이 작품은 미국 심장 협회 (AM), 미국 국방부 (BC074986), 보스턴 어린이 병원 교수 경력 개발 원정대 (TM, AM)에서 기금에 의해 지원되었다. 저자는 기술 지원을 아만다 장과 엘리자베스 지앙 감사합니다.

참고 : 생체 내 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 이 프로토콜은 검토하고 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 : 13-10-2526R, 14-02-2568R)에 의해 승인되었다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 약물은 제약 학년이며,이 약은 무균 상태에서 제조된다. 1. 섬유소 젤 준비 <ol><li> VEGF와 bFGF에 포함되어 섬유소 젤을 준비합니다. <ol><li> 실온까지 -80 ° C (25 ℃)에서 저장된다 피브리노겐과 트롬빈 녹여 원액. </li><li> 피브리노겐에 (0 ~ 100 NG / ml의 최종 농도), 염화칼슘 (2) (최종 농도 45 mM의), VEGF (최종 농도 0 ~ 100 NG / ㎖)과의 bFGF : 트롬빈 (2.5 U / ml의 최종 농도)를 추가합니다 솔루션 (최종 농도 0.9 %의 sodiu 12.5 ㎎ / ㎖m 1.5 ML 튜브에 염화물 용액 43 ~ 45). </li><li> 피펫으로 가볍게 섞는다. </li><li> 부드럽게 P200 피펫 팁을 사용하여 드롭 현명한 방식으로 멸균 플라스틱 접시에 혼합물의 200 μl를 피펫. </li><li> 그들은 응고 될 때까지 30 ~ 60 분 동안 37 ° C에서 방울을 품어. 주 : 겔이 고체화 주입 (도 1a) 전에 몇 시간 동안 실온 (25 °의 C)에서 밀봉 된 플라스틱 접시에 유지 될 수있다. </li></ol></li><li> 주입하기 전에 작은 수술 가위를 사용하여 약 3 × 3 × 3mm 큐브에 섬유소 젤 트림. </li></ol> 2. 마우스 준비 <ol><li> 복강에 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 (IP) 주입을 성인 마우스 (8~12주)를 마취와 마우스가 적절하게 마우스의 발가락을 곤란하게하여 마취되어 있는지 확인합니다. <ol><li> 실험 기간 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li></ol></li><li> 애프터 셰 이브 쿵푸마우스의 흉곽의 좌측을 통해 R. </li><li> 마우스의 기관 내 삽관을 수행합니다. </li><li> 삽관에 마우스가 70 °로 각도 서서 스탠드 상단에있는 작은 고무 밴드를 통해 상부 앞니를 후킹하여 위치에 마우스를 잡아 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 무딘 집게를 사용하여 한쪽으로 혀를 집어 넣으. </li><li> 광섬유 구즈넥 현미경 조명의 도움으로 후두를 시각화. </li><li> 기관에 기관 탄성 카테터 (21 G)를 삽입합니다. </li><li> 마우스가 자발적으로 (보통 100 ~ 150 호흡 / 분, 아니 역설적 또는 얕은 호흡) 부드러운 방법으로 호흡 있는지 확인합니다. </li><li> 해부 현미경으로 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다. </li><li> 기계적으로 설치류 인공 호흡기 사용하여 마우스 환기 (150 호흡 / 분, 7 ml에 / 호흡량을 kg). </li><li> 4 번째와 5 번째 늑골 사이 늑간 공간을 찾기 위해 갈비뼈를 계산합니다. </li><li> B 영역에 걸쳐 멸균 필드 만들기Y는 철저하게 알코올과 포비돈 - 요오드로 닦는 것. 무균 수술 드레이프 적절하게 수술 부위를 커버. </li></ol> 3. 마우스 수술 <ol><li> 피부에 0.25 % bupivacaine을 (200 μL)의 지방 주입 후, 해부 가위를 사용하여 늑간 공간을 통해 가로 피부 절개 (약 1cm 길이)합니다. </li><li> 늑간 근육에 0.25 %의 부피 바카 (200 μL)를 주입 한 후, 미세한 작은 가위를 사용하여 4 번째와 5 번째 갈비뼈 사이의 근육 절개를합니다. </li><li> 완전히 왼쪽 폐를 시각화하기 위해 갈비뼈 사이의 해부 견인기를 삽입합니다. <ol><li> 미세 집게를 사용 왼쪽 폐의 중심의 내장 늑막의 작은 지역 (1 × 1mm 광장)를 쳤어요. </li><li> 출혈 및 공기 누출을 완전히 제어 될 때까지 멸균 면봉을 사용하여 영역에 약간 힘을 주어. </li><li> 피브리노겐 / 트롬빈 (피브린 접착제)의 신선한 혼합물 (단계 1.1.2. 20 &amp; #의 소량을 넣어181; P200 피펫 팁을 사용하여 영역에 걸쳐 L). </li></ol></li><li> 조심스럽게 영역 (그림 1b)를 통해 작은 집게를 사용하여 하나 섬유소 젤 (1.2 단계)를 배치합니다. <ol><li> 젤 잘 폐의 호흡 운동시 지역에 고정되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 도 대규모 공기 누출이나 폐에서 출혈이 있는지 확인합니다. </li><li> 이없는 흡수성 봉합사와의 긴밀한 절개 (근육과 피부 층), 제거 할 수 있습니다. </li><li> 기흉을 방지하기 위해 27 G 바늘과 1 ML의 주사기를 사용하여 흉강을 대기음. </li><li> 기계 환기를 종료합니다. </li></ol> 4. 마우스 복구 <ol><li> 마우스가 자발적으로 부드러운 방법 (일반 100 ~ 150 호흡 / 분, 아니 역설적 또는 얕은 호흡)에서 호흡되어 있는지 확인합니다. </li><li> IP는 1 ㎖ 주입 탈수를 방지하기 위해 0.9 %의 NaCl을 미리 예열. </li><li> 마우스가 순환 온수 패드에 복구 할 수 있습니다. </li><li> endotrache 제거마우스가 안정된 호흡을 확인 후 알 튜브. </li><li> 수술후 진통제로서 3 일간, 멜 록시 캄 (5 ㎎ / ㎏, 피하 주사 (SC)를 주입한다. </li><li> 이 (복부에 출시 할 수 똑바로 유지) 흉골과 의식 때까지 조심스럽게 15 분 간격의 최소 마우스의 움직임을 모니터링합니다. </li><li> 복구 후, 수술없이 생쥐에서 분리 된 새로운 케이지에 마우스를 반환합니다. </li><li> 매일 다음과 같은 감염의 징후 (발적, 부종, 방전), 동물의 기본적인 생물학적 기능 (음식과 물을 섭취, 배뇨, 배변, 체중 증가)뿐만 아니라 임상 증상의 고통에 대한 수술 부위 (경직 감소 운동을) 모니터 수술. </li></ol> 5. 수확 폐 <ol><li> 7~30일 주입 후, 압축 가스의 소스를 통해 CO 2를 사용하여 마우스를 안락사. </li><li> xyphoid 과정의 팁과 흉골 사이에 절개를합니다노치 (중간 흉골)와 호흡 관을 절단과 심장, 폐, 기관지에 모든 연결을 해부하여 조직 학적 및 생화학 적 분석을위한 이식 젤 수확 전체 폐. </li><li> 하룻밤의 OCT 화합물에 포함 된 4 ºC에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 폐 이식 젤을 수정, 30 μm의 두께의 직렬 단계 섹션을. </li><li> 조직 학적 (헤 마톡 실린 및 에오신 염색) 및 면역 조직 화학 분석을 수행합니다 (내피 마커 : CD31, 상피 마커 : 아쿠아 포린 (AQP) 5 계면 활성제 단백질 (SP) -B) 공 초점 현미경 22,37,40를 사용하여. </li><li> 3D 이미지 분석 소프트웨어 (37)를 이용하여 폐 내피 세포의 3 차원 영상 및 상피 세포를 형성하는 광학 부 (30 μm의 두께)의 스택을 컴파일한다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어 (46)를 이용하여 새로 형성된 혈관의 투영 면적을 정량화. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 문서에서는 성인 마우스를 삶의 폐 표면에 생체 적합 물질을 이식하는 새로운 방법을 소개합니다. 이 시스템을 호스트 폐 유래 혈관이 성공적으로 재료 내부에 효과적으로 요약된다. 이 시스템은 연구자가 내피 세포 사이의 크로스 토크를 탐색 할 수 있습니다, 다른 세포 (예를 들면, 상피 세포, 중간 엽 세포, 면역 세포) 지역의 혈관 신생 50 ~ 53과 치조골 재생 24,54에 필?...

이 프로토콜의 전반적인 목적은 연구자 폐 혈관 및 폐포 개발의 분자 메커니즘을 특성화 할 수 성인 마우스의 폐 표면 상 피브린 겔을 이식하는 방법을 소개하고, 가능한 생체 모방 물질을 개발하기 위해이 지식을 활용하는 것이다 각종 폐 질환을 치료하는 생리 폐 혈관 및 폐포의 형성을 recapitulating. 35 개 이상의 만 명의 미국인이 만성 폐쇄성 폐 질환과 폐 섬유증을 포함한 만성 폐 질환으로 고통 받고 있습니다. 이 환자는 크게 일상 생활 1-3을 손상 등의 호흡 곤란, 흉부 압박감, 잔소리 기침, 피로 오래 지속되는 만성 호흡기 증상을 가지고있다. 이러한 폐 질환에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 노력의 큰 금액에도 불구하고, 현재 치료법이 없다; 따라서, 이러한 환자의 삶의 질은 가난하고 경제적이며, 인간의 비용은 안녕하다GH 4-7. 현재 폐 이식은 말기 만성 폐 질환을 가진 환자를 저장할 수있는 유일한 방법입니다. 그러나, 이식 기증자, 높은 비용, 심각한 합병증, 낮은 생존율 8-11의 부족, 이식은 최적의 방법이 아닙니다. 조직 공학 기술 최근의 급속한 발전은 전구 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 12,13 다양한 종류의 탈세 포화 전체 폐를 다시 채우기에 의해 이식 폐를 생명 공학자 인 연구자를 가능하게했다. 그러나 이러한 생체 공학 폐는 주입 12,14,15 후 몇 시간 동안 호스트 동물의 기능입니다. 폐의 복잡한 구조 및 기능을 재생시키기 바이오 소재를 활용하여도 상당히 성공적이지 못했다. 성인 폐 재생을 제어하는​​ 키 생물학적 과정이 잘 탐험되지 않은 때문일 수 있습니다. 폐에서 혈관 시스템의 형성은 초기의 가장 중요한 이벤트 중 하나 두리입니다NG 개발 및 재생 16-21. 새롭게 산소 만, 영양분과 기관 형성을 위해 요구되는 다양한 세포 구성 요소를 제공 할뿐만 아니라, 주위의 세포에 유익한 22-25 규제 신호를 제공하지 폐 vasculatures 형성. 따라서, 혈관 신생은 성인 폐 24,26,27 회생 폐포에 중요한 역할을한다. 또한, 규제 완화 된 혈관 형성은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) (28), 기관지 폐 이형성증 21-23, 29 및 폐 섬유증과 같은 만성 폐 질환에 기여한다. 따라서, 폐 엔지니어링 또는 만성 폐 질환을 치료하기위한보다 효율적인 전략을 개발하기 위해서는, 특정의 폐 혈관의 근본적인 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다. 각 기관은 생리적, 병리 적 상태로 30 ~ 33 사이에 다를 수 있습니다 고유의 기계적, 화학적 특성을 표시합니다. 이 기관 고유의 microenviron사항은 내피 세포의 행동을 조절하고 기관 고유의 방식으로 24,34-36 혈관 네트워크 형성을 조율. 따라서, 폐보다 효율적인 재생을위한 전략을 개발, 폐 혈관 관련 기본 메커니즘은 이해되어야한다. 피하 하이드로 겔 주입 등의 생체 기존의 혈관 신생 분석은 혈관 신생 연구 37-39 광범위하게 사용되었지만, 그 방법은 기관 고유의 혈관 신생을 요점을 되풀이하지 않습니다. 최근에 마우스 폐 탄성 금형에 이식 마트 리겔을 신규 한 방법이 개발되고 성공적 겔 (22)에 혈관과 폐 상피 세포를 보충하는 것으로 나타났다. 이 독특한 접근 방식은 연구자가 생리적, 병리 적 상태에서 혈관 및 비 혈관 폐 세포 사이의 폐 특정 혈관 신생의 메커니즘뿐만 아니라 상호 작용을 탐구 할 수 있습니다. 1) 마트 리겔은 임상 적용에 적합하지 않기 때문에; 2) 예를더 임상 적 접근법으로서, 하이드로 겔 및 호스트 폐 조직 및 3) 폐에 탄성 몰드 잠재적 호흡 동안 폐 기능 및 통증 장애 발생 사이의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 겔을 캐스팅하는데 사용 lastic 금형, 3D 피브린 매트릭스가 혈관 신생 인자를 함유하는 (혈관 내피 성장 인자 (VEGF) / 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)) 탄성 몰드에 캐스팅없이 마우스 폐에 주입되었고, 성공적 호스트 폐 유래의 혈관 신생을 효과적으로 요약했다. 피브린 겔, 트롬빈 절단 된 피브리노겐으로부터 생성 중합체는 피 브릴, 트랩 40,41 생체 내에서 혈관 신생을 촉진하는 등의 bFGF와 VEGF의 혈관 신생 인자와 같은 다양한 공지되어있다. 그 때문에 회생 능력과 생분해 자연 42 피브린 겔 널리 조직 공학 분야에서 사용된다. 이 문서에서는 생활 adul의 폐 표면에 섬유소 젤을 이식하는 새롭고 독특한 접근 방식을 소개합니다t 마우스와 호스트 폐 유래 혈관이 생체 내에서 젤 내부에 효과적으로 요약되어 있음을 보여줍니다. 폐 혈관 신생 관련 공부 연구자 있도록 이러한 방법은, 아마도 폐 질환의 다양한 유형에 대한 새로운 치료 방법의 개발로 이어질 상당히 성공적 성인 폐를 재생하는 노력을 진행한다.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

줄기 세포 연구와 생명 공학 기술의 최근 중요한 발전은 재생 및 정형 외과 및 치주 분야에서 간단한 조직에 손상을 복구하는 생체 물질을 활용에 큰 진전을 만들었습니다. 장기 재생의 생물학적 과정을 잘 탐구되지 않은 때문에 구조 및 폐 등과 같은보다 복잡한 3 차원 (3D) 장기의 기능을 재생하려고 시도하는 것은 매우 성공적이지 못 하였다. 이는 혈관 신생은 새로운 혈관의 형성은, 기관 재생에 중요한 역할을한다는 것을 분명 해지고있다. 새로 vasculatures 산소, 영양분 및 장기 재생을 위해 요구되는 다양한 세포 구성 요소를 제공 할뿐만 아니라, 조직 재생에 유익한 로컬 신호를 제공하지 만 형성. 그러므로, 성공적으로 성인의 폐를 재생하기 위해서는 로컬 폐 조직의 재생을 드라이브하는 혈관 신생 폐 특정 미세 환경 요점을 되풀이하는 것이 필요하다. 공동 비록nventional 생체 등의 히드로 겔 (예를 들어, 섬유소 또는 콜라겐 젤 또는 마트 리겔 - Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 세포에 의해 분비 ECM 단백질 혼합물)이 풍부한 세포 외 기질 (ECM)의 피하 주입으로 혈관 신생 분석, 광범위하게 탐구하기 위해 사용된다 폐에 생체 재료의 소성을 주입하는 방법이 잘 확립되지 않았기 때문에 혈관의 일반적인 메커니즘은, 폐 특정 혈관 신생은 잘 특징되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목적은 겔 내부 호스트 폐 유래의 혈관 신생을 성공적 재현부 허용 살아있는 성인 마우스의 폐 표면 상 피브린 겔을 이식하는 독특한 방법을 도입하는 것이다. 이 방법은 폐 별 미세 정상 및 병적 상태 모두에서 혈관 신생과 치조골 재생을 제어하는​​ 메커니즘을 탐구하는 연구자 수 있습니다. 이식 된 생체 재료에 출시 된 이후 인접 리터에 물리적, 화학적 신호를 공급하고웅 조직, 폐 병변 이러한 생체 물질의 주입은 잠재적 폐 질환의 다양한 유형에 대한 새로운 치료 방법을 개발하기 위해 연구를 가능 인접 병든 조직을 정상화 할 수있다.

호스트 폐 유래 혈관 형성은 폐에 주입 된 생체 물질의 내부에 효과적으로 요약되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 피브린 겔 주요 혈관 신생 인자의 VEGF와 bFGF를 보충 (0, 10, 100 ng이다 / mL 씩)로서 살아있는 마우스의 폐 표면 상에 이식 하였다 마트 리겔 (22)를 사용하여보고했다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 이러한 혈관 성장 인자를 포함하는 피브린 겔 (47)을 제작 하?...

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

마우스 폐에 섬유소 젤의 주입은 폐 관련 신생 혈관 연구에

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K 조회수.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

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A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

연구

의학

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

발생학

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

허혈성 쥐 폐의 혈관 신생

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

암 연구학

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

마우스 모델에서 하대 정맥 끼어 이식의 주입

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Bleomycin의 내시경 주입에 의한 마우스 폐 손상의 유도

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

면역학 및 감염병학

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

탈세포화된 마우스 폐와 1차 인간 내피 세포를 이용한 생체공학적 폐 이식

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...

생체공학

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...