This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and by the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750, L40 AR057721 and 2R01NS047727).

NOTA: Los protocolos para la recolección de tejido humano deben ser revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional IRB. Colección de descartados, el tejido humano de-identificado ha sido aprobado por los Comités IRB Hospital Brigham y Hospital de la Mujer y la Infancia de Boston. Los métodos descritos a continuación se han aplicado para el aislamiento de células miogénicas de desidentificados, descartado tejido. Los métodos descritos son aplicables a tejido recogido a partir de material paciente consentido. Aislamiento 1. celular <ol><li> La disociación de la biopsia muscular y la purificación de células miogénicas <ol><li> Pre-pesar una placa de cultivo tisular de 10 cm en una campana de bioseguridad de cultivo de tejidos, y luego volver a pesar el plato que contiene la biopsia muscular para calcular la cantidad de tejido que se ha disociado. </li><li> Utilizando escalpelos estériles, tejido muscular mince finamente y añadir unas gotas de estéril 1x HBSS para evitar que el tejido se seque. </li><li> Añadir 3,5 ml cada una de dispase II y colagenasa D por gramo de tejido muscular para ser digeridos. Pipetear la solución de enzima de tejidos y picada a través de una pipeta de 25 ml estéril unas cuantas veces. Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C con 5% de CO2 durante 15 min y digerir el tejido hasta que la suspensión pasa fácilmente a través de una pipeta estéril ml 5. NOTA: la disociación del tejido se consigue normalmente por digestión enzimática dentro de 45 a 90 min. Por favor, consulte la sección &quot;Los resultados representativos &#39;para obtener más detalles. </li><li> Añadir 2 volúmenes de medio de crecimiento estéril al tejido disociado, filtro a través de un filtro de 100 micras celular más de un 50 ml de pellets de células tubulares y cónicos durante 10 min a 329 xg (~ 1100 rpm), la temperatura ambiente. Por favor consulte la Tabla de Materiales para la composición de los medios de comunicación. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 volumen de medio de crecimiento estéril y añadir 7 volúmenes de solución de lisis de glóbulos rojos. Filtrar la solución a través de un filtro de células de 40 micras, entonces sedimentar tél las células durante 10 min a 329 xg, a temperatura ambiente. </li><li> Contar las células en un hemocitómetro y resuspender las células en 1x HBSS 0,5% de BSA a una concentración de 1 x 10 6 células / 100 mL. Aparte ~ 250.000 células en un único tubo que se utilizarán como control negativo (sin teñir). Conjunto de tubos de lado adicionales de un solo color manchados de control para yoduro de propidio y para CD56, que son necesarios para la selección adecuada de las células CD56 positivas por FACS clasificación. Por favor refiérase a los teléfonos manuales de clasificación o consultar con clasificación FACS expertos instalaciones fundamental de asegurar controles adecuados se incluyen. </li><li> Teñir las células para ser ordenados con 5μl / 10 6 células de anticuerpo anti CD56. Incubar todas las muestras (incluyendo los controles) en hielo durante 30 min. </li><li> Lávese las muestras en 10 ml 1x HBSS y células de pellets durante 10 minutos a 329 xg (~ 1100 rpm) en una centrífuga refrigerada, 4 ° C de temperatura. </li><li> Añadir yoduro de propidio a una concentración final de 1μg / ml de la muestra a ser sorted para la exclusión de las células muertas. Purificar células positivas CD56 a partir de células miogénicas no miogénicas utilizando el clasificador de células activadas por fluorescencia. </li></ol></li><li> La disociación de biopsia de piel NOTA: Dérmica fibroblastos se pueden aislar de un punzón de piel de pacientes cuando las biopsias musculares no están disponibles. Fibroblastos dérmicos se pueden utilizar como biomaterial para muchos estudios, incluyendo la transducción con MyoD para generar células miogénicas. Además, los fibroblastos dérmicos se pueden utilizar para generar células iPS, que pueden diferenciarse en diversos tipos de células para el estudio adicional. <ol><li> Transporte la biopsia de piel para el laboratorio en un medio de transporte. Una vez que se recibe la muestra, realice el cultivo primario tan pronto como sea posible. Si el cultivo primario no se puede establecer en el mismo día, almacenar la muestra a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Transferir la biopsia de piel para un 35 mm placa de Petri estéril en la campana de flujo laminar. </li><li> Enjuague la biopsia de la piel en una placa de Petri estéril con 1x PBS para eliminar la sangre y los residuos. Retire el tejido adiposo con un bisturí estéril. </li><li> Añadir solución de colagenasa 2 ml y picar el tejido con el escalpelo, se incuba a 37 ° C durante 45 min a 1 hr, dependiendo del tamaño del tejido. </li><li> Transferir el tejido digerido a un tubo cónico de 15 ml, lavar la placa de Petri con 2 ml de medio de cultivo de fibroblastos dos veces, y recoger el medio en el mismo tubo. </li><li> Sedimentar las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 3 ml de medio de fibroblastos para eliminar la colagenasa, a continuación, las células de pellets de nuevo. Por favor consulte la Tabla de Materiales para la composición de los medios de comunicación. </li><li> Repita el paso 1.2.7 una vez más. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en las células de fibroblastos y medianas placa 5 ml en un matraz de cultivo de tejido T25 estéril. Incubar el matraz a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Evaluar la cultura de unión de los fibroblastos y el crecimiento en los próximos 1-3 días. &lt;br /&gt; Nota: Algunas piezas de tejido pequeños también podrán unir a la placa y los fibroblastos migran fuera de estas piezas de tejido. </li><li> Mantener el cultivo bajo las mismas condiciones hasta que los fibroblastos se cultivan a aproximadamente 80% de confluencia. </li><li> Recoge los fibroblastos por tripsinización y transferir a frascos de cultivo frescos para la expansión adicional. Realizar tripsinización por lavado de las culturas 3 veces en 1x PBS libre de Ca ++ y Mg ++. Añadir Tripsina-EDTA (ver Materiales Tabla) a las células (2 ml del matraz / T25) durante 2 min a 37 ° C. </li><li> Dividir células desprendidas en frascos adicionales. Si algunas piezas de tejido de permanecer unidos a los matraces T25 originales, añadir 5 ml de medio de cultivo fresco a este frasco y más fibroblastos migran a cabo continuamente. NOTA: El cultivo de fibroblastos expandido se puede congelar abajo como P1 y se almacena en nitrógeno líquido para futuros experimentos. </li></ol></li></ol> 2. La inmortalización de células miogénicas <ol><li&gt; células de la placa de 5 millones de Phoenix Ecotropic de embalaje (PE) durante la noche en una placa de cultivo tisular de 10 cm en DMEM estéril y Medio 199 en una proporción de 4: 1, suplementado con suero de ternera al 10%. </li><li> Células de alimentación 30 min antes de la transfección con 5 ml de medio fresco suplementado con 10 mM de cafeína. </li><li> Homogeneizar una mezcla de 2 g de ADN plasmídico a partir de una preparación midi (CDK4 o hTERT plásmido) y polyjet e incubar a temperatura ambiente durante 15 min, según lo recomendado por el fabricante. </li><li> Añadir la mezcla de plásmido / polyjet a las células PE durante la noche. </li><li> Células de alimentación con medio fresco (DMEM y medio 199 en una proporción de 4: 1, suplementado con suero de ternera al 10%). Doce horas más tarde, recoger el sobrenadante que contiene el virus y filtrar a través de un filtro de tamaño de poro 0,45 micras. </li><li> Usar 1 ml de sobrenadante recogido durante la noche para infectar la línea celular de empaquetamiento PA317 anfotrópicas 5 y obtener una línea celular productora de virus estables después de la selección, ya sea con 0.5 mg / ml de neomicina (G418) para CDK4 o 0,5 mg / ml de higromicina para hTERT. </li><li> Preparar trabajo sobrenadantes virales por el crecimiento de las células de empaquetamiento estables hasta casi confluencia, luego, la cosecha el sobrenadante cada mañana, la tarde y la mañana para tres cosechas. </li><li> Filtra los sobrenadantes virales y, o bien utilizar directamente o dividirlos en alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 ° C para su uso posterior. Tenga en cuenta que sobrenadante viral pierde 50% de eficiencia de la infección con cada uno de congelación-descongelación. Recuerde que debe blanquear lavado antes de desechar todo lo que ha tocado las partículas virales. NOTA: La línea celular PA317 productoras de virus estable puede ser congelado y se mantiene a -150 ° C para el almacenamiento permanente (medio de congelación es del 10% DMSO; 90% de suero). </li><li> Plate FACS purificado células miogénicas (descrito en los pasos 1.1 a 1.9) a una densidad de 5 x 10 4 células / pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina al 0,1%. Asegúrese de que las células se unen a la placa antes de proceder con la infección viral. </li><li> Añadir 400 l filtrada, freshly producido sobrenadante viral o alícuotas congeladas a cada placa de seis pocillos durante la noche (mantener 2 pozos como controles). </li><li> Cambio de medio por la alimentación de las células con 2,5 ml / pocillo de medio fresco muscular (4: 1 medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y medio 199 suplementado con suero bovino fetal al 15%; 0,02 M tampón HEPES; 1,4 mg / L de vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L de dexametasona, factor de crecimiento de hepatocitos / l 2,5 g y / L el factor de crecimiento de fibroblastos básico 10 g). Deseche los medios de comunicación y pipetas que contienen las partículas virales en un contenedor de lejía. Deja células en el mismo medio durante 3 días para recuperarse de la infección, entonces tratan de selección utilizando 400 mg / ml de neomicina (infección CDK4) o 300 mg / ml de higromicina (infección hTERT). </li><li> Mantener células en la selección de medicamentos hasta que las células en la matriz placa control (1-2 semanas). </li><li> Células de paso antes de que se hacen confluentes (60-80% de confluencia, utilizando 0,05% de tripsina EDTA), incluso durante la SELECTIel período. Células Replate en múltiples 10cm platos con medio fresco de mioblastos (como se describe en 2.11), complementado con la droga selección. Mantener células seleccionadas inmortalizadas como una población heterogénea o clonar para obtener un fondo genético completamente homogénea (el mismo de inserción del transgén en cada célula). </li><li> Realice la selección clonal utilizando los siguientes pasos: <ol><li> Sembrar las células a baja densidad (por ejemplo, de 300 a 500 células en placas de 10 cm) y mantenerlas durante aproximadamente dos semanas, hasta pequeñas colonias se forman células (10-20). </li><li> Eliminar la mayor parte del medio en este punto, dejando sólo una película fina para evitar que las células se sequen. </li><li> Coloque un anillo de clonación (con un extremo sumergido en grasa de vacío de silicona) sobre cada clon deseado y añadir unas gotas de tripsina / EDTA. </li><li> Las células de la cosecha una vez que se redondean aspirando cuidadosamente las células utilizando una punta de 1 ml o una pipeta Pasteur y su transferencia a la más pequeña pla multiwell disponiblete (96 o 48, 24 o 12 pocillos). </li><li> Expandir clones según sea necesario para evitar la confluencia local. </li></ol></li></ol>

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An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li><li>Park, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+modulates+Wnt+signalling+by+association+with+target+gene+chromatin.">Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin.</a> Nature. 460, 66-72 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Las células como un recurso útil El aislamiento y el cultivo de poblaciones de células miogénicas es extremadamente útil cuando se establece fenotipos de la enfermedad o en modelos in vitro de la enfermedad. El procedimiento de aislamiento de células myogenic aquí descrito permite el aislamiento de los mioblastos y fibroblastos a partir de muestras de músculo esquelético, que luego pueden ser propagados, diferenciada, o inmediatamente analizadas. La estructura y fu...

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
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Stacy A. Cossette

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed 1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable. 
Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays 3,4.
We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1197">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"><a name="RANGE!A1:D52">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:207px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:484px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Equipment</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue&#160;culture biosafety hood</td>
			<td style="width:187px;">Baker Company, Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Model SterilGuard Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Benchtop centrifuge, such as Beckman Model&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:207px;">Model Allegra 6R</td>
			<td>If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon</td>
			<td style="width:207px;">Model Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:320px;">Tissue culture incubator, connected to a CO2 source</td>
			<td style="width:187px;">Forma Scientific&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS)</td>
			<td style="width:187px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:207px;">Model Aria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:320px;">Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase II</td>
			<td style="width:187px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:207px;">#04942078001</td>
			<td>Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:207px;">#088882001</td>
			<td>Prepare a stock solution of 10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1x Sterile Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">#14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin, fraction V</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">#05470</td>
			<td>Prepare a sterile&#160; solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">11965-092</td>
			<td>Contains L- glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RBC lysis solution</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:207px;">158904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Propidium Iodide stock 10mg/mL</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">P4170</td>
			<td>Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-human CD56 antibody for flow cytometry</td>
			<td style="width:187px;">Biolegend</td>
			<td>318310</td>
			<td>APC-conjugated antibody, other labels are avaialable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Reagents for immortalization of primary myoblasts</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ecotropic packaging cell line PE</td>
			<td style="width:187px;">Cell Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amphotropic packaging cell line PA3174</td>
			<td style="width:187px;">Cell Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Pig skin gelatin</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">G1890-500g</td>
			<td style="width:484px;">Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37&#176;C for one hour. Remove the solution and add medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">PolyJet&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">G418</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:207px;">345812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:187px;">EMD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">400051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT</td>
			<td style="width:187px;">not commercially available</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>Stadler et al, 2013</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Qiagen plasmid midiprep kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Medium 199</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td>Medium 199 (31150022)</td>
			<td style="width:484px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td>DMEM (11965-092)</td>
			<td style="width:484px;">Mix 4:1 DMEM:199</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:320px;">Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 &#956;g/l hepatocyte growth factor and 10 &#956;g/l beta fibroblast growth factor.</td>
			<td style="width:187px;">Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)&#160;</td>
			<td style="width:207px;">#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60&#181;g/ml); Dex (55&#181;g/&#181;l) separately for easier use. HGF stock solution (5&#181;g/ml) and FGF (20&#181;g/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Myosin heavy chain antibody for immunostaining</td>
			<td style="width:187px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:207px;">MF20</td>
			<td>Clone MF20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Desmin Antibody for immunostaining</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-376-S0</td>
			<td>Clone D33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Reagents for primary skin fibroblast isolation</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Fetal bovine serum: Thermo Scientific</td>
			<td style="width:207px;">SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:207px;">4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:207px;">17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials for isolation of primary myoblasts</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">50ml and 15ml sterile conical tubes</td>
			<td style="width:187px;">GeneMate/Bioexpress</td>
			<td style="width:207px;">C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile scalpels</td>
			<td style="width:187px;">Aspen Surgical</td>
			<td style="width:207px;">372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:207px;">1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes</td>
			<td>Bellco glass</td>
			<td>1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)</td>
			<td>Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)</td>
			<td style="width:187px;">BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile nylon cell strainers (100&#181;m and 40&#181;m size)</td>
			<td style="width:187px;">BD Falcon</td>
			<td colspan="2">352340 (40&#181;m); 352360 (100&#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">&#160;Materials for myoblast immortalization</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 0.45&#181;m filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Cloning rings</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td>#3166-8</td>
			<td>To be cleaned and autoclaved before and after use</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Materials for fibroblast cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile scalpels</td>
			<td>DeRoyal</td>
			<td>D4510A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile T25 tissue culture flasks</td>
			<td>Techno Plastic Product, TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>sold in the USA by MIDSCI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and immortalization of patient-derived cell lines from muscle biopsy for disease modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

La Figura 1 ilustra algunos de los pasos clave que participan en la disociación tejido primario: la cantidad exacta de tejido se pesa en una placa de cultivo tisular de Petri estéril (Figura 1A, B). El tejido se pica finamente utilizando escalpelos estériles, hasta que se obtuvo una suspensión de tejido (Figura 1C, D). Después de la adición de las enzimas de digestión, músculo primario de disociación del tejido se consigue normalmente mediante digestión enzim?...

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Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

isolation-immortalization-patient-derived-cell-lines-from-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K vistas.  UT Southwestern Medical Center. This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.