עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאיגוד לב אמריקאי (בבוקר), משרד הגנה האמריקאי (BC074986), ובית החולים הפקולטה פיתוח הקריירה המלגה לילדים בבוסטון (TM, בבוקר). המחברים מודים אמנדה ג&#39;יאנג ואליזבת ג&#39;יאנג לקבלת סיוע טכני.

הערה: in vivo המחקר בבעלי החיים בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית החולים לילדים בבוסטון (במדבר פרוטוקול: 13-10-2526R, 14-02-2568R). כל התרופות המשמשות בפרוטוקול זה הן תרופות כיתה ותרופות אלה ערוכות בתנאים סטריליים. 1. הפיברין ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל הפיברין המכיל VEGF וbFGF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות הפשרת מניות של פיברינוגן ותרומבין המאוחסנים ב -80 ° C לטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרומבין (ריכוז סופי: 2.5 U / ml), CaCl 2 (ריכוז סופי: 45 מ&quot;מ), VEGF (ריכוז סופי: 0-100 ng / ml) וbFGF (ריכוז סופי: 0-100 ng / ml) לפיברינוגן פתרון (ריכוז סופי: 12.5 מ&quot;ג / מיליליטר בsodiu 0.9%מ &#39;פתרון כלוריד 43-45) בצינור 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה 200 μl של התערובת על צלחת פלסטיק סטרילי בצורה טיפה חכמה באמצעות קצה פיפטה p200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הטיפות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות, עד שהם לחזק. הערה: ג&#39;ל הקרושה יכול להיות כל הזמן בצלחת הפלסטיק האטום בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) במשך כמה שעות לפני ההשתלה (איור 1 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הג&#39;ל הפיברין לקוביות מ&quot;מ כ 3 x 3 x 3 באמצעות מספריים כירורגיות קטנים לפני ההשתלה. </li></ol> 2. עכבר הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בוגר (8-12 שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneal (IP) של קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם) ולאשר כי העכבר הוא מורדם כראוי על ידי צביטת הבוהן של העכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשחת וטרינר בעיניים של העכבר כדי למנוע יובש במהלך הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פו גילוחr על הצד השמאלי של בית החזה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אינטובציה endotracheal של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על אינטובציה לעמוד בזווית ב 70 מעלות ומחזיקים את העכבר במקום ידי משדלת החותכות העליונות שלה מעל גומייה קטנה הממוקמת בחלק העליון של הדוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לחזור בו מהלשון לצד אחד באמצעות מלקחיים בוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את הגרון בעזרת פנס מיקרוסקופ מתכווננת סיבים אופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר endotracheal אלסטי (21 G) לקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא נושם באופן ספונטני בצורה חלקה (100-150 נשימות / דקה רגילה, אין נשימה פרדוכסלית או רדודה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני לאוורר את העכבר באמצעות מכונת נשמה מכרסם (150 נשימות / דקה ו -7 מיליליטר / קילוגרם נפח של גאות ושפל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן צלעות לאתר שטח צלע בין 4 th ו -5 ריב ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת שדה סטרילי מעל האזור בy נגב ביסודיות עם אלכוהול וPovidone-יוד. לכסות את שדה הניתוח כראוי עם לעטוף כירורגית סטרילית. </li></ol> 3. ניתוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה מקומית של bupivacaine 0.25% (200 μl) בעור, לעשות חתך בעור רוחבי (כ אורך 1 סנטימטר) על מרחב הצלע באמצעות מספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה של bupivacaine 0.25% (200 μl) לתוך שריר הצלע, לעשות חתך שריר בין צלעות 4 th ו-5 באמצעות מספריים קטנים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מפשק לנתח בין הצלעות כדי להמחיש את הריאה השמאלית באופן מלא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד שטח קטן (ריבוע 1 x 1 מ&quot;מ) של הצדר הקרביים של מרכז הריאה השמאלית באמצעות מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל לחץ עדין על האזור באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי עד דליפות דימום והאוויר נשלטות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמות קטנה של תערובת טריות של פיברינוגן / תרומבין (דבק הפיברין) (שלב 1.1.2. &amp; # 20181; יב) על האזור באמצעות קצה פיפטה p200. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות ג&#39;ל הפיברין אחד (שלב 1.2) באמצעות מלקחיים קטנים מעל האזור (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שג&#39;ל קבוע גם באזור במהלך תנועות נשימה של הריאות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאין לא דולף אוויר מאסיבי ולא דימום מהריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתכים סגורים (שכבות שרירים ועור) עם תפר נספג, שאינו צריכים להסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חלל בית החזה באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מיליליטר כדי למנוע pneumothorax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים אוורור מכאני. </li></ol> שחזור עכבר 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא נושם באופן ספונטני בצורה חלקה (100-150 נשימות / דקה רגילה, אין נשימה פרדוכסלית או רדודה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IP להזריק 1 מיליליטר של טרום חימם 0.9% NaCl על מנת למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר עכבר כדי להתאושש על כרית מים החמה במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את endotracheצינור אל לאחר אישור שיש לו את העכבר נשימה יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק Meloxicam (5 מ&quot;ג / קילוגרם, הזרקה תת עורית (SC), במשך 3 ימים כמשכך כאבים שלאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התנועות של העכבר בזהירות במינימום של 15 דקות במרווחים עד שהוא sternal (הצליח לגלגל על ​​הבטן שלה ולהישאר זקוף) ומודע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאוששות, להחזיר את העכבר לכלוב חדש מבודד מעכברים ללא ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על האתר כירורגית לסימני זיהום (אדמומיות, נפיחות, הפרשות), פונקציות הביולוגיות הבסיסיות של בעלי החיים (צריכת מזון ומים, הטלת שתן, עשיית הצרכים, עלייה במשקל גוף), כמו גם סימנים קליניים של מצוקה (piloerection, תנועה מופחתת) יומי הבאים הליך כירורגי. </li></ol> 5. קציר הריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7-30 ימים לאחר ההשתלה, להרדים את העכבר באמצעות CO 2 דרך המקור של גז דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בין הקצה של תהליך xyphoid וsternalחריץ (sternotomy חציון) וכל ריאות קציר עם ג&#39;ל המושתל לניתוח היסטולוגית וביוכימיים על ידי חיתוך קנה הנשימה ולנתח את כל החיבורים ללב, הריאות, ואת קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן ג&#39;ל המושתל עם ריאות עם 4% פתרון paraformaldehyde הלילה ב 4 מעלות צלזיוס, להטביע במתחם אוקטובר, ולקחת את חלקי צעד סידוריים של 30 מיקרומטר עובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע היסטולוגית (hematoxylin והכתים eosin) וניתוחי immunohistochemical (סמן אנדותל: CD31, סמן אפיתל: aquaporin (AQP) 5 ופעיל שטח חלבון (-B) SP) באמצעות מיקרוסקופ confocal 22,37,40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל ערימות של חלקים אופטיים (30 מיקרומטר עבים) כדי ליצור תמונות תלת-ממדיות של אנדותל ריאות ותאי האפיתל באמצעות תוכנת ניתוח תמונת 3D 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת אזורים צפויים של כלי דם חדש שנוצרו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מאמר זה מציג שיטה חדשה להשתלה בביו-חומרים על פני השטח הריאות של חיים עכבר בוגר. עם מערכת זו, אנגיוגנזה נגזרת-ריאה המארח סכמה בהצלחה בתוך החומר. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לחקור crosstalk בין תאי אנדותל, תאים אחרים (לדוגמא, תאי אפיתל, תאי mesenchymal, תאי מערכת חיסון) ורכיבי ECM שו...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להציג את השיטה להשתיל ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר, המאפשר לחוקרים לאפיין את המנגנונים המולקולריים של כלי דם ריאה ופיתוח alveolar, ולמנף את הידע הזה כדי לפתח חומרי biomimetic מסוגל של כלי דם ריאה משחזר פיסיולוגיים והיווצרות מכתשי לטיפול במחלות ריאה שונות. יותר מ -35 מיליון אמריקאים סובלים ממחלות ריאה כרוניות, כוללים מחלת ריאות חסימתית כרונית ופיברוזיס ריאתי. חולים אלה סימפטומים לטווח ארוך כרוניים בדרכי הנשימה כגון קוצר נשימה, לחץ בחזה, שיעול טורדני, ועייפות, שפוגעים בחיי היום היום שלהם 1-3 באופן משמעותי. למרות כמות גדולה של מאמץ לפתח טיפולים יעילים למחלות ריאה אלה, כיום אין תרופה; לכן, איכות חיים של חולים אלה היא עניה וכלכלי ועלויות אנושיות הייGH 4-7. נכון לעכשיו, השתלת ריאות היא הדרך היחידה להציל את החולים עם מחלות ריאה כרונית סופנית. עם זאת, בגלל המחסור בתורמים להשתלה, עלות גבוהה, סיבוכים חמורים, ושיעור הישרדות נמוך 8-11, השתלה היא לא גישה אופטימלית. התקדמות מהירה בטכניקות האחרונות הנדסת רקמות אפשרה לחוקרים bioengineer ריאות מושתלים על ידי אכלוס מחדש כל ריאות decellularized עם סוגים שונים של תאים או תאי גזע pluripotent מושרה (iPS) 12,13. עם זאת, ריאות bioengineered אלה הן פונקציונליות בבעלי החיים מארח רק לכמה שעות לאחר 12,14,15 השתלה. גם ניצול ביו-חומרים להתחדש מבנים ופונקציות המורכבים של ריאות היה די מוצלח. זה יכול להיות בגלל תהליכים ביולוגיים מרכזיים ששולטים בהתחדשות ריאות מבוגרים לא נחקרו היטב. בריאות, היווצרות של מערכת כלי הדם היא אחד מהאירועים המוקדמים והחשובים ביותר duriפיתוח ng והתחדשות 16-21. שהוקם זה עתה בvasculatures הריאות לא גם לספק רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להיווצרות איברים, אלא לספק אותות רגולציה מאלפות לתאים המקיפים 22-25. לפיכך, אנגיוגנזה משחקת תפקידי מפתח בalveolarization משובי בריאות מבוגרים 24,26,27. בנוסף, אנגיוגנזה deregulated תורמת למחלות ריאה כרוניות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) 28, דיספלזיה bronchopulmonary (BPD) 21-23, ופיברוזיס ריאתי 29. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להנדסת ריאות או טיפול במחלות ריאה כרוניות, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות. כל איבר מציג תכונות מכאניות וכימיות ייחודיות, אשר עשוי להיות שונה בין תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים 30-33. microenviron איבר ספציפי אלהמפעלים לווסת התנהגויות תא האנדותל ולתזמר יצירת רשת כלי דם באופן ספציפי לאיבר 24,34-36. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להתחדשות ריאות, המנגנון שבבסיס אנגיוגנזה ריאות ספציפיות צריך להיות מובן. בעוד מבחני אנגיוגנזה קונבנציונליים in vivo כגון השתלה תת עורית הידרוג&#39;ל נעשו שימוש נרחב למחקר אנגיוגנזה 37-39, שיטות אלה לא לשחזר אנגיוגנזה איבר ספציפי. לאחרונה, שיטה חדשנית להשתלת Matrigel בעובש אלסטי על ריאות העכבר פותחה והוצגה בהצלחה לגייס כלי דם ותאי האפיתל ריאות לג&#39;לים 22. גישה ייחודית זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנון של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, כמו גם יחסי גומלין בין כלי דם ותאי ריאה שאינם כלי דם בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. מאז 1) Matrigel אינו מתאים ליישום קליני; 2) הדוארעובש lastic משמש כדי להפיל את ג&#39;ל עשוי להשפיע על יחסי גומלין בין הידרוג ורקמת ריאה מארח ו -3) עובש אלסטי על הריאות שעלול להיות גורם פגיעה בתפקוד ריאות וכאב בזמן הנשימה, כגישה רלוונטית יותר מבחינה קלינית, מטריצת הפיברין 3D המכיל גורמי angiogenic (פקטור גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF) / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)) כבר מושתל על ריאות העכבר ללא יציקה בתבנית הגמישה, וסכם אנגיוגנזה המופקת ריאות מארח בהצלחה. ג&#39;ל ליפין, סיבי פולימר שנוצרו מפיברינוגן-ביקע תרומבין, ידוע למלכודת מגוון גורמי angiogenic כגון bFGF וVEGF להאיץ אנגיוגנזה in vivo 40,41. בשל יכולת ההתחדשות שלו והטבע מתכלה 42, ג&#39;ל הפיברין נעשה שימוש נרחב בתחום הנדסת רקמות. מאמר זה מציג רומן וגישה ייחודית להשתלת ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של adul חייםעכבר ולא מוכיח כי אנגיוגנזה המופקת ריאות המארח סכמה בתוך ג&#39;לי in vivo. שיטה זו, המאפשרת לחוקרים ללמוד אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, צפויה להוביל לפיתוח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה ולקדם באופן משמעותי את המאמצים לחדש ריאות מבוגרים בהצלחה.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

התקדמות משמעותית האחרונה בטכניקות מחקר בתאי גזע וביו-הנדסה עשו התקדמות גדולה בניצול ביו-חומרים להתחדש ולתקן את הנזק ברקמות פשוטות בתחומי האורתופדים וחניכיים. עם זאת, הניסיונות לחדש את המבנה ותפקוד של איברים מורכבים יותר תלת ממדי (3D) כגון ריאות לא היה מוצלח מאוד בגלל התהליכים הביולוגיים של התחדשות איבר לא נחקרו היטב. זה הופך להיות ברור שאנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים, ממלאת תפקידי מפתח בהתחדשות איבר. שהוקם זה עתה vasculatures לספק לא רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להתחדשות איבר אלא גם לספק אותות מאלפות לרקמות המקומיות ההתחדשות. לכן, כדי להתחדש בהצלחה ריאות במבוגרים, יש צורך לשחזר את microenvironments הריאות ספציפיות שבי אנגיוגנזה התחדשות של רקמות ריאה כוננים מקומיות. למרות שיתוףnventional in vivo מבחני אנגיוגנזה, כגון השתלה תת-עורית של מטריצה ​​תאית (ECM) -rich הידרוג (למשל, ג&#39;לים הפיברין או קולגן או Matrigel - תערובת חלבוני ECM מופרש על ידי תאי סרקומה עכבר Engelbreth-הולם-נחיל), באופן נרחב מנוצל כדי לחקור את מנגנונים כלליים של אנגיוגנזה, אנגיוגנזה ריאות ספציפיות לא מאופיין היטב כי שיטות להשתלת orthotopic של ביו-חומרים בריאות לא היו מבוססות היטב. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את שיטה ייחודית להשתלת ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר חיים, המאפשרת לסיכום המוצלח של אנגיוגנזה-נגזר ריאות המארח בתוך הג&#39;ל. גישה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את המנגנונים שבאמצעותם מייקרו-סביבת הריאות ספציפיות שולט אנגיוגנזה והתחדשות alveolar בשני תנאים נורמלים ופתולוגיים. מאז שחרור ביו-חומרים מושתלים ולספק אותות פיסיקליים וכימיים לl הסמוךרקמות ung, השתלה של ביו-חומרים אלה על ריאות חולות עלולה לנרמל את הרקמות חולות הסמוכות, המאפשרות לחוקרים לפתח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה.

כדי לבחון האם היווצרות כלי דם המופק מריאת המארח סכמה בתוך ביו-החומרים מושתלים על הריאות, ג&#39;לים הפיברין בתוספת VEGF הגדול angiogenic גורמים וbFGF (0, 10 ו -100 ng / ml כל אחד) היו מושתלים על פני השטח של ריאות עכבר חיים כ דיווח על שימוש ב-22 Matrigel. ג&#39;לים הפיברין 47 המכילים גור?...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

השרשה של הפיברין ג&#39;ל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Views.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

Video: Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Biology

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Developmental Biology

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

באנגיוגנזה ריאות עכברוש איסכמי

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Cancer Research

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

אינדוקציה של פגיעה בריאות העכבר על ידי הזרקת אנדוקנה של ליאומיצין

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Immunology and Infection

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

השתלת ריאות מהונדסות ביולוגית באמצעות ריאות עכבר נטולות תאים ותאי אנדותל אנושיים ראשוניים

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...

Bioengineering

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

השרשה של הפיברין ג'ל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אופטימליים הפיברין ג'ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה