Este protocolo se puede aplicar con éxito tanto para inducir una respuesta inflamatoria y fibrosa importante en ambos pulmones mediante inyección endotraqueal de Bleomycin y para validar nuevas terapias sistémicas antiinflamatorias y antifiticas por perfusión de venas de cola. La principal ventaja de esta técnica es que la inyección directa de Bleomicina en la tráquea de ratón garantiza una rápida focalización de los pulmones sin derrames en las vías respiratorias superiores permitiendo una inducción segura, robusta y reproducible de la inflamación pulmonar y la fibrosis. Demostrando el procedimiento estará el Dr.Fiorenza Orlando, médico veterinario de nuestro laboratorio colaborador.
Para empezar, coloque el ratón anestesiado acostado boca arriba sobre una plataforma quirúrgica. Fije delicadamente sus piernas con tiras de cinta quirúrgica para mantenerla en su lugar. Para extender el cuello del ratón, coloque un soporte como rollo de algodón dental debajo de su región cervical.
Luego usa una cuchilla de afeitar para afeitar suavemente la garganta. Usa un par de fórceps anatómicos para pellizcar la piel. Utilice un par de tijeras contundentes curvadas manejadas por anillo para hacer una incisión corta de aproximadamente medio centímetro de longitud en correspondencia con el músculo esternohoides del ratón.
Use palitos de lana de algodón para detener cualquier sangrado. A continuación, exteriorizar la tráquea por disección contundente y limpiar suavemente de grasa y otros tejidos. Gire la plataforma quirúrgica para orientar el ratón con la cabeza hacia el operador, lo que permite al operador durante la inyección inclinar la jeringa correctamente.
Para visualizar la tráquea, coloque el ratón bajo un microscopio operativo. Ajuste la iluminación y ajuste la ampliación entre 1 y 1.2 y, a continuación, ajuste el enfoque y la nitidez. La tráquea se puede distinguir fácilmente como un tubo translúcido blanco con anillos traqueales claramente visibles.
Pipetear suavemente para mezclar la solución de Bleomycin y aspirar 100 microlitros en una jeringa de 0,5 mililitros con una aguja de calibre 25 evitando la formación de burbujas. Una vez que la tráquea se visualice claramente, perfore cuidadosamente con la punta de la aguja en un ángulo de 30 grados. Inyecte lentamente 100 microlitros de Bleomycin directamente en el lumen de la tráquea.
Después de esperar unos segundos para que todo el volumen viaje por la aguja, retírela de la tráquea. Observe unos segundos de apnea cuando la aguja se inserte correctamente en la tráquea, lo que indica que se ha inhalado todo el volumen de líquido. Deseche de forma segura la jeringa y la aguja.
Cierre la fascia subcutánea y la herida cutánea con una sutura absorbible 5-0 y permita que el animal se recupere. Después de anestesiar el ratón de nuevo y una vez que se ha confirmado la inconsciencia, coloque el ratón debajo de una capucha estéril. Usa una mascarilla facial con un flujo continuo de 1.5%isoflurano para mantener una anestesia suave durante todo el experimento.
Para promover la vasodilatación y permitir una inyección más fácil, remoje la cola en agua tibia durante dos minutos. Mezclar una suspensión de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano pipeteando suavemente para evitar la formación de grumos celulares. Aspirar 200 microlitros en una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 26 evitando la formación de burbujas.
Sostenga la cola por la punta y enderece suavemente. A continuación, localice la vena lateral de la cola. Raspa suavemente la cola con un bisturí y límpiala con 70%etanol.
A partir de la parte distal de la cola, inserte la aguja en la vena en un ángulo de 15 grados. Infundir lentamente 200 microlitros de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano. Para controlar la perfusión intravenosa exitosa, observe el líquido que entra en la vena sin resistencia y falta de extravasación.
Después de esperar unos segundos hasta que todo el volumen se desdesle por la aguja, retírela de la vena. A continuación, aplique brevemente presión sobre la herida de entrada con una gasa estéril para evitar el sangrado y permitir que el animal se recupere. Deseche de forma segura la jeringa y la aguja después de la perfusión.
Después de la inyección de Bleomycin, los cambios histopatológicos pulmonares fueron evaluados por Hematoxilina y Eosina y Picrosirius Mancha roja que confirman una amplia infiltración inflamatoria y fibrosis en comparación con la arquitectura pulmonar normal después de la inyección salina. La inflamación pulmonar inducida por bleomicina y la fibrosis fueron atenuadas en gran medida por la infusión de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano, pero no por solución salina. La deposición de colágeno se midió mediante un ensayo de hidroxiprolina.
Después de la inyección de Bleomycin, los niveles de hidroxiprolina aumentaron progresivamente desde el día ocho hasta el día 14 y 21. Mientras que la adición de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano redujo significativamente los efectos de la Bleomicina. Los niveles de expresión de Col1A1 tipo un gen de colágeno en el ARNm pulmonar entero también mostraron un aumento progresivo en los días ocho, 14 y 21 que se redujo parcialmente mediante el tratamiento de células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano.
La inmunostaining con anticuerpos específicos mostró que las células estromales mesenquimales del cordón umbilical humano infundidas llegaron rápida y eficazmente a los pulmones de ratón, aunque sólo se detectaron unas pocas células. Estos datos sugieren una rápida luxación de las células de la lesión en el sitio a pesar del efecto protector prolongado. El uso de un microscopio de funcionamiento garantiza una alta confianza en el éxito al permitir al operador monitorear con precisión la colocación correcta de la aguja en la tráquea del ratón antes de la instalación, minimizando así el riesgo de dañarla.
