Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), e Boston Children Hospital Facoltà Career Development Fellowship (TM, AM). Gli autori ringraziano Amanda Jiang e Jiang Elisabeth per l&#39;assistenza tecnica.

NOTA: Lo studio in vivo degli animali in stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato esaminato e approvato dalla cura degli animali e uso Comitato di Hospital di Boston per bambini (numeri di protocollo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Tutti i farmaci utilizzati in questo protocollo sono di qualità farmaceutica e questi farmaci sono preparati in condizioni sterili. 1. fibrina Gel Preparazione <ol><li> Preparare gel di fibrina che contiene VEGF e bFGF. <ol><li> Scongelare soluzioni stock di fibrinogeno e trombina che sono immagazzinate a -80 ° C a temperatura ambiente (25 ° C). </li><li> Aggiungere trombina (concentrazione finale: 2,5 U / ml), CaCl 2 (concentrazione finale: 45 mM), VEGF (concentrazione finale: 0-100 ng / ml) e bFGF (concentrazione finale: 0-100 ng / ml) al fibrinogeno soluzione (concentrazione finale: 12,5 mg / ml in 0,9% sodium soluzione di cloruro 43-45) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Mescolare delicatamente pipettando. </li><li> Pipettare delicatamente 200 microlitri della miscela su un piatto di plastica sterile in modo goccia a goccia con punta p200 pipetta. </li><li> Incubare le gocce a 37 ° C per 30-60 min fino a che solidificano. NOTA: Il gel solidificato può essere mantenuto nel piatto di plastica sigillata a temperatura ambiente (25 ° C) per diverse ore prima dell&#39;impianto (Figura 1a). </li></ol></li><li> Tagliare il gel di fibrina in circa 3 x 3 x 3 millimetri cubi utilizzando piccole forbici chirurgiche prima dell&#39;impianto. </li></ol> 2. Preparazione del mouse <ol><li> Anestetizzare topo adulto (8-12 settimane) da intraperitoneale (IP) iniezione di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato pizzicando punta del mouse. <ol><li> Usare pomata veterinario su occhi del mouse per prevenire la secchezza durante l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Shave fur su lato sinistro della gabbia toracica del mouse. </li><li> Eseguire intubazione endotracheale del mouse. </li><li> Posizionare il mouse sul basamento intubazione angolata a 70 ° e tenere in posizione il mouse agganciando suoi incisivi superiori su un piccolo elastico situato nella parte superiore del supporto. </li><li> Ritrarre delicatamente la lingua da un lato con pinze smussato. </li><li> Visualizzare la laringe con l&#39;aiuto di un microscopio a collo d&#39;oca illuminatore a fibre ottiche. </li><li> Inserire endotracheale catetere elastico (21 G) nella trachea. </li><li> Verificare che il mouse sia spontaneamente respirando in modo regolare (normale 100-150 respiri / min, senza respiro paradosso o superficiale). </li><li> Posizionare il mouse in posizione prona al microscopio di dissezione. </li><li> Meccanicamente ventilare il mouse utilizzando un ventilatore roditore (150 respiri / min e 7 ml / kg volume corrente). </li><li> Contare costole di individuare spazio intercostale tra 4 ° e 5 ° costola. </li><li> Creare un campo sterile sull&#39;area by accuratamente pulire giù con alcool e Povidone-iodio. Coprire il campo chirurgico adeguato con un telo chirurgico sterile. </li></ol> 3. mouse Chirurgia <ol><li> Dopo iniezione locale di 0,25% bupivacaina (200 microlitri) nella pelle, fare una incisione cutanea trasversale (circa 1 cm di lunghezza) sopra spazio intercostale usando forbici dissezione. </li><li> Dopo l&#39;iniezione di 0,25% bupivacaina (200 ml) nel muscolo intercostale fare un&#39;incisione muscolo tra il 4 ° e 5 ° costola con belle piccole forbici. </li><li> Inserire un divaricatore dissezione tra le costole di visualizzare completamente il polmone sinistro. <ol><li> Raschiare una piccola area (1 x 1 mm quadrato) di pleura viscerale del centro di polmone sinistro utilizzando una pinza sottile. </li><li> Applicare una leggera pressione sulla zona con un tampone di cotone sterile fino sanguinamento e perdite d&#39;aria sono completamente controllati. </li><li> Mettete piccola quantità di miscela fresca di fibrinogeno / trombina (colla di fibrina) (fase 1.1.2. 20 &amp; #181; l) sopra la zona utilizzando punta p200 pipetta. </li></ol></li><li> Posizionare delicatamente un gel di fibrina (passo 1,2) con piccole pinze sopra la zona (Figura 1b). <ol><li> Verificare che il gel è ben fissato sulla superficie durante i movimenti respiratori del polmone. </li></ol></li><li> Verificare che non vi è né perdite di aria massiccia né sanguinamento dal polmone. </li><li> Chiudi incisioni (strati muscolari e cutanee) con sutura riassorbibile, che non devono essere rimosse. </li><li> Aspirare la cavità toracica con 27 G ago e siringa da 1 ml per evitare pneumotorace. </li><li> Terminare la ventilazione meccanica. </li></ol> 4. Il recupero del mouse <ol><li> Assicurarsi che il mouse sia spontaneamente respirando in modo regolare (normale 100-150 respiri / min, senza respiro paradosso o superficiale). </li><li> IP iniettare 1 ml di pre-riscaldato 0,9% NaCl per prevenire la disidratazione. </li><li> Lasciare il mouse per recuperare sul pad circolare acqua calda. </li><li> Rimuovere il endotracheal tubo dopo aver confermato che il mouse ha respirazione stabile. </li><li> Iniettare Meloxicam (5 mg / kg, iniezione sottocutanea (SC), per 3 giorni come analgesico postoperatorio. </li><li> Monitorare i movimenti del mouse attentamente un minimo di 15 min intervalli finché è sternale (grado di rotolare sul suo stomaco e restare in piedi) e consapevole. </li><li> Dopo il recupero, ritorno il mouse in una nuova gabbia isolata da topi senza intervento chirurgico. </li><li> Monitorare il sito chirurgico per segni di infezione (rossore, gonfiore, scarico), le funzioni biologiche di base di animali (cibo e acqua presa, minzione, defecazione, corpo aumento di peso), così come i segni clinici di sofferenza (piloerezione, ridotta locomozione) al giorno dopo la procedura chirurgica. </li></ol> 5. La raccolta Polmone <ol><li> 7 a 30 giorni dopo l&#39;impianto, eutanasia il mouse utilizzando CO 2 tramite fonte di gas compresso. </li><li> Fare un&#39;incisione tra la punta del processo xifoideo e sternalenotch (sternotomia mediana) e il raccolto intero polmone con il gel impiantato per l&#39;analisi istologica e biochimica tagliando la trachea e sezionare tutti i collegamenti con il cuore, i polmoni, e la trachea. </li><li> Fissare gel impiantato con polmoni con soluzione di paraformaldeide 4% per una notte a 4 ° C, incorporare in OCT, e prendere le sezioni di passo di serie di 30 micron di spessore. </li><li> Eseguire istologico (ematossilina e eosina) e le analisi immunoistochimica (marcatore endoteliale: CD31, marcatore epiteliale: aquaporin (AQP) 5 e surfattante proteina (SP) -B) utilizzando il microscopio confocale 22,37,40. </li><li> Compilare pile di sezioni ottiche (30 micron di spessore) per formare le immagini tridimensionali di cellule endoteliali e cellule epiteliali del polmone mediante immagini 3D software di analisi 37. </li><li> Quantificare le aree proiettate dei vasi sanguigni di nuova formazione con immagine software di analisi 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo articolo introduce un nuovo metodo per impiantare biomateriali sulla superficie del polmone di vivere topo adulto. Con questo sistema, angiogenesi ospitante polmone-derivato è ricapitolato correttamente all&#39;interno del materiale. Questo sistema permette ai ricercatori di esplorare diafonia tra le cellule endoteliali, altre cellule (ad esempio, cellule epiteliali, cellule mesenchimali, cellule immunitarie) e vari componenti ECM che sono necessari per l&#39;angiogenesi locale 50-53 e rigene...

L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di introdurre un metodo per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di topo adulto, che permette ai ricercatori di caratterizzare i meccanismi molecolari di vascolare polmonare e sviluppo alveolare, e di sfruttare questa conoscenza per sviluppare materiali biomimetici grado di ricapitolare vascolare polmonare fisiologica e formazione alveolare per il trattamento di varie malattie polmonari. Più di 35 milioni di americani soffrono di malattie polmonari croniche, tra cui malattia polmonare ostruttiva cronica e fibrosi polmonare. Questi pazienti hanno sintomi di lunga durata croniche respiratorie, come mancanza di respiro, senso di costrizione toracica, tosse fastidiosa, e la stanchezza, che limitano considerevolmente la loro vita quotidiana 1-3. Nonostante una grande quantità di sforzo per sviluppare terapie efficaci per queste malattie polmonari, attualmente non esiste una cura; quindi, la qualità della vita di questi pazienti è scarsa ed economica e costi umani sono high 4-7. Attualmente, il trapianto di polmone è l&#39;unico modo per salvare i pazienti con stadio terminale malattie polmonari croniche. Tuttavia, a causa della carenza di donatori di trapianto, costo elevato, gravi complicazioni, e basso tasso di sopravvivenza 8-11, il trapianto non è un approccio ottimale. Recenti rapidi progressi nelle tecniche di ingegneria tissutale ha permesso ai ricercatori di bioingegnere polmone impiantabile da ripopolamento decellularized intero polmone con vari tipi di cellule progenitrici o staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule 12,13. Tuttavia, questi polmoni bioingegneria sono funzionali in animali ospiti solo per diverse ore dopo l&#39;impianto 12,14,15. Utilizzando biomateriali per rigenerare le strutture complesse e le funzioni dei polmoni è stato abbastanza infruttuoso anche. Ciò può essere dovuto processi biologici fondamentali che regolano la rigenerazione dei polmoni per adulti non sono stati ben esplorato. Nel polmone, formazione del sistema vascolare è uno degli eventi prime e più importanti durisviluppo ng e rigenerazione 16-21. Vasculatures nuova formazione nel polmone non solo fornire ossigeno, nutrienti e vari componenti cellulari necessari per la formazione di organi, ma anche fornire segnali regolatori istruttivi alle cellule circostanti 22-25. Così, l&#39;angiogenesi svolge un ruolo chiave nel alveolarization rigenerativa nei polmoni adulti 24,26,27. Inoltre, l&#39;angiogenesi deregolamentato contribuisce a malattie polmonari croniche come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) 28, displasia broncopolmonare (BPD) 21-23, e la fibrosi polmonare 29. Così, per sviluppare strategie più efficaci per l&#39;ingegneria polmoni o la cura delle malattie polmonari croniche, è necessario capire i meccanismi fondamentali di angiogenesi specifici polmone. Ogni organo visualizza uniche proprietà meccaniche e chimiche, che possono differire tra le condizioni fisiologiche e patologiche 30-33. Questi microenviron organo-specificamenti regolano i comportamenti delle cellule endoteliali e orchestrare la formazione della rete vascolare in maniera specifica per organo 24,34-36. Così, per sviluppare strategie più efficaci per la rigenerazione dei polmoni, il meccanismo alla base dell&#39;angiogenesi specifici polmone deve essere capito. Mentre convenzionali in vivo test di angiogenesi come il sottocutaneo idrogel l&#39;impianto sono stati ampiamente utilizzati per la ricerca angiogenesi 37-39, questi metodi non ricapitolano angiogenesi organo-specifica. Recentemente, un nuovo metodo per impiantare Matrigel in uno stampo elastico sul polmone del mouse è stato sviluppato e dimostrato di reclutare vasi sanguigni e cellule epiteliali polmonari nei gel 22. Questo approccio unico permetterà ai ricercatori di esplorare il meccanismo di angiogenesi specifici polmone, nonché le interazioni tra i vasi sanguigni e cellule polmonari non-vascolari in condizioni fisiologiche e patologiche. Poiché 1) Matrigel non è adatto per l&#39;applicazione clinica; 2) la emuffa lastic utilizzato per lanciare il gel possono influenzare le interazioni tra idrogel e tessuto polmonare ospitante e 3) lo stampo elastico sul polmone potenzialmente causa compromissione della funzione polmonare e dolore durante la respirazione, come un approccio più clinicamente rilevante, una matrice di fibrina 3D contenente fattori angiogenetici (fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) / base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF)) è stato impiantato il polmone mouse senza fusione in stampo elastico, ed è ricapitolata successo ospite angiogenesi polmone-derivato. Gel di fibrina, fibrille polimeriche generati dal fibrinogeno-trombina spaccati, è noto per intrappolare una varietà di fattori angiogenici come bFGF e VEGF per accelerare l&#39;angiogenesi in vivo 40,41. A causa della sua capacità rigenerativa e la natura biodegradabile 42, gel di fibrina è ampiamente usato nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti. Questo articolo introduce un approccio nuovo e unico per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di Adul viveret mouse e dimostra che ospitano l&#39;angiogenesi polmone-derivato è ricapitolato all&#39;interno dei gel in vivo. Questo metodo, che consente ai ricercatori di studiare l&#39;angiogenesi specifici polmone, probabilmente porterà allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per i vari tipi di malattie polmonari e far avanzare in modo significativo gli sforzi per rigenerare con successo polmonare adulta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:289px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fibrinogen from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4883</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9549</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse VEGF 164</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>493-MV</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3139-FB</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:177px;">Braintree Scientific INC</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fiber-Optic Light Source</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-35</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20G Elastic catheter</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4251652-02</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">MiniVent Ventilator</td>
			<td style="width:177px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">CGS-8009</td>
			<td>For ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Stemi DV4 Steromicroscope</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-070-515</td>
			<td>For surgey</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Absobable suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>PDP304</td>
			<td>Surgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">553370</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against AQP5</td>
			<td style="width:177px;">Abcam</td>
			<td>AB78486</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against SP-B</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td>AB40876</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

I recenti progressi significativi nelle tecniche di ricerca e bioingegneria delle cellule staminali hanno fatto grandi progressi nell&#39;utilizzazione biomateriali per rigenerare e riparare i danni nei tessuti semplici nel settore ortopedico e parodontali. Tuttavia, i tentativi di rigenerare le strutture e le funzioni più complesse tridimensionali (3D) organi come polmoni non hanno avuto molto successo perché i processi biologici di rigenerazione di organi non sono stati ben esplorato. E &#39;ormai chiaro che l&#39;angiogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni, gioca un ruolo chiave nella rigenerazione degli organi. Di recente formazione vasculatures forniscono non solo ossigeno, nutrienti e vari componenti cellulari che sono necessari per la rigenerazione di organi, ma anche fornire segnali istruttivi ai rigeneranti tessuti locali. Pertanto, per rigenerare successo polmoni in un adulto, è necessario ricapitolare i microambienti specifico polmonari in cui angiogenesi unità rigenerazione dei tessuti polmonari locali. Sebbene conventional saggi in vivo di angiogenesi, come impianto sottocutaneo di matrice extracellulare (ECM) ricchi di idrogel (per esempio, fibrina o collagene gel o Matrigel - miscela di proteine ​​ECM secreta dalle cellule del mouse Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma), sono ampiamente utilizzati per esplorare la meccanismi generali di angiogenesi, angiogenesi specifici polmone non è stato ben caratterizzato, perché i metodi per l&#39;impianto ortotopico di biomateriali a livello polmonare non sono stati ben stabiliti. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre un metodo unico per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di vivere topo adulto, consentendo la ricapitolazione di successo dell&#39;ospite angiogenesi polmone-derivati ​​all&#39;interno del gel. Questo approccio consente ai ricercatori di esplorare i meccanismi con cui il microambiente specifico-polmone controlla l&#39;angiogenesi e la rigenerazione alveolare sia in condizioni normali e patologiche. Dal biomateriali impiantati rilascio e fornire segnali fisici e chimici a adiacente ltessuti ung, l&#39;impianto di questi biomateriali sul polmone malato possono potenzialmente normalizzare i tessuti malati adiacenti, consentendo ai ricercatori di sviluppare nuovi approcci terapeutici per i vari tipi di malattie polmonari.

Per esaminare se ospite polmone-derivato formazione vascolare è ricapitolato all&#39;interno dei biomateriali impiantati sul polmone, gel di fibrina integrati con i principali fattori angiogenici VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml) sono stati impiantati sulla superficie della vita polmoni mouse come segnalato con Matrigel 22. Gel di fibrina 47 che contengono questi fattori di crescita angiogenici sono stati fabbricati come mostrato in Figura 1a. Dopo toracotomia, una piccola area de...

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Views.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 