Kurzatmigkeit, Brustenge, quälende Husten und Müdigkeit, die ihr tägliches Leben 1-3 erheblich beeinträchtigen. Trotz einer großen Aufwand zu wirksamen Therapien für diese Lungenerkrankungen zu entwickeln, derzeit gibt es keine Heilung; deshalb ist die Lebensqualität für diese Patienten schlecht und wirtschaftlichen und menschlichen Kosten sind hallogh 4-7. Derzeit ist eine Lungentransplantation die einzige Möglichkeit, Patienten im Endstadium einer chronischen Lungenerkrankungen zu speichern. Aufgrund der Knappheit von Transplantatspender, hohe Kosten, schweren Komplikationen und geringe Überlebensrate 8-11 Jedoch ist die Transplantation keine optimale Ansatz. Neue schnelle Fortschritte im Tissue Engineering Techniken konnten die Forscher implantierbaren Lungen von Bestandsauffüllung dezellularisierte ganze Lunge mit verschiedenen Arten von Vorläuferzellen oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) 12,13 bioengineer. Allerdings sind diese biotechnologisch Lunge nur für einige Stunden nach der Implantation 12,14,15 Funktions in Wirtstiere. Verwendung von Biomaterialien, die komplexen Strukturen und Funktionen der Lunge zu regenerieren ist ebenfalls recht erfolgreich. Dies kann, weil die wichtigsten biologischen Prozesse, die erwachsenen Lungenregeneration regeln wurden nicht gut erforscht. In der Lunge ist die Bildung des vaskulären Systems eines der frühesten und bedeutendsten Ereignisse during Entwicklung und Regeneration 16-21. Neu in der Lunge liefern nicht nur Sauerstoff, Nährstoffen und verschiedenen Zellkomponenten für Organbildung erforderlich ist, sondern auch lehrreich Regulationssignale zur umgebenden Zellen 22-25 gebildeten Gefäßsystemen. So spielt die Angiogenese eine Schlüsselrolle bei der regenerativen Alveolarisierung bei erwachsenen Lungen 24,26,27. Zusätzlich trägt deregulierten Angiogenese zu chronischen Lungenerkrankungen, wie chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD) 28, bronchopulmonale Dysplasie (BPD), 21-23, und Lungenfibrose 29. Um somit effizienter Strategien für das Engineering Lungen oder der Behandlung von chronischen Lungenerkrankungen zu entwickeln, ist es notwendig, die grundlegenden Mechanismen der lungenspezifischen Angiogenese zu verstehen. Jedes Organ zeigt außergewöhnliche mechanische und chemische Eigenschaften, die zwischen physiologischen und pathologischen Bedingungen 30-33 unterscheiden. Diese organspezifische microenvirongen regeln Endothelzellen Verhaltensweisen und orchestrieren Gefäßnetzwerkbildung in einer organspezifisch 24,34-36. Um somit effizienter Strategien für Lungenregeneration zu entwickeln, wobei der Mechanismus lungenspezifischen Angiogenese Basiswert muss verstanden werden. Während herkömmliche In-vivo-Angiogenese-Assays, wie subkutane Implantation Hydrogel wurden ausgiebig für Angiogeneseforschung 37-39 verwendet wurde, müssen diese Methoden nicht rekapitulieren organspezifischen Angiogenese. Kürzlich wurde ein neues Verfahren auf Matrigel in einer elastischen Form auf der Mauslunge implantieren ist entwickelt worden und dargestellt, die Blutgefäße und Lungenepithelzellen erfolgreich rekrutieren in die Gele 22. Dieser einzigartige Ansatz wird es den Forschern ermöglichen, den Mechanismus der lungenspezifischen Angiogenese sowie Wechselwirkungen zwischen Blutgefäßen und nicht-vaskulären Lungenzellen in physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erforschen. Seit 1) Matrigel ist nicht geeignet für die klinische Anwendung; 2) die Elastic Form, um das Gel kann Wechselwirkungen zwischen Hydrogelen und Wirtslungengewebe und 3) die elastische Form an der Lunge möglicherweise verursacht eine Beeinträchtigung der Lungenfunktion und Schmerzen während der Atmung beeinflussen geworfen, als mehr klinisch relevanten Ansatz verwendet, ein 3D-Fibrin-Matrix, die angiogenen Faktoren (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) / basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)) wurde auf der Mauslunge ohne Casting in der elastischen Form implantiert worden und hat Gast Lunge abgeleitete Angiogenese erfolgreich rekapituliert. Fibrin-Gel, Polymerfibrillen aus Thrombin gespaltenen Fibrinogen erzeugt wird, wird zum Einfangen einer Vielzahl von angiogenen Faktoren wie bFGF und VEGF die Angiogenese in vivo 40,41 beschleunigen bekannt. Wegen ihrer Regenerationsfähigkeit und biologisch abbaubare Natur 42 wird Fibringel verbreitet auf dem Gebiet des Tissue Engineering eingesetzt. Dieser Artikel stellt einen neuen und einzigartigen Ansatz zur Fibringel auf der Lungenoberfläche lebender adul implantierent-Maus und zeigt, dass die Host-Lungen-abgeleitete Angiogenese in den Gelen in vivo rekapituliert. Diese Methode, die Forscher ermöglicht, lungenspezifischen Angiogenese zu untersuchen, wird wahrscheinlich zur Entwicklung neuer Therapieansätze für verschiedene Arten von Lungenerkrankungen führen und die Bemühungen um adulten Lunge erfolgreich regenerieren erheblich voranbringen.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

Neue bedeutende Fortschritte in der Stammzellforschung und der Biotechnologie Techniken haben große Fortschritte bei der Nutzung von Biomaterialien zur Regeneration und Reparatur von Schäden in einfachen Gewebe in den orthopädischen und Zahn Feldern. Versuche, die Strukturen und Funktionen von komplexeren dreidimensionalen (3D) Organen wie Lunge regenerieren waren nicht sehr erfolgreich, da die biologischen Prozesse der Organregeneration wurden nicht gut erforscht. Es wird deutlich, dass die Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße, spielt eine Schlüsselrolle bei Organregeneration. Die neu gebildeten Gefäßsystemen liefern nicht nur Sauerstoff, Nährstoffen und verschiedenen Zellbestandteile, die für die Organregeneration erforderlich sind, aber auch lehr Signale an die Regeneration von lokalen Geweben. Deshalb, um erfolgreich zu regenerieren Lungen bei einem Erwachsenen, ist es notwendig, die lungenspezifische Mikroumgebungen, bei denen Angiogenese Antriebe Regeneration lokalen Lungengewebe zu rekapitulieren. Obwohl Conventional in vivo Angiogenese-Assays, wie subkutane Implantation von extrazellulärer Matrix (ECM) -reiche Hydrogele (zB Fibrin oder Kollagengelen oder Matrigel - ECM Proteingemisch durch Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Zellen sezerniert), werden in großem Umfang genutzt, um das zu erforschen allgemeine Mechanismen der Angiogenese, lungenspezifischen Angiogenese ist nicht gut charakterisiert, weil Verfahren zur orthotope Implantation von Biomaterialien in der Lunge wurden nicht gut etabliert. Das Ziel des Protokolls ist es, eine einzigartige Methode einzuführen, um Fibrin-Gel auf der Lungenoberfläche von lebenden erwachsenen Maus implantiert werden, der eine erfolgreiche Wiederholung der Host Lunge abgeleitete Angiogenese innerhalb des Gels. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Mechanismen, mit denen die lungenspezifischen Mikroumgebung steuert Angiogenese und alveoläre Regeneration in normalen und pathologischen Bedingungen zu erforschen. Seit implantierte Biomaterialien Release und liefern physikalischen und chemischen Signale zu benachbarten lung Gewebe kann Implantation dieser Biomaterialien auf kranken Lunge möglicherweise normalisieren die angrenzenden krankem Gewebe, so dass die Forscher neue Therapieansätze für verschiedene Arten von Lungenerkrankungen zu entwickeln.

Um zu untersuchen, ob Host Lungen abgeleiteten Gefäßbildung im Inneren der Biomaterialien auf die Lunge implantiert rekapituliert Fibringele mit großen angiogenetischen Faktoren VEGF und bFGF supplementiert (0, 10 und 100 ng / ml) wurden auf die Oberfläche von lebenden Maus-Lungen implantiert berichtet mit Matrigel 22. Fibringele 47, die diese angiogene Wachstumsfaktoren enthalten, wurden hergestellt, wie in 1a gezeigt. Nach Thorakotomie wurde ein kleiner Bereich der linken Lungenoberfläche mit einer Pinzette abgekratzt und der gefertigte Fibrin-Gel wurde auf die Lunge des erwachsenen Maus unter Verwendung einer geringen Menge an Fibrinkleber, die FDA genehmigt und weithin als wirksames Dichtungsmittel verwendet, um zu stoppen, ist implantiert Leckagen und reduzieren Blutungen im Lungenoperation 48,49 (Abbildung 1b). Die meisten Mäuse erholten sich ohne schwere respiratorische Symptome (zB Pneumothorax, Atemnot). Sieben Tage nach der Implantation wurden die Mäuse getötet und die Lungen wurden harvested. Implantierte Fibrin Gel wurde 7 Tage nach der Implantation (Abbildung 1c) in die Wirtslungen integriert. 3D-Rekonstruktion der konfokalen Fluoreszenzbilder hat, dass die vom Wirt stamm CD31-positiven Endothelzellen in einem VEGF / bFGF dosisabhängige Weise gebildeten Gefäßnetze innerhalb der Gele 7 Tage nach der Implantation dargestellt (Abbildung 2a, c). Typ I (AQP5 positiv) und Typ II (SP-B positiv) Lungenepithelzellen wurden auch entlang neugebildeten Blutgefäßen im Inneren des Gels, die mit höheren Konzentrationen von VEGF und bFGF (jeweils 100 ng / ml) (Abbildung 2a) ergänzt wurden rekrutiert . H &amp; E-Färbung histologischer Schnitte zeigten, dass andere Arten von Wirtszellen nach der Implantation (Figur 2b) auch in die Gelt 7 Tage migriert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Host Lunge abgeleiteten regenerativen Gefäßnetze erfolgreich innerhalb der Fibrin-Gele, die mit angiogenen Faktoren ergänzt werden und auf der Oberfläche der Erwachsenen mou implantiert konstruiertse Lunge. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52012/52012fig1highres.jpg" width="600" /> Abb. 1: (a) Fibrin-Gel vor der Implantation (b) hergestellten Fibringel über abgekratzten Pleura der linken Lunge (Pfeilspitzen) implantiert (c) Implantierte Fibringel (Pfeilspitzen) 7 Tage nach der Implantation in den Wirt Lunge aufgenommen.. Maßstabsbalken 1 mm. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52012/52012fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 2: (a) Fluoreszenzbilder, die Bildung von Gefäßnetze (CD31 positiv, grün) und rekrutiert Typ I (AQP5-positiv, magenta) oder Typ II (SP-B positiv, magenta) Lungenepithelzellen in der Fibrin-Gel ergänzt verschiedenen Konzentrationen von VEGF und bFGF (0, 10 und 100 ng / ml) 7 Tage nach Implantation. Gestrichelte Linien geben die Schnittstelle zwischen implantierten Fibringel und Gastgeber Lunge. Maßstab:. 20 um (b) Lichtmikroskopische Aufnahme von H &amp; E Färbung, die Infiltration der Wirtszellen in das Fibrin-Gel 7 Tage nach der Implantation. Pfeile zeigen die Grenzfläche zwischen dem Gel und Wirts Lunge. Maßstab: 20 um (c) Grafik, die projizierten Flächen der neu gebildeten Blutgefäße in den Fibrin-Gele, die mit verschiedenen Konzentrationen von VEGF und bFGF ergänzt werden (0, 10 und 100 ng / ml jeweils) 7 Tage nach der Implantation..

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Die Implantation von Fibrin Gel auf Maus Lung Lung spezifischen Angiogenese Studieren

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Aufrufe.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

Serie: Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Forschung

Medizin

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Biotechnik

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogenese im ischämischen Rat Lung

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Ein permanentes Fenster zur Untersuchung von Krebsmetastasen in der Lunge

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Krebsforschung

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Die Implantation von Vena Cava Interposition Graft in Maus-Modell

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Eine multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Bewertung der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose bei Mäusen

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Immunologie und Infektion

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Induktion der Maus Lungenverletzung durch Endotracheal Injektion von Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung erhöht die Effizienz der Orthotopen Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.&#160; However, distribution of intratracheally-administered agents to the distal mouse lung is often asymmetric, with lung parenchymal concentrations increased in the smaller (but equally accessible) left lung of the mouse.&#160; Described in this report is a novel intrabronchial (IB) approach to cannulate the left and/or right lungs of living mice non-operatively.&#160; It is also demonstrated how this approach can be used to selectively administer agents to one lung or adapted (via dose-adjusted IB delivery) to improve the left-right symmetry of lung delivery of experimental agents, thereby improving models of diffuse lung disease such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Intratracheal (IT) administration of experimental agents in mice often results in asymmetric delivery to the distal lungs.&#160; In this report, we describe a direct intrabronchial (IB) approach to cannulate each lung in living mice non-operatively.&#160; This approach can be used to selectively administer agents to one lung or may be adapted to improve the symmetric agent delivery to both lungs.

Direkte intrabronchiale Verabreichung zur Verbesserung der selektiven Agentenablagerung innerhalb der Mauslunge

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

Transplantation einer biotechnologisch hergestellten Lunge unter Verwendung von dezellularisierten Mauslungen und primären humanen Endothelzellen

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...