Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.

NOTA: Todos los procedimientos de este protocolo han sido aprobados por el Subcomité de Investigación Animal Care, que sirve como el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) para el Hospital General de Massachusetts, y cumplen con los Institutos Nacionales de Salud. 1. Animal Vivienda y Procedimiento para el Manejo <ol><li> A su llegada, la casa del adulto Sprague Dawley hembras de 8-10 semanas de edad (con un peso 200-225 g) en grupos de cubos de plástico 3.4 pulgadas con ropa de cama de viruta de madera. Mantenerlas en una dieta de acceso ad libitum al perro chino y el agua y un 12 horas de luz / oscuridad ciclo. Deja ratas para aclimatarse a las condiciones de vivienda y de los animales instalación por un mínimo de 1 semana. NOTA: Todos los procedimientos de este manuscrito se llevan a cabo durante el ciclo de luz. </li><li> Después de este período de aclimatación, manejar todos los animales durante 5 min cada uno durante 2-3 días. Correctamente recoger el ratas de uno en uno (apoyado por el torso y no por la cola),mantener de forma segura, y acariciarlos durante este tiempo. Manipular los animales que aparecen más estresado, nervioso o ansioso por períodos más largos de tiempo. Haga esto para minimizar el manejo de estrés, lo que podría afectar a los siguientes pasos de este protocolo. NOTA: El número de días y cantidad de la manipulación de los animales pueden variar entre diferentes laboratorios tiempo; sin embargo, éstas deben ser coherentes entre los experimentos dentro del mismo laboratorio. </li></ol> 2. Monitoreo del ciclo estral: torunda vaginal Smearing y Procedimiento de tinción <ol><li> Hacer solución salina al 0,9% (cloruro de sodio disuelto en agua destilada). Humedezca un aplicador con punta de algodón en esta solución. Seque la punta con una toalla de papel para evitar la sobresaturación, que podría conducir a la recogida de muestras inadecuadas o pérdida de células. La celebración de la cola hacia arriba fuera de la abertura vaginal, introduzca suavemente la punta de algodón en el canal vaginal y rodar alrededor de los muros para capturar las células vaginales flojas. </li><li> Si el animal se orina en la camaTip Ton, sustituya por uno nuevo, ya que la contaminación de la orina será más difícil para la identificación de fase. Tenga mucho cuidado de no causar trastornos a los animales durante este procedimiento debido a la exposición al estrés interrumpirá el ciclo estral. Cuando limpiando, el objetivo de lograr una inserción rápida y retirada que no es demasiado profunda como para minimizar la estimulación extra para el cuello del útero, lo que puede inducir pseudopreñez. NOTA: pseudopreñez puede ser identificado como un ciclo estral acíclico que típicamente dura alrededor de 12 días, es decir, días consecutivos de 25 diestro. </li><li> Retire con cuidado la punta del aplicador y rodar en un portaobjetos de microscopio pre-etiquetados. Evite presionarlos demasiado duro como demasiado líquido en el portaobjetos puede hacer la identificación de fase difícil una vez seco. NOTA: Una diapositiva puede contener varios días para cada animal, aunque esto se puede hacer de acuerdo a las preferencias individuales. </li><li> Asegúrese de que las transferencias de la muestra en el portaobjetos. Recoger muestras para cortarcol días consecutivos en una diapositiva para poder efectuar un mejor seguimiento e identificar diarias fases de estro cambios. NOTA: Si es posible, también es ideal si las personas que recolectan muestras siguen siendo los mismos para todos los animales. </li><li> Una vez que la diapositiva es seca, comenzar el protocolo de tinción para la identificación de fase. Usando el kit de tinción (véase la Tabla de Materiales), sumerja las diapositivas de 10 veces en el fijador (azul claro), 10 veces en solución de tinción (rosa), y 5 veces en solución de contraste (púrpura). Enjuague desliza suavemente con agua corriente. Deje que se desliza completamente seco aire antes de ver bajo el microscopio. NOTA: El ciclo estral largo típicamente 4-5 días consta de (en este orden): estro (E), metaestro (M), el diestro (D), y el proestro (P) 26. El estro se caracteriza por azules, células cornificadas, metaestro por los leucocitos y una combinación de células cornificadas y nucleadas, diestro es similar a metaestro en presencia de tipos de células excepto que son muy escasos, y proestro por agregados-púrpura manchadocélulas nucleadas de (Figura 1). Hay varios procedimientos de tinción, además de los descritos anteriormente, que son igualmente eficaces para la citología de frotis vaginal. </li><li> Recoger muestras durante al menos dos ciclos completos (~ 8-10 días) con el fin de controlar las fases con precisión antes de la experimentación. Sea consistente con la hora del día se toman las muestras. Recoger muestras de frotis vaginales a diario durante todo y hasta el final del experimento. </li></ol> 3. Pre-exposición <ol><li> Antes de la iniciación del experimento, pre-exponer a los animales a la acondicionado cámaras permiten que los animales se aclimaten al contexto (cámaras de acondicionamiento) antes de cualquier prueba de comportamiento. <ol><li> Pre-exponer las hembras a las cámaras de acondicionamiento (ubicados en cajas que atenúan el sonido) con las luces de la casa por 20 a 30 minutos por día durante 3 días antes de cualquier experimentación. Asignar la caja que son pre-expuesto a como su cámara para el estudio. Limpiar a fondo tél cajas (paredes y bandejas) entre las sesiones y los animales para eliminar los olores, ya que pueden afectar el comportamiento y el ciclo estral. </li></ol></li></ol> 4. Día 1: La habituación / temor acondicionado <ol><li> Una vez que los animales han sido verificados para estar en la fase de estro de sus ciclos de celo, comenzará la fase de habituación / acondicionado del experimento de 3 días. <ol><li> Tome tono previo medidas basales de congelación antes del primer tono de estímulo condicionado (EC) presentaciones en cada día del experimento. Para ello, la adquisición de calificaciones por ciento de congelación (calculados dividiendo los segundos empleados inmóvil por la duración del juicio, multiplicado por 100) durante el intervalo de tiempo de estímulo ausente al comienzo de la primera prueba CS-alone antes de la aparición CS. NOTA: Estas medidas pueden utilizarse para evaluar y comparar los niveles de congelación de línea de base con los que durante la habituación, condicionamiento, la extinción, y el recuerdo. </li><li> Para llevar a cabo la extinción de formación durante la fase metaestro,condicionar las ratas en su último día del estro. Fase Swab e identificar estral (paso 2) todos los días antes de iniciar el protocolo experimental (acondicionado / extinción / recuperación). A medida que la fase de estro puede durar más de un día, el uso de la historia del ciclo para predecir la duración de las fases para determinar cuando los animales están listos para comenzar el entrenamiento. </li></ol></li><li> En las cámaras de acondicionamiento, conecte el suelo de rejilla pies choque a un generador de estimulación eléctrica. Utilice un nivel de estimulación de 0.5-0.6 mA como el estímulo incondicionado (EI). Use un 4 kHz, el tono de 80 dB como el estímulo condicionado (CS). NOTA: Estos parámetros pueden variar a través de laboratorios y puede ser modificado para el acondicionamiento óptimo. <ol><li> Si el programa de análisis de congelación requiere señales visuales (en oposición a temporal), co-activar una luz LED con el tono. Coloque la luz en el exterior de la cámara operante, dentro de la trama de vídeo. Al inicio de cada ensayo, activar la luz LED y mantenerlo iluminado hasta el final del XIXjuicio e. NOTA: Esta luz no es visible por el animal y sólo sirve como un marcador para el inicio y final de la prueba dentro de los archivos de vídeo grabados (para ser usado para medir el comportamiento de congelación). </li></ol></li><li> Coloque los animales en las cámaras de acondicionamiento para 5 ensayos CS-alone de habituación. Inmediatamente después de la sesión de habituación, realizar 7 pares de ensayos CS-estadounidenses de condicionamiento del miedo. Asegúrese de que el tono de CS tiene una duración de 30 segundos y coterminates con el 0,5 seg choque de Estados Unidos. Efectuar ensayos clínicos en todas las sesiones (habituación, condicionamiento, la extinción, y recuperación) con un intervalo entre ensayos variable de una mediana de 3 minutos. </li><li> Al final de la sesión de acondicionamiento, devolver los animales a sus jaulas y para la instalación de los animales hasta el día siguiente. </li></ol> 5. Día 2: Preparación Estradiol <ol><li> Swab e identificar la fase de estro de todos los animales que se sometieron a día 1 de este protocolo. Preparar estradiol (también conocida como E2, 17beta-estradiol, obeta-estradiol) para una dosis de 15 mg / kg inyección subcutánea utilizando aceite de sésamo o 0,9% de solución salina como vehículo. </li><li> Para calcular la cantidad de estradiol para prepararse para las inyecciones, utilice los pesos corporales de todos los animales, los cuales fueron medidos y registrados cuando se acondicionaron en el día 1 de este protocolo. </li><li> Realizar cálculos para estandarizar el volumen administrado de estradiol (es decir, 0,2 ml) por rata. Dado que el estradiol es difícil de disolver debido a su insolubilidad en agua y requiere un gran volumen de disolvente para la dosis pequeña, preparar una solución de stock de mezcla de estradiol en aceite de sésamo a fuego hasta que se disuelva. La solución puede entonces hacerse pasar a través de un filtro de 0,22 micras para eliminar los contaminantes. Por ejemplo, añadir un volumen calculado de a / 1 ml solución de aceite de sésamo stock 3,000 g estradiol total el volumen necesario de aceite de sésamo con el fin de lograr un / kg dosis 15 mg en un volumen de 0,2 ml por inyección por animal. NOTA: Como alternativa, utilice otras formas de Tha estrógeno<html> t son solubles en agua y más fácil de disolver. </li></ol> 6. Día 2: Administración Estradiol / Formación Extinción <ol><li> Administrar la vía subcutánea estradiol. Levante la piel suelta entre la escápula por el cuello en un sujetador suave e inserte la aguja de la jeringa en el triángulo que se forma por los pliegues de la piel. </li><li> 30 minutos después de las inyecciones subcutáneas de estradiol, colocan a los animales en las cámaras de acondicionamiento de nuevo y comienzan entrenamiento de extinción. En esta sesión de extinción, realizar 20 ensayos CS-solamente, con cada ensayo que consiste en un 30 seg, 4 kHz, el tono de 80 dB, presentado en un intervalo entre la variable promedio de 3 min. NOTA: El efecto de estradiol en el recuerdo se produce cuando estradiol se administra antes de la extinción de formación o inmediatamente después de la extinción. El efecto no se observa 4 horas después de la extinción, por lo que se recomienda inyectar cerca en el tiempo al principio o al final de la sesión de entrenamiento de 15. </li></ol>. le &quot;&gt; 7 Día 3: Extinction Recall <ol><li> 24 horas después de la extinción de formación, talle los animales que completaron el día 1 y 2 de este protocolo. </li><li> Coloque los animales en sus cámaras de acondicionamiento asignados (igual que el día 1 y 2). Comienza la sesión de recuerdo de la extinción mediante la presentación de 3 ensayos CS-solos (los tres ensayos de recuerdo de la extinción), que consta de sólo 3,80 dB ensayos CS-solas con intervalos entre ensayos similares a los 20 ensayos administrados para entrenamiento de extinción como se describe en el paso 6.2. </li><li> Al término de la sesión de recuperación, devolver los animales a sus jaulas. </li></ol> Análisis 8. Datos <ol><li> Adquirir datos de comportamiento a través de video y analizarlos utilizando los programas informáticos. NOTA: Congelación puntuaciones también pueden ser contados manualmente por un experimentador que está ciego para el tratamiento de drogas cronometrando episodios de congelación durante la presentación CS de cada ensayo, expresada como porcentaje del tiempo dedicado a la congelación durante el tono. La congelación esdefinido por completo la falta de movimiento con la excepción de la respiración durante los 30 ensayos seg CS-estadounidenses. Calcular ciento congelación dividiendo los segundos empleados congelación (inmóvil) por 30 segundos (la duración de la prueba), multiplicado por 100. </li></ol>

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Los autores de este manuscrito no tienen que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses a revelar.

Extinción miedo ha sido ampliamente estudiado en ratas macho con los mecanismos neurales que median condicionado extinción miedo identificado y evaluado bajo diversas manipulaciones. Relativamente pocos estudios han examinado las ratas hembras o el papel de las hormonas gonadales en el miedo extinción. Para estudiar específicamente los efectos del estrógeno en el miedo extinción, que completan un ciclo natural ratas hembras son sometidos a un paradigma de comportamiento de tres días. Este procedimiento consiste e...

Diferencias sexuales inherentes se observan a través de diversos comportamientos cognitivos y paradigmas de aprendizaje tanto en humanos y roedores. Por ejemplo, se ha informado de que las mujeres tienen en general las habilidades verbales y orientado a los detalles más fuertes, mientras que los hombres tienen mejores habilidades espaciales 1-3. Estas diferencias sexuales pueden deberse en parte a la influencia de las hormonas gonadales. Los niveles altos de estradiol mejorar el rendimiento en las tareas en las que las mujeres son mejores, pero empeoran el rendimiento en tareas que los hombres por lo general hacen bien 4-6. Aunque esta evidencia es convincente, la capacidad limitada para controlar completamente entornos experimentales en estudios humanos hace que sea difícil determinar si estos efectos en el comportamiento pueden ser atribuidos específicamente a las hormonas. Los estudios en animales, en cambio, permiten circunstancias totalmente controladas. Aunque los mecanismos neurales básicos del miedo extinción han sido identificados y se ha estudiado bien en los machos, no está claro siestos sistemas son los mismos en las hembras o cómo cambian a través del ciclo estral. Condicionamiento del miedo y la extinción son ampliamente utilizados paradigmas conductuales en roedores y humanos para llevar a cabo estudios relacionados con los trastornos de ansiedad. Dado que las mujeres tienen un mayor riesgo de trastornos de ansiedad, así como una mayor duración de los síntomas y la gravedad 7-13, es fundamental para incluir mujeres en estos estudios. La escasa representación de las mujeres en esta investigación se puede atribuir a los desafíos de monitoreo fase estral y contabilización de los efectos en el comportamiento de las hormonas sexuales. Los laboratorios que hacen examinar las hembras en este sentido cuestiones encuentro que muchas veces no se denuncian ni se describen en los métodos para sus estudios. Nuevas pruebas en roedores sugiere que las diferencias sexuales en el miedo extinción son moduladas por las hormonas gonadales 14-18. En el condicionamiento del miedo, los animales son entrenados para temer un estímulo particular. Después de una serie de presentaciones no reforzadas deel estímulo, los animales aprenden a no temer el momento justo, un proceso llamado extinción. ¿Qué tan bien el animal aprende y refuerza la memoria de aprendizaje de esta tarea se puede observar durante una prueba de recuerdo de la extinción dado algún tiempo después del entrenamiento de extinción. Menos expresión miedo durante la llamada de extinción demuestra una buena consolidación de la memoria extinción. Los resultados recientes de nuestro laboratorio sugieren que los estrógenos pueden modular la consolidación de la memoria de extinción miedo y mejorar recuerdo de la extinción. En concreto, las ratas hembras que se extinguen en proestro, la fase del ciclo estral durante el cual circula máximo los niveles de estrógeno, exhibir una mayor retención de la memoria de extinción. Por el contrario, las mujeres que se extinguen en la pantalla fase metaestro bajo estrógeno relativamente pobre recuerdo de la extinción, que se pueden mejorar con la administración de estradiol exógeno antes o inmediatamente después de la extinción de formación 15,16. Los mecanismos neurales de la consolidación de la memoria de extinción (including el papel de las hormonas gonadales) en las mujeres no están claras. En animales de laboratorio, el papel de las hormonas puede ser investigada usando procedimientos de eliminación quirúrgicos invasivos tales como la castración y la ovariectomía. Después de la recuperación de la cirugía, las hormonas gonadales a menudo son manipulados de forma exógena durante la realización de una tarea de comportamiento 19. Este enfoque ha proporcionado información crítica acerca de las hormonas sexuales y es útil porque permite manipulaciones bien controlados de hormonas gonadales (en términos de tiempo y de la dosis) 20-23. Este enfoque, sin embargo, no evaluar la influencia de las fluctuaciones de origen natural que se producen en todo el ciclo estral ni representan animales &quot;normales&quot;, limitando así el potencial de traslación a los estudios humanos. Ha sido bien documentado que los niveles de hormona sexual femenina pico y el declive en fases específicas del ciclo estral, y cambios en la expresión del receptor de estrógeno dentro del ciclo,y 24 después de la ovariectomía. Por lo tanto, existe la necesidad de llevar a cabo estudios sobre las hembras con gónadas intactas y perfeccionar los diseños experimentales para estudiar de forma fiable los efectos de que los estados de alta y baja de estrógeno pueden tener sobre las mujeres a lo largo de su vida útil. Este protocolo se centra en el efecto de los estrógenos sobre los sistemas neurobiológicos implicados en el miedo extinción. En él se describe cómo: 1) controlar cuidadosamente el ciclo estral, 2) preparar las dosis efectivas de estradiol para la administración sistémica, y 3) siguen un paradigma de comportamiento que incluye el condicionamiento del miedo, la extinción, y recordar en el ciclismo de forma natural las ratas hembras. Este protocolo se puede modificar con otras manipulaciones farmacológicas y herramientas celulares y moleculares para ayudar a estudios para comprender mejor las diferencias de sexo que se observan en el comportamiento condicionado temer la extinción. Tenga en cuenta que los procedimientos descritos a continuación son los utilizados dentro de nuestro laboratorio, y existen un número de variaciones de estos procedimientos in la literatura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="613">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog number</td>
			<td style="width:199px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Fear conditioning chamber</td>
			<td style="width:159px;">Coulbourn Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Graphic State</td>
			<td style="width:159px;">Coulbourn Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Sound-attenuating box</td>
			<td style="width:159px;">Med Associates, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">NIR-022MD</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Estradiol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E1024</td>
			<td style="width:199px;">In sesame oil for subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Sesame oil</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S3547-250ML</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Freezescan</td>
			<td style="width:159px;">Cleversys, Inc.</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Dip quick stain</td>
			<td style="width:159px;">Jorgensen Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">J0322A1, J0322A2, J0322A3</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">23-400-114</td>
			<td style="width:199px;">6-inch, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">0.9% saline</td>
			<td style="width:159px;">LabChem, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">LC23460-2</td>
			<td style="width:199px;">Sodium chloride w/v</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Selectfrost microscope slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-550-003</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Virex II 256</td>
			<td style="width:159px;">Diversey, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">5019317</td>
			<td style="width:199px;">Dilute 1:256 with water</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Luer-Lok Tip 1ml Syringes</td>
			<td style="width:159px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:135px;">309628</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:120px;">Hypodermic disposable needles</td>
			<td style="width:159px;">Exelint International, Co.</td>
			<td style="width:135px;">26402</td>
			<td style="width:199px;">26-gauge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats

La extinción del miedo condicionado se ha estudiado extensamente en roedores machos. Recientemente, ha habido un creciente número de estudios que indican que los mecanismos neuronales para ciertas tareas de comportamiento y conductas de respuesta son diferentes en mujeres y hombres. Usando a las mujeres en los estudios de investigación puede representar un desafío debido a la variación de las hormonas gonadales durante su ciclo estral. Este protocolo describe procedimientos bien establecidos que son útiles en la investigación del papel de los estrógenos en el miedo consolidación de la memoria extinción en ratas hembras. Fase del ciclo estral y la administración exógena de estrógenos antes de la extinción de formación puede influir en recuerdo de la extinción 24 horas más tarde. La técnica de hisopado vaginal para la identificación de fase estral descrito aquí ayuda al examen y manipulación de ciclismo naturalmente las hormonas gonadales. El uso de este modelo básico de roedores pueden definir con mayor precisión los mecanismos por los que los estrógenos pueden modular la memoria de extinción miedo enhembras.

En este protocolo de recordatorio miedo extinción, por ciento de congelación se midió como un indicador de miedo. Los animales que se extinguen bien y conservan el recuerdo de la extinción de formación exhibieron bajo el miedo en el último día de la prueba de comportamiento durante la llamada de extinción. Las ratas macho y hembra no difieren significativamente en la expresión condicionada miedo durante el condicionamiento, la extinción, y recuerdan fases (Figura 2). Sin embargo, una diferenci...

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Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Protocolo para el Estudio de la extinción del miedo condicionado en ratas hembras Naturalmente Ciclismo

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

protocol-for-studying-extinction-conditioned-fear-naturally-cycling

Research

JoVE Journal

Behavior

13.1K vistas.  Massachusetts General Hospital. Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Video: Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Investigación

Comportamiento

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during abstinence. Moreover, various environmental challenges can exacerbate this effect, as well as increase ongoing drug intake.
The procedure we describe here highlights the impact of a common environmental challenge, food restriction, on drug craving that is expressed as an augmentation of drug seeking in abstinent rats.
Rats are implanted with chronic intravenous i.v. catheters, and then trained to press a lever for i.v. heroin over a period of 10-12 days. Following the heroin self-administration phase the rats are removed from the operant conditioning chambers and housed in the animal care facility for a period of at least 14 days. While one group is maintained under unrestricted access to food (sated group), a second group (FDR group) is exposed to a mild food restriction regimen that results in their body weights maintained at 90% of their nonrestricted body weight. On day 14 of food restriction the rats are transferred back to the drug-training environment, and a drug-seeking test is run under extinction conditions (i.e.&#160;lever presses do not result in heroin delivery).
The procedure presented here results in a highly robust augmentation of heroin seeking on test day in the food restricted rats. In addition, compared to the acute food deprivation manipulations we have used before, the current procedure is a more clinically relevant model for the impact of caloric restriction on drug seeking. Moreover, it might be closer to the human condition as the rats are not required to go through an extinction-training phase before the drug-seeking test, which is an integral component of the popular reinstatement procedure.

A procedure that allows a demonstration of robust augmentation of drug seeking in food-restricted rats is described. Following heroin self-administration training, rats go through an abstinence period, in a drug-free environment, during which they are mildly food restricted. Drug seeking is then tested in the drug-associated environment.

Un procedimiento para estudiar el efecto de la prolongada restricción de alimentos en heroína Buscando en ratas abstinentes

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association between environmental cues and aversive experiences. In this test, mice are placed into a conditioning chamber and are given parings of a conditioned stimulus (an auditory cue) and an aversive unconditioned stimulus (an electric footshock). After a delay time, the mice are exposed to the same conditioning chamber and a differently shaped chamber with presentation of the auditory cue. Freezing behavior during the test is measured as an index of fear memory. To analyze the behavior automatically, we have developed a video analyzing system using the ImageFZ application software program, which is available as a free download at http://www.mouse-phenotype.org/. Here, to show the details of our protocol, we demonstrate our procedure for the contextual and cued fear conditioning test in C57BL/6J mice using the ImageFZ system. In addition, we validated our protocol and the video analyzing system performance by comparing freezing time measured by the ImageFZ system or a photobeam-based computer measurement system with that scored by a human observer. As shown in our representative results, the data obtained by ImageFZ were similar to those analyzed by a human observer, indicating that the behavioral analysis using the ImageFZ system is highly reliable. The present movie article provides detailed information regarding the test procedures and will promote understanding of the experimental situation.

This article presents a protocol for a contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system to assess fear learning and memory in mice.

Contextuales y complementada el condicionamiento del miedo de prueba utilizando un sistema de análisis de vídeo en ratones

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Trace Fear Conditioning in Mice

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings between a neutral stimulus and an unconditioned stimulus. There is a 20 sec trace period that separates each conditioning trial. On the following day freezing is measured during presentation of the conditioned stimulus (CS) and trace period. On the third day there is an 8 min test to measure contextual memory. The representative results are from mice that were presented with the aversive unconditioned stimulus (shock) compared to mice that received the tone presentations without the unconditioned stimulus. Trace fear conditioning has been successfully used to detect subtle learning and memory deficits and enhancements in mice that are not found with other fear conditioning methods. This type of fear conditioning is believed to be dependent upon connections between the medial prefrontal cortex and the hippocampus. One current controversy is whether this method is believed to be amygdala-independent. Therefore, other fear conditioning testing is needed to examine amygdala-dependent learning and memory effects, such as through the delay fear conditioning.

In the following experiment we describe a protocol for trace fear conditioning in mice. This type of associative memory includes a trace period that separates the neutral stimulus and the unconditioned stimulus.

Traza el condicionamiento del miedo en ratones

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate drug-seeking behavior and prompt relapse in abstinent drug users. We have developed a procedure to study the behavioral and neural processes that mediate the impact of context on alcohol-seeking behavior in rats. Following acclimation to the taste and pharmacological effects of 15% ethanol in the home cage, male Long-Evans rats receive Pavlovian discrimination training (PDT) in conditioning chambers. In each daily (Mon-Fri) PDT session, 16 trials each of two different 10 sec auditory conditioned stimuli occur. During one stimulus, the CS+, 0.2 ml of 15% ethanol is delivered into a fluid port for oral consumption. The second stimulus, the CS-, is not paired with ethanol. Across sessions, entries into the fluid port during the CS+ increase, whereas entries during the CS- stabilize at a lower level, indicating that a predictive association between the CS+ and ethanol is acquired. During PDT each chamber is equipped with a specific configuration of visual, olfactory and tactile contextual stimuli. Following PDT, extinction training is conducted in the same chamber that is now equipped with a different configuration of contextual stimuli. The CS+ and CS- are presented as before, but ethanol is withheld, which causes a gradual decline in port entries during the CS+. At test, rats are placed back into the PDT context and presented with the CS+ and CS- as before, but without ethanol. This manipulation triggers a robust and selective increase in the number of port entries made during the alcohol predictive CS+, with no change in responding during the CS-. This effect, referred to as context-induced renewal, illustrates the powerful capacity of contexts associated with alcohol consumption to stimulate alcohol-seeking behavior in response to Pavlovian alcohol cues.

A procedure to study the capacity of an alcohol associated environmental context to trigger the renewal of alcohol-seeking behavior in rats is described.

Un procedimiento para observar inducida Contexto-Renovación-pavloviano acondicionado Alcohol comportamiento de búsqueda en ratas

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

A Treatment Package without Escape Extinction to Address Food Selectivity

Feeding difficulties and feeding disorders are a commonly occurring problem for young children, particularly children with developmental delays including autism. Behavior analytic interventions for the treatment of feeding difficulties oftentimes include escape extinction as a primary component of treatment. The use of escape extinction, while effective, may be problematic as it is also associated with the emergence of challenging behavior (e.g., extinction burst). Such challenging behavior may be an acceptable side effect in treatment cases where feeding problems are severe and chronic (e.g., failure to thrive). However, in more acute cases (e.g., selective eating), the negative side effect may be unwarranted and undesired. More recent research on the behavioral treatment of food selectivity has begun to evaluate treatments for feeding difficulties that do not include escape extinction (e.g., demand fading, behavioral momentum), with some success. However, research to date reveals individual differences in responsiveness to such treatments and no clear preferable treatment has emerged. This manuscript describes a multi-component treatment package that includes shaping, sequential presentation and simultaneous presentation, for the treatment of food selectivity in four young children with developmental delays. This treatment package extends the literature on the behavioral treatment for food selectivity and offers a multi-component treatment protocol that may be clinically applicable across a range of treatment scenarios and settings.

Feeding difficulties are a common problem for children with developmental disorders, including autism, and behavioral interventions often include escape extinction. Recent research has begun to evaluate treatments that do not include escape extinction. This manuscript describes a multicomponent treatment package that does not use escape extinction to treat feeding difficulties.

Un paquete de tratamiento sin Extinción Escape para Dirección de Alimentos Selectividad

Feeding difficulties and feeding disorders are a commonly occurring problem for young children, particularly children with developmental delays including ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

La estimulación del nervio vago como una herramienta para inducir plasticidad en vías pertinentes para el Aprendizaje Extinción

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the attribution of incentive salience, or the transformation of neutral stimuli into attractive, &#34;wanted&#39; stimuli capable of motivating behavior. Pavlovian conditioned approach (PCA) develops after the response-independent presentation of a conditioned stimulus (CS; e.g., a lever) that predicts the delivery of an unconditioned stimulus (US; e.g., a food pellet) and can be used to measure incentive salience. During training, three patterns of conditioned responses (CRs) can develop: sign-tracking behavior (CS-directed CR), goal-tracking behavior (US-directed CR), and an intermediate response (both CRs). Sign-trackers attribute incentive salience to reward-related cues and are more vulnerable to cue-induced reinstatement of drug-seeking as well as other addiction-related behaviors, making PCA a potentially valuable procedure for studying addiction vulnerability. Here, we describe materials and methods used to elicit PCA behavior from rats as well as analyze and interpret PCA behavior in individual experiments.

Here, we present a protocol to elicit Pavlovian conditioned approach behavior in rats. This procedure can be used to measure individual differences in the tendency to approach and attribute incentive salience to reward-related cues and investigate addiction vulnerability.

Pavloviano Formación Enfoque acondicionado en ratas

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Stress-Enhanced Fear Learning, a Robust Rodent Model of Post-Traumatic Stress Disorder

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders such as post-traumatic stress disorder (PTSD). To understand the biological mechanisms of fear dysregulation in PTSD, it is important to start with a valid animal model of the disorder. This protocol describes the methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of PTSD, in both rats and mice. SEFL was developed to recapitulate critical aspects of PTSD, including long-term sensitization of fear learning caused by an acute stressor. SEFL uses aspects of Pavlovian fear conditioning but produces a distinct and robust sensitized fear response far greater than normal conditional fear responses. The trauma procedure involves placing a rodent in a conditioning chamber and administering 15 unsignaled shocks randomly distributed over 90 minutes (for rat experiments; for mouse experiments, 10 unsignaled shocks randomly distributed over 60 minutes are used). On day 2, rodents are placed in a novel conditioning context where they receive a single shock; then, on day 3 they are placed back in the same context as on day 2 and tested for changes in freezing levels. Rodents that previously received the trauma display enhanced levels of freezing on the test day compared to those that received no shocks on the first day. Thus, with this model, a single highly stressful experience (the trauma) produces extreme fear of the stimuli associated with the traumatic event.

Here we describe the detailed methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of post-traumatic stress disorder, in both rats and mice. The model utilizes aspects of Pavlovian fear conditioning and freezing as an index of enhanced fear in rodents.

Miedo estrés mayor aprendizaje, un modelo de roedor robusto del trastorno por estrés postraumático

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders ...

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed incubation of drug craving. Here, we describe a morphine conditioned place preference (CPP) protocol for measuring the incubation of craving in rats. In this protocol, a CPP paradigm mainly employing somatosensory cues is used to establish a long-term reward memory of morphine. A three-chamber CPP box that differs in the texture of the chamber floor is constructed. First, the animals are tested for their baseline preference to the two side chambers for three consecutive days. Then, they are injected intraperitoneally with morphine/saline and put into their non-preferred/preferred chamber for 45 min. After 6 days of conditioning, their preference to the side chambers is tested for 15 min at different time points after the last conditioning session. With this paradigm, the reward memory of morphine could last for at least 18 days. To test whether the above-mentioned protocol can model increased craving, the number of entrances into the two side chambers are counted during the abstinence period. The results show that the entrances increased, suggesting that the CPP paradigm could mimic the incubation of craving. Future studies can employ this model to study neural mechanisms underlying long-term memory and incubation of craving.

Here, a morphine conditioned place preference (CPP) protocol is described to measure incubation of craving in rats.

Un protocolo de preferencia de lugar condicionada para medir la incubación de antojo en ratas

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...