עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאיגוד לב אמריקאי (בבוקר), משרד הגנה האמריקאי (BC074986), ובית החולים הפקולטה פיתוח הקריירה המלגה לילדים בבוסטון (TM, בבוקר). המחברים מודים אמנדה ג&#39;יאנג ואליזבת ג&#39;יאנג לקבלת סיוע טכני.

הערה: in vivo המחקר בבעלי החיים בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית החולים לילדים בבוסטון (במדבר פרוטוקול: 13-10-2526R, 14-02-2568R). כל התרופות המשמשות בפרוטוקול זה הן תרופות כיתה ותרופות אלה ערוכות בתנאים סטריליים. 1. הפיברין ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל הפיברין המכיל VEGF וbFGF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות הפשרת מניות של פיברינוגן ותרומבין המאוחסנים ב -80 ° C לטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרומבין (ריכוז סופי: 2.5 U / ml), CaCl 2 (ריכוז סופי: 45 מ&quot;מ), VEGF (ריכוז סופי: 0-100 ng / ml) וbFGF (ריכוז סופי: 0-100 ng / ml) לפיברינוגן פתרון (ריכוז סופי: 12.5 מ&quot;ג / מיליליטר בsodiu 0.9%מ &#39;פתרון כלוריד 43-45) בצינור 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה 200 μl של התערובת על צלחת פלסטיק סטרילי בצורה טיפה חכמה באמצעות קצה פיפטה p200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הטיפות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות, עד שהם לחזק. הערה: ג&#39;ל הקרושה יכול להיות כל הזמן בצלחת הפלסטיק האטום בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) במשך כמה שעות לפני ההשתלה (איור 1 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הג&#39;ל הפיברין לקוביות מ&quot;מ כ 3 x 3 x 3 באמצעות מספריים כירורגיות קטנים לפני ההשתלה. </li></ol> 2. עכבר הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בוגר (8-12 שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneal (IP) של קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם) ולאשר כי העכבר הוא מורדם כראוי על ידי צביטת הבוהן של העכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשחת וטרינר בעיניים של העכבר כדי למנוע יובש במהלך הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פו גילוחr על הצד השמאלי של בית החזה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אינטובציה endotracheal של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על אינטובציה לעמוד בזווית ב 70 מעלות ומחזיקים את העכבר במקום ידי משדלת החותכות העליונות שלה מעל גומייה קטנה הממוקמת בחלק העליון של הדוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לחזור בו מהלשון לצד אחד באמצעות מלקחיים בוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את הגרון בעזרת פנס מיקרוסקופ מתכווננת סיבים אופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר endotracheal אלסטי (21 G) לקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא נושם באופן ספונטני בצורה חלקה (100-150 נשימות / דקה רגילה, אין נשימה פרדוכסלית או רדודה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני לאוורר את העכבר באמצעות מכונת נשמה מכרסם (150 נשימות / דקה ו -7 מיליליטר / קילוגרם נפח של גאות ושפל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן צלעות לאתר שטח צלע בין 4 th ו -5 ריב ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת שדה סטרילי מעל האזור בy נגב ביסודיות עם אלכוהול וPovidone-יוד. לכסות את שדה הניתוח כראוי עם לעטוף כירורגית סטרילית. </li></ol> 3. ניתוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה מקומית של bupivacaine 0.25% (200 μl) בעור, לעשות חתך בעור רוחבי (כ אורך 1 סנטימטר) על מרחב הצלע באמצעות מספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה של bupivacaine 0.25% (200 μl) לתוך שריר הצלע, לעשות חתך שריר בין צלעות 4 th ו-5 באמצעות מספריים קטנים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מפשק לנתח בין הצלעות כדי להמחיש את הריאה השמאלית באופן מלא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד שטח קטן (ריבוע 1 x 1 מ&quot;מ) של הצדר הקרביים של מרכז הריאה השמאלית באמצעות מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל לחץ עדין על האזור באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי עד דליפות דימום והאוויר נשלטות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמות קטנה של תערובת טריות של פיברינוגן / תרומבין (דבק הפיברין) (שלב 1.1.2. &amp; # 20181; יב) על האזור באמצעות קצה פיפטה p200. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות ג&#39;ל הפיברין אחד (שלב 1.2) באמצעות מלקחיים קטנים מעל האזור (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שג&#39;ל קבוע גם באזור במהלך תנועות נשימה של הריאות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאין לא דולף אוויר מאסיבי ולא דימום מהריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתכים סגורים (שכבות שרירים ועור) עם תפר נספג, שאינו צריכים להסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חלל בית החזה באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מיליליטר כדי למנוע pneumothorax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים אוורור מכאני. </li></ol> שחזור עכבר 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא נושם באופן ספונטני בצורה חלקה (100-150 נשימות / דקה רגילה, אין נשימה פרדוכסלית או רדודה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IP להזריק 1 מיליליטר של טרום חימם 0.9% NaCl על מנת למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר עכבר כדי להתאושש על כרית מים החמה במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את endotracheצינור אל לאחר אישור שיש לו את העכבר נשימה יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק Meloxicam (5 מ&quot;ג / קילוגרם, הזרקה תת עורית (SC), במשך 3 ימים כמשכך כאבים שלאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התנועות של העכבר בזהירות במינימום של 15 דקות במרווחים עד שהוא sternal (הצליח לגלגל על ​​הבטן שלה ולהישאר זקוף) ומודע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאוששות, להחזיר את העכבר לכלוב חדש מבודד מעכברים ללא ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על האתר כירורגית לסימני זיהום (אדמומיות, נפיחות, הפרשות), פונקציות הביולוגיות הבסיסיות של בעלי החיים (צריכת מזון ומים, הטלת שתן, עשיית הצרכים, עלייה במשקל גוף), כמו גם סימנים קליניים של מצוקה (piloerection, תנועה מופחתת) יומי הבאים הליך כירורגי. </li></ol> 5. קציר הריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7-30 ימים לאחר ההשתלה, להרדים את העכבר באמצעות CO 2 דרך המקור של גז דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בין הקצה של תהליך xyphoid וsternalחריץ (sternotomy חציון) וכל ריאות קציר עם ג&#39;ל המושתל לניתוח היסטולוגית וביוכימיים על ידי חיתוך קנה הנשימה ולנתח את כל החיבורים ללב, הריאות, ואת קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן ג&#39;ל המושתל עם ריאות עם 4% פתרון paraformaldehyde הלילה ב 4 מעלות צלזיוס, להטביע במתחם אוקטובר, ולקחת את חלקי צעד סידוריים של 30 מיקרומטר עובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע היסטולוגית (hematoxylin והכתים eosin) וניתוחי immunohistochemical (סמן אנדותל: CD31, סמן אפיתל: aquaporin (AQP) 5 ופעיל שטח חלבון (-B) SP) באמצעות מיקרוסקופ confocal 22,37,40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל ערימות של חלקים אופטיים (30 מיקרומטר עבים) כדי ליצור תמונות תלת-ממדיות של אנדותל ריאות ותאי האפיתל באמצעות תוכנת ניתוח תמונת 3D 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת אזורים צפויים של כלי דם חדש שנוצרו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מאמר זה מציג שיטה חדשה להשתלה בביו-חומרים על פני השטח הריאות של חיים עכבר בוגר. עם מערכת זו, אנגיוגנזה נגזרת-ריאה המארח סכמה בהצלחה בתוך החומר. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לחקור crosstalk בין תאי אנדותל, תאים אחרים (לדוגמא, תאי אפיתל, תאי mesenchymal, תאי מערכת חיסון) ורכיבי ECM שו...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להציג את השיטה להשתיל ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר, המאפשר לחוקרים לאפיין את המנגנונים המולקולריים של כלי דם ריאה ופיתוח alveolar, ולמנף את הידע הזה כדי לפתח חומרי biomimetic מסוגל של כלי דם ריאה משחזר פיסיולוגיים והיווצרות מכתשי לטיפול במחלות ריאה שונות. יותר מ -35 מיליון אמריקאים סובלים ממחלות ריאה כרוניות, כוללים מחלת ריאות חסימתית כרונית ופיברוזיס ריאתי. חולים אלה סימפטומים לטווח ארוך כרוניים בדרכי הנשימה כגון קוצר נשימה, לחץ בחזה, שיעול טורדני, ועייפות, שפוגעים בחיי היום היום שלהם 1-3 באופן משמעותי. למרות כמות גדולה של מאמץ לפתח טיפולים יעילים למחלות ריאה אלה, כיום אין תרופה; לכן, איכות חיים של חולים אלה היא עניה וכלכלי ועלויות אנושיות הייGH 4-7. נכון לעכשיו, השתלת ריאות היא הדרך היחידה להציל את החולים עם מחלות ריאה כרונית סופנית. עם זאת, בגלל המחסור בתורמים להשתלה, עלות גבוהה, סיבוכים חמורים, ושיעור הישרדות נמוך 8-11, השתלה היא לא גישה אופטימלית. התקדמות מהירה בטכניקות האחרונות הנדסת רקמות אפשרה לחוקרים bioengineer ריאות מושתלים על ידי אכלוס מחדש כל ריאות decellularized עם סוגים שונים של תאים או תאי גזע pluripotent מושרה (iPS) 12,13. עם זאת, ריאות bioengineered אלה הן פונקציונליות בבעלי החיים מארח רק לכמה שעות לאחר 12,14,15 השתלה. גם ניצול ביו-חומרים להתחדש מבנים ופונקציות המורכבים של ריאות היה די מוצלח. זה יכול להיות בגלל תהליכים ביולוגיים מרכזיים ששולטים בהתחדשות ריאות מבוגרים לא נחקרו היטב. בריאות, היווצרות של מערכת כלי הדם היא אחד מהאירועים המוקדמים והחשובים ביותר duriפיתוח ng והתחדשות 16-21. שהוקם זה עתה בvasculatures הריאות לא גם לספק רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להיווצרות איברים, אלא לספק אותות רגולציה מאלפות לתאים המקיפים 22-25. לפיכך, אנגיוגנזה משחקת תפקידי מפתח בalveolarization משובי בריאות מבוגרים 24,26,27. בנוסף, אנגיוגנזה deregulated תורמת למחלות ריאה כרוניות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) 28, דיספלזיה bronchopulmonary (BPD) 21-23, ופיברוזיס ריאתי 29. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להנדסת ריאות או טיפול במחלות ריאה כרוניות, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות. כל איבר מציג תכונות מכאניות וכימיות ייחודיות, אשר עשוי להיות שונה בין תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים 30-33. microenviron איבר ספציפי אלהמפעלים לווסת התנהגויות תא האנדותל ולתזמר יצירת רשת כלי דם באופן ספציפי לאיבר 24,34-36. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להתחדשות ריאות, המנגנון שבבסיס אנגיוגנזה ריאות ספציפיות צריך להיות מובן. בעוד מבחני אנגיוגנזה קונבנציונליים in vivo כגון השתלה תת עורית הידרוג&#39;ל נעשו שימוש נרחב למחקר אנגיוגנזה 37-39, שיטות אלה לא לשחזר אנגיוגנזה איבר ספציפי. לאחרונה, שיטה חדשנית להשתלת Matrigel בעובש אלסטי על ריאות העכבר פותחה והוצגה בהצלחה לגייס כלי דם ותאי האפיתל ריאות לג&#39;לים 22. גישה ייחודית זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנון של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, כמו גם יחסי גומלין בין כלי דם ותאי ריאה שאינם כלי דם בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. מאז 1) Matrigel אינו מתאים ליישום קליני; 2) הדוארעובש lastic משמש כדי להפיל את ג&#39;ל עשוי להשפיע על יחסי גומלין בין הידרוג ורקמת ריאה מארח ו -3) עובש אלסטי על הריאות שעלול להיות גורם פגיעה בתפקוד ריאות וכאב בזמן הנשימה, כגישה רלוונטית יותר מבחינה קלינית, מטריצת הפיברין 3D המכיל גורמי angiogenic (פקטור גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF) / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)) כבר מושתל על ריאות העכבר ללא יציקה בתבנית הגמישה, וסכם אנגיוגנזה המופקת ריאות מארח בהצלחה. ג&#39;ל ליפין, סיבי פולימר שנוצרו מפיברינוגן-ביקע תרומבין, ידוע למלכודת מגוון גורמי angiogenic כגון bFGF וVEGF להאיץ אנגיוגנזה in vivo 40,41. בשל יכולת ההתחדשות שלו והטבע מתכלה 42, ג&#39;ל הפיברין נעשה שימוש נרחב בתחום הנדסת רקמות. מאמר זה מציג רומן וגישה ייחודית להשתלת ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של adul חייםעכבר ולא מוכיח כי אנגיוגנזה המופקת ריאות המארח סכמה בתוך ג&#39;לי in vivo. שיטה זו, המאפשרת לחוקרים ללמוד אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, צפויה להוביל לפיתוח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה ולקדם באופן משמעותי את המאמצים לחדש ריאות מבוגרים בהצלחה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:289px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fibrinogen from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4883</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9549</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse VEGF 164</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>493-MV</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3139-FB</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:177px;">Braintree Scientific INC</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fiber-Optic Light Source</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-35</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20G Elastic catheter</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4251652-02</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">MiniVent Ventilator</td>
			<td style="width:177px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">CGS-8009</td>
			<td>For ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Stemi DV4 Steromicroscope</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-070-515</td>
			<td>For surgey</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Absobable suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>PDP304</td>
			<td>Surgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">553370</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against AQP5</td>
			<td style="width:177px;">Abcam</td>
			<td>AB78486</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against SP-B</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td>AB40876</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

התקדמות משמעותית האחרונה בטכניקות מחקר בתאי גזע וביו-הנדסה עשו התקדמות גדולה בניצול ביו-חומרים להתחדש ולתקן את הנזק ברקמות פשוטות בתחומי האורתופדים וחניכיים. עם זאת, הניסיונות לחדש את המבנה ותפקוד של איברים מורכבים יותר תלת ממדי (3D) כגון ריאות לא היה מוצלח מאוד בגלל התהליכים הביולוגיים של התחדשות איבר לא נחקרו היטב. זה הופך להיות ברור שאנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים, ממלאת תפקידי מפתח בהתחדשות איבר. שהוקם זה עתה vasculatures לספק לא רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להתחדשות איבר אלא גם לספק אותות מאלפות לרקמות המקומיות ההתחדשות. לכן, כדי להתחדש בהצלחה ריאות במבוגרים, יש צורך לשחזר את microenvironments הריאות ספציפיות שבי אנגיוגנזה התחדשות של רקמות ריאה כוננים מקומיות. למרות שיתוףnventional in vivo מבחני אנגיוגנזה, כגון השתלה תת-עורית של מטריצה ​​תאית (ECM) -rich הידרוג (למשל, ג&#39;לים הפיברין או קולגן או Matrigel - תערובת חלבוני ECM מופרש על ידי תאי סרקומה עכבר Engelbreth-הולם-נחיל), באופן נרחב מנוצל כדי לחקור את מנגנונים כלליים של אנגיוגנזה, אנגיוגנזה ריאות ספציפיות לא מאופיין היטב כי שיטות להשתלת orthotopic של ביו-חומרים בריאות לא היו מבוססות היטב. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את שיטה ייחודית להשתלת ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר חיים, המאפשרת לסיכום המוצלח של אנגיוגנזה-נגזר ריאות המארח בתוך הג&#39;ל. גישה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את המנגנונים שבאמצעותם מייקרו-סביבת הריאות ספציפיות שולט אנגיוגנזה והתחדשות alveolar בשני תנאים נורמלים ופתולוגיים. מאז שחרור ביו-חומרים מושתלים ולספק אותות פיסיקליים וכימיים לl הסמוךרקמות ung, השתלה של ביו-חומרים אלה על ריאות חולות עלולה לנרמל את הרקמות חולות הסמוכות, המאפשרות לחוקרים לפתח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה.

כדי לבחון האם היווצרות כלי דם המופק מריאת המארח סכמה בתוך ביו-החומרים מושתלים על הריאות, ג&#39;לים הפיברין בתוספת VEGF הגדול angiogenic גורמים וbFGF (0, 10 ו -100 ng / ml כל אחד) היו מושתלים על פני השטח של ריאות עכבר חיים כ דיווח על שימוש ב-22 Matrigel. ג&#39;לים הפיברין 47 המכילים גור?...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

השרשה של הפיברין ג&#39;ל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Views.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

Video: Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit&#039;s Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

טיפול במומי Osteochondral במפרק הברך של הארנב על ידי השתלה של תאי גזע mesenchymal אלוגנאית בקרישי הפיברין

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

באנגיוגנזה ריאות עכברוש איסכמי

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

פולשנית Intratracheal אינטובציה ללמוד פתולוגיה והפיזיולוגיה של עכבר ריאות

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intratracheal החדרת תיווך אינטובציה (IMIT): מערכת לא פולשני, ריאות ספציפי משלוח

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

עכבר דגם ריאה של פיצוי ריאות צמיחה

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...