Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (AM), ABD Savunma Bakanlığı (BC074986), Boston Çocuk Hastanesi Fakültesi Kariyer Geliştirme Bursu (TM, AM) fonları tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, teknik yardım için Amanda Jiang ve Elisabeth Jiang teşekkür ederiz.

NOT: in vivo hayvan çalışması Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. protokol gözden ve Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol Numaraları: 13-10-2526R, 14-02-2568R) tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm ilaçlar, farmasötik dereceli olan ve bu ilaçlar, steril koşullar altında hazırlanır. 1. fibrin jel çözeltisi, <ol><li> VEGF ve bFGF içeren fibrin jel hazırlayın. <ol><li> Oda sıcaklığına kadar -80 ° C (25 ° C) saklanır fibrinojen ve trombin çözülme stok çözeltileri. </li><li> Fıbrinojene: (0-100 ng / ml nihai konsantrasyon), CaCl2 (nihai konsantrasyon: 45 mM), VEGF (nihai konsantrasyon 0-100 ng / ml) ve bFGF: trombin (2.5 U / ml nihai konsantrasyon) ilave çözeltisi (nihai konsantrasyon:% 0.9 sodiu içinde 12.5 mg / mlm 1,5 ml tüp klorür solüsyonu 43-45). </li><li> Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın. </li><li> Yavaşça P200 pipet kullanarak damla damla steril bir plastik tabak üzerine karışımın 200 ul pipetle. </li><li> Katılaşma kadar, 30-60 dakika boyunca, 37 ° C&#39;de damla inkübe edin. Not: katılaşmış jel implantasyon (Şekil 1a) önce bir kaç saat için oda sıcaklığında (25 ° C) &#39;de kapalı bir plastik tabak içinde tutulabilir. </li></ol></li><li> Implantasyon öncesi küçük cerrahi makas kullanarak yaklaşık 3 x 3 x 3 mm küpler halinde fibrin jel Trim. </li></ol> 2. Fare Hazırlama <ol><li> Intraperitoneal ketamin ile (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) (IP) enjeksiyon yetişkin fare (8-12 hafta) uyutmak ve fare yeterince fare burnunu sıkıştırarak anestezi onaylayın. <ol><li> Deney sırasında kuruluğunu önlemek için fare gözleri veteriner merhem kullanın. </li></ol></li><li> Tıraş fufare göğüs kafesinin sol tarafında üzerinde r. </li><li> Fare endotrakeal entübasyon gerçekleştirin. </li><li> Entübasyon fare 70 ° açılı standı ve standın üst kısmında bulunan küçük bir lastik bant üzerinde üst kesicilerin çengel yerinde fareyi tutun yerleştirin. </li><li> Yavaşça künt forseps kullanarak bir tarafa dilini geri çekin. </li><li> Bir fiber-optik mikroskop boynu ışığı yardımı ile gırtlak gözünüzde canlandırın. </li><li> Trakea içine endotrakeal elastik kateter (21 G) yerleştirin. </li><li> Fare kendiliğinden (normal 100-150 solunum / dk, hiçbir paradoksal veya sığ solunum) sorunsuz bir biçimde nefes olduğunu doğrulayın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin. </li><li> Mekanik bir kemirgen vantilatör kullanarak fare havalandırın (150 solunum / dk ve 7 ml / kg tidal hacmi). </li><li> 4. ve 5. kaburga arasındaki interkostal boşluk bulmak için kaburga sayın. </li><li> Alan b üzerinde steril bir alan oluşturuny iyice alkol ve Povidon-İyot ile silerek. Steril cerrahi örtü ile yeterince cerrahi alan örtün. </li></ol> 3. Fare Cerrahisi <ol><li> Deri içinde% 0.25 bupivakain (200 ul), lokal enjeksiyonundan sonra, kesme makasları kullanılarak interkostal aralığa boyunca enine cilt insizyonu (yaklaşık 1 cm uzunluğu) sunuyor. </li><li> Interkostal kas içine% 0.25 bupivakain (200 ul) enjeksiyonundan sonra, ince, küçük makas kullanarak 4. ve 5. kaburga arasında bir kas kesi yapmak. </li><li> Tam sol akciğer görselleştirmek için kaburga arasında bir diseksiyon retraktör yerleştirin. <ol><li> Ince forseps kullanılarak sol akciğer merkezinin viseral plevra küçük bir alanda (1 x 1 mm kare) Pençe. </li><li> Kanama ve hava kaçakları tamamen kontrol kadar steril bir pamuklu çubukla kullanarak alanda hafif basınç uygulayın. </li><li> Fibrinojen / trombin (fibrin yapıştırıcı) taze karışımı (adım 1.1.2. 20 &amp; # az miktarda koyun181; P200 pipet kullanarak alana l). </li></ol></li><li> Yavaşça alanı (Şekil 1b) üzerinde küçük forseps kullanarak bir fibrin jel (adım 1.2) yerleştirin. <ol><li> Jel de akciğer solunum hareketleri sırasında bölgede sabit olduğunu doğrulayın. </li></ol></li><li> Ne masif hava sızıntı veya akciğer kanaması olduğundan emin olun. </li><li> Bulunmamaktadır absorbe edilebilir sütür ile yakın insizyon (kas ve deri tabakaları) bertaraf edilmesi. </li><li> Pnömotoraks önlemek için 27 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak göğüs boşluğu aspire. </li><li> Mekanik ventilasyon sonlandırın. </li></ol> 4. Fare Kurtarma <ol><li> Fare kendiliğinden düzgün bir şekilde (normal 100-150 solunum / dk, hiçbir paradoksal veya sığ solunum) nefes emin olun. </li><li> IP 1 ml enjekte dehidratasyonu önlemek için NaCl% 0.9 önceden ısıtılmış. </li><li> Fare dolaşan sıcak su yastığı üzerinde kurtarmak için izin verin. </li><li> Endotrache kaldırFare istikrarlı nefes olduğunu onayladıktan sonra al tüpü. </li><li> Ameliyat sonrası ağrı kesici olarak 3 gün boyunca, meloksikam (5 mg / kg, deri altına enjeksiyon (SC) enjekte edilir. </li><li> O (kendi mide üzerine rulo mümkün ve dik kalması) sternum ve bilinçli kadar dikkatlice 15 dakika aralıklarla en az fare hareketlerini izlemek. </li><li> İyileştikten sonra, ameliyat olmadan farelerden izole bir yeni kafes fare dönün. </li><li> Günlük aşağıdaki enfeksiyon belirtileri (kızarıklık, şişme, akıntı), hayvanın temel biyolojik fonksiyonları (gıda ve su alımı, idrar, dışkılama, vücut ağırlığı artışı) yanı sıra klinik belirtileri sıkıntı cerrahi sitesini (piloerection, azaltılmış hareket) Monitör cerrahi prosedür. </li></ol> 5. Hasat Akciğer <ol><li> 7-30 gün implantasyondan sonra, sıkıştırılmış gazın kaynağı ile CO2 kullanılarak fare euthanize. </li><li> Xiphoid sürecin ucu ve Sternum arasında bir kesi yapmakçentik (medyan sternotomi) ve trakea kesme ve kalp, akciğerler, trakea tüm bağlantıları keserek histolojik ve biyokimyasal analiz için implante jel ile hasat tüm akciğer. </li><li> Gecede Ekim bileşik embed 4 ºC,% 4 paraformaldehit çözeltisi ile akciğer ile implante jel Fix ve 30 mikron kalınlığında seri adımı bölümlerini almak. </li><li> Histolojik (hematoksilen ve eozin boyama) ve immünohistokimyasal analizler gerçekleştirin (endotel işaretleyici: CD31, epitel işaretleyici: aquaporin (AQP) 5 ve surfaktan protein (SP) -B) konfokal mikroskop 22,37,40 kullanarak. </li><li> 3D görüntü analiz yazılımı kullanarak 37 akciğer endotel üç boyutlu görüntüler ve epitel hücreleri oluşturmak için optik bölümler (kalın 30 mikron) yığınlarını derleyin. </li><li> Görüntü analiz yazılımı 46 kullanılarak yeni oluşan kan damarlarının öngörülen alanları gösteren alanlardır. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu makalede, erişkin fare yaşayan akciğer yüzeyinde biyomalzemeleri implant için yeni bir yöntem tanıttı. Bu sistem ile, ana akciğer elde edilmiş angiogenesis men başarılı bir malzeme içinde değinmeyecek. Bu sistem, araştırmacılar, endotel hücreleri arasındaki karışma keşfetmek sağlar, diğer hücrelerin (örneğin, epitelyal hücreler, mezenkimal hücreler, bağışıklık hücreleri) yerel anjiyojenez 50-53 ve alveolar rejenerasyon 24,54 için gerekli olan ve ECM ...

Bu protokolün genel amacı araştırmacılar, akciğer vasküler ve alveol gelişme moleküler mekanizmaları karakterize sağlar erişkin fare, akciğer yüzeyinde fibrin jel implant için bir yöntem tanıtmak ve yetenekli biyomimetik malzemelerin geliştirilmesi için bu bilgiyi kaldıraç için çeşitli akciğer hastalıkları tedavi etmek için fizyolojik akciğer vasküler ve alveol oluşumunu yansıtan bir. 35 milyondan fazla Amerikalı kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve pulmoner fibrozis gibi kronik akciğer hastalıkları muzdarip. Bu hastalar önemli ölçüde günlük yaşam 1-3 bozan tür nefes darlığı, göğüste sıkışma hissi, öksürük nagging ve yorgunluk gibi uzun ömürlü kronik solunum semptomları var. Bu akciğer hastalıkları için etkili tedaviler geliştirmek için çaba büyük bir miktarda rağmen, şu anda tedavisi yoktur; Bu nedenle, bu hastalarda yaşam kalitesi zayıf ve ekonomik ve insani maliyeti merhaba vardırgh 4-7. Şu anda, akciğer transplantasyonu son dönem kronik akciğer hastalığı olan hastaları kurtarmak için tek yoldur. Ancak, nakli donör, yüksek maliyet, ciddi komplikasyonlar ve düşük sağkalım oranı 8-11 sıkıntısı, transplantasyon optimal yaklaşım değildir. Doku mühendisliği teknikleri son hızla ilerleme progenitör hücreleri veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden 12,13 çeşitli tipleri ile decellularized bütün akciğeri repopulating tarafından implante akciğer biyomühendis araştırmacıların sağladı. Bununla birlikte, bu bulasıcı akciğerler sadece implantasyon 12,14,15 sonra birkaç saat süre ile bir ev sahibi, hayvanlarda işlevsel. Akciğerlerin karmaşık yapıları ve işlevleri yenilenmesine biomateryaller kullanmak da oldukça başarısız olmuştur. Erişkin akciğer rejenerasyon yöneten kilit biyolojik süreçler iyi araştırılmış değil çünkü bu olabilir. Akciğerde vasküler sistemin oluşumu erken ve en önemli olaylarından biri olan During geliştirme ve yenilenme 16-21. Yeni, sadece oksijen, besin ve organ oluşumu için gerekli olan çeşitli hücre bileşenleri teslim değil, aynı zamanda çevredeki hücrelere 22-25 öğretici düzenleyici sinyallerini sağlamaz akciğerde vaskülatürlerden kurdu. Böylece, anjiyogenez yetişkin akciğerlerde 24,26,27 rejeneratif alveolarization kilit roller oynar. Buna ek olarak, düzensiz anjiyogenez, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), 28, bronkopulmoner displazi (SKB), 21-23, ve pulmoner fibroz 29 gibi kronik akciğer hastalıklarına katkıda bulunur. Böylece, akciğerleri mühendislik veya kronik akciğer hastalıklarının tedavisi için daha etkili stratejiler geliştirmek, akciğer özel anjiyogenez temel mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Her organ fizyolojik ve patolojik durumlarda 30-33 arasında farklılık benzersiz mekanik ve kimyasal özelliklere gösterir. Bu organa özgü microenvironrından endotel hücre davranışlarını düzenleyen ve bir organ-spesifik şekilde 24,34-36 vasküler ağı oluşumu sonucu alacak. Böylece, akciğer rejenerasyonu için daha etkin stratejilerin geliştirilmesi için, akciğer özgü angiogenesisi altında yatan mekanizmanın anlaşılması gerekir. Subkutan hidrojel implantasyonu gibi in vivo geleneksel anjiyojenez tahlilleri anjiyogenez araştırma 37-39 için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu yöntemler, organa özgü anjiyojenezi özetlemek yoktur. Son zamanlarda, fare akciğer elastik kalıp içinde Matrigel implant için yeni bir yöntem geliştirilmiştir ve başarılı bir jel 22, kan damarları ve akciğer epitelyal hücreleri iyileştirme gösterilmiştir. Bu eşsiz bir yaklaşım araştırmacılar fizyolojik ve patolojik durumlarda, kan damarları ve vasküler olmayan akciğer hücreleri arasında akciğer özgü anjiyojenezin mekanizması olarak etkileşimleri keşfetmek için izin verir. 1) Matrigel klinik uygulama için uygun olmadığı; 2) EBir klinik olarak daha uygun bir yaklaşım olarak, hidrojeller ve ev sahibi akciğer dokusunda ve 3) akciğer elastik kalıp potansiyel solunum sırasında akciğer fonksiyonu ve ağrı gibi yakınmalara yol açar arasındaki etkileşimi etkileyebilir jel döküm için kullanılan Lastic kalıp, bir 3D fibrin matriks anjiogenik faktörleri içeren (vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) / temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)) elastik kalıp döküm olmaksızın fare akciğer implante edilmiş ve başarılı bir şekilde ana akciğer türetilmiş angiogenesisi değinmeyecek olmuştur. Fibrin jel, trombinle ayrılmış fibrinojenden oluşan polimer fibriller yakalamak için in vivo 40,41 anjiyojenezi hızlandırmak için örneğin bFGF ve VEGF gibi anjiyojenik faktörlerin bir çeşitliliği bilinmektedir. Çünkü onun rejeneratif yeteneği ve biyobozunur doğa 42, fibrin jel yaygın doku mühendisliği alanında kullanılır. Bu makalede yaşayan Adul akciğer yüzeyinde fibrin jel implant bir roman ve benzersiz bir yaklaşım tanıttıt, fare ve ana akciğer elde edilmiş angiogenesis men in vivo jellerin içinde özetlenen olduğunu göstermektedir. Akciğer özel anjiyogenez çalışma araştırmacılar sağlayan bu yöntem, büyük olasılıkla akciğer hastalıkları çeşitli türleri için yeni tedavi yaklaşımlarının gelişmesine yol ve anlamlı başarıyla yetişkin akciğeri yeniden çabalarını ilerleyecektir.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

Kök hücre araştırma ve biyomühendislik tekniklerinden son önemli gelişmeler yeniden ve ortopedik ve periodontal alanlarda basit dokularda hasarı onarmak için biomateryaller kullanan büyük ilerleme kaydettik. Organ yenilenmesi biyolojik süreçleri iyi araştırılmış değil çünkü Ancak, yapılar ve akciğer gibi daha karmaşık üç boyutlu (3D) organların işlevlerini yeniden çalışır çok başarılı olmamıştır. Angiogenesisin, yeni kan damarlarının oluşumu, organ yenilenmesi kilit rol oynadığı açık hale gelmektedir. Yeni vaskülatürlerden oksijen, besinler ve organ yenilenmesi için gerekli olan çeşitli hücre bileşenleri sunmak değil, aynı zamanda rejenere dokularda lokal bir öğretici sinyallerini sağlamaz olarak, oluşturulmuş. Bu nedenle, başarılı bir yetişkinde akciğerlere yeniden oluşturmak, lokal, akciğer dokularının sürücüler rejenerasyonu angiogenesis olan akciğer özgü mikroçevrelerde özetlemek için gereklidir. Co rağmennventional, in vivo bu hidrojeller (örneğin, fibrin ve kollajen jelleri veya Matrigel - Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan ECM proteini karışımı) bakımından zengin hücre dışı matrisin (ECM), deri altından implante anjiyojenez tahlilleri, yoğun keşfetmek için kullanılır akciğer biyomateryaller ortotopik implantasyonu için yöntemler iyi tespit edilmemiştir çünkü anjiyojenez genel mekanizma, akciğer spesifik anjiyojenez iyi karakterize edilmemiştir. Bu protokolün amacı jel içinde ev sahibi akciğer kaynaklı anjiyogenez başarılı recapitulation sağlayan, yaşam yetişkin fare akciğer yüzeyinde fibrin jel implant benzersiz bir yöntem tanıtmaktır. Bu yaklaşım, akciğer özgü mikroçevresinin, normal ve patolojik durumlarda hem anjiyogenez ve alveol yenilenmesini kontrol eden mekanizmalar keşfetmek için araştırmacılar sağlar. Implante biyomalzemeler sunulduğundan beri komşu l fiziksel ve kimyasal sinyalleri tedarik veung dokular, hastalıklı akciğer bu biyomalzeme implantasyonu potansiyel akciğer hastalıkları çeşitli türleri için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için araştırmacılar sağlayan, komşu hastalıklı dokuları normale olabilir.

Ana akciğer türevi damar oluşumu, akciğer implante biyomalzeme içinde özetlenen olup olmadığını incelemek için, fibrin jel büyük anjiyojenik faktörler VEGF ve bFGF ile desteklenmiş (0, 10 ve 100 ng / ml her biri) gibi canlı fare akciğer yüzeyine yerleştirildi Matrigel 22 kullanılarak bildirdi. Şekil 1a gösterildiği gibi bu anjiyojenik büyüme faktörleri içerir fibrin jeller 47 imal edildi. Torakotomi sonra, sol akciğer yüzeyinde küçük bir alanda forse...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Fare Akciğer Fibrin Gel implantasyonu Akciğer özel Anjiogenez Eğitim için

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Görüntüleme.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

Video: Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Biyoloji

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Anjiyogenez Çalışması Kornea Cep Testi Fare Modeli

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Tıp

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Gelişim Biyolojisi

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

İskemik Sıçan Akciğer Angiogenezis

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Kanser Araştırmaları

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Fare Modeli Inferior Vena Cava İnterpozisyon Greft İmplantasyonu

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Bleomisin endotrakeal enjeksiyon tarafından fare akciğer hasarı indüksiyon

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

Hücreden Arındırılmış Fare Akciğerleri ve Primer İnsan Endotel Hücreleri Kullanılarak Biyomühendislik Ürünü Akciğerin Transplantasyonu

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...

Biyomühendislik

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...