This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and by the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750, L40 AR057721 and 2R01NS047727).

NOTA: Os protocolos para a coleta do tecido humano deve ser analisado e aprovado pelo Comitê Institucional IRB. Coleção de descartado, tecido humano identificado-de ter sido aprovado pelo Hospital Infantil de Boston e Comitês IRB Hospital Brigham and Women. Os métodos descritos a seguir foram aplicadas para o isolamento de células miogénicas do de-identificados, tecido descartado. Os métodos descritos são aplicáveis ​​ao tecido a partir de material coletado do paciente consentiu. 1. Isolamento celular <ol><li> A dissociação de biópsia do músculo e purificação de células miogénicas <ol><li> Pré-pesar uma placa de cultura de tecido de 10 centímetros em uma biossegurança capa de cultura de tecidos, e, em seguida, re-pesar a placa contendo a biópsia muscular para calcular a quantidade de tecido a ser dissociados. </li><li> Usando bisturis estéreis, tecido muscular pique finamente e adicione algumas gotas de estéril 1x HBSS para evitar que o tecido seque. </li><li> Adicionar 3,5 ml de cada dispase II e colagenase D por grama de tecido muscular a ser digerido. Pipeta o tecido picada e solução de enzima através de uma pipeta estéril 25 ml algumas vezes. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 15 minutos e digerir tecido até que a lama passa facilmente através de uma pipeta de 5 ml estéril. NOTA: dissociação Tissue é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. Por favor, consulte a secção &#39;Os resultados representativos &quot;para obter detalhes adicionais. </li><li> Adicionar 2 volumes de meio de cultura estéril de tecido dissociado, filtrar através de um filtro de 100 um sobre uma célula de células de 50 ml para tubos cónicos e pelotas durante 10 minutos a 329 xg (~ 1100 rpm), a temperatura ambiente. Por favor, consulte a Tabela de Materiais para a composição de mídia. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 volume de meio de cultura estéril e adicionar 7 volumes de solução de lise de glóbulos vermelhos. Filtrar a solução através de um filtro de células 40 pm, então sedimentar tele células durante 10 minutos a 329 xg, à temperatura ambiente. </li><li> Contar as células num hemocitómetro e ressuspender as células em HBSS 1x 0,5% de BSA numa concentração de 1 x 10 6 células / 100 ul. Separe ~ 250.000 células em um único tubo que vai ser utilizado como um controlo negativo (sem mancha). Definir uma só cor manchadas tubos de controle de lado adicionais de iodeto de propídio e para CD56, que são necessários para a correcta delimitação de células positivas CD56 por FACS classificação. Por favor, consulte a célula manuais seleção ou consultar com FACS triagem especialistas instalação central para assegurar os controlos adequados estão incluídos. </li><li> Corar as células a serem classificados com 5 ul / 10 6 células do anticorpo anti CD56. Incubar todas as amostras (incluindo o controlo) em gelo durante 30 min. </li><li> Lavar as amostras em 10 ml de HBSS e 1x células pelotas durante 10 minutos a 329 xg (~ 1.100 rpm) numa centrifugadora refrigerada, 4 ° C de temperatura. </li><li> Adiciona-se iodeto de propídio a uma concentração final de 1 ug / ml para a amostra a ser sorted para a exclusão de células mortas. Purifica-se células positivas para CD56 a partir de células miogénicas não miogénicos usando o separador de células activadas por fluorescência. </li></ol></li><li> A dissociação de biópsia de pele NOTA: dérmica de fibroblastos podem ser isolados a partir de uma punção da pele de doentes biópsias musculares quando não estão disponíveis. Fibroblastos dérmicos podem ser usadas como biomaterial para diversos estudos, incluindo a transdução com MyoD para gerar células miogénicas. Além disso, os fibroblastos da derme pode ser usado para gerar células iPS, que podem ser diferenciadas em vários tipos de células para estudo posterior. <ol><li> Transportar a biópsia da pele para o laboratório em meio de transporte. Uma vez que a amostra é recebido, realizar a cultura primária tão rapidamente quanto possível. Se a cultura primária não podem ser estabelecidos no mesmo dia, armazenar a amostra à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Transfira a biópsia da pele para um estéril 35 milímetros placa de Petri na capela de fluxo laminar. </li><li> Lavar a biópsia da pele em uma placa de Petri estéril com 1x PBS para remover o sangue e detritos. Remover o tecido adiposo com um bisturi estéril. </li><li> Adicionar 2 ml de solução de colagenase e mediu o tecido com bisturi, incubar a 37 ° C durante 45 min a 1 hora, dependendo do tamanho do tecido. </li><li> Transferir o tecido digerido a um tubo de 15 ml, lavar a placa de Petri com 2 ml de meio de cultura de fibroblastos duas vezes, e recolher o meio no mesmo tubo. </li><li> Sedimentar as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 3 ml de meio de fibroblastos para remover a colagenase, em seguida, as células pellet novamente. Por favor, consulte a Tabela de Materiais para a composição de mídia. </li><li> Repita o passo 1.2.7 mais uma vez. </li><li> Re-suspender o sedimento em 5 ml de células de fibroblastos e médias placa em um frasco de cultura de tecidos T25 estéril. Incubar o balão a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Avaliar a cultura de fibroblastos para fixação e crescimento nos próximos 1-3 dias. &lt;br /&gt; NOTA: Alguns pequenos pedaços de tecido também pode anexar a placa e fibroblastos migram para fora desses pedaços de tecido. </li><li> Manter a cultura sob as mesmas condições até que os fibroblastos são cultivadas a cerca de 80% de confluência. </li><li> Recolhe fibroblastos por tripsinização e transferir para frascos de cultura frescas para a expansão adicional. Realizar tripsinização por lavagem das culturas 3 vezes em PBS 1x isento de Ca ++ e Mg ++. Adicionar tripsina-EDTA (ver Tabela de Materiais) para as células (frascos de 2 ml / T25), durante 2 min a 37 ° C. </li><li> Dividir células destacadas em frascos adicionais. Se alguns pedaços de tecido permanecer solidários com os frascos T25 originais, adicionar 5 ml de meio de cultura fresco para este frasco e mais fibroblastos vão migrar para fora continuamente. NOTA: A cultura de fibroblastos expandidos podem ser congelados para baixo como P1 e armazenados em azoto líquido para futuras experiências. </li></ol></li></ol> 2. Imortalidade de Células Miogênica <ol><li&gt; de 5 milhões de células Placa ecotrópica de empacotamento Phoenix (PE) durante uma noite numa placa de cultura de tecido de 10 centímetros estéril em DMEM e Meio 199 numa proporção de 4: 1, suplementado com 10% de soro de vitelo. </li><li> Células de alimentação 30 minutos antes da transfecção com 5 ml de meio fresco suplementado com 10 mM de cafeína. </li><li> Homogeneizar uma mistura de 2 ug de DNA de plasmídeo a partir de uma preparação midi (hTERT CDK4 ou plasmídeo) e PolyJet e incubar à temperatura ambiente durante 15 min, tal como recomendado pelo fabricante. </li><li> Adicione a mistura de plasmídeo / PolyJet às células PE durante a noite. </li><li> Células de alimentação com meio fresco (DMEM e Meio 199 numa proporção de 4: 1, suplementado com 10% de soro de vitelo). Doze horas mais tarde, recolhe-se o sobrenadante contendo vírus, filtrando-a através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 um. </li><li> Use 1 ml de sobrenadante recolhido para infectar durante a noite a linha celular de empacotamento anfotrópico PA317 5 e obter uma linha de células produtoras de vírus, após selecção com estável ou 0,5 mg / mL de neomicina (G418) para CDK4 ou 0,5 mg / ml de higromicina para hTERT. </li><li> Prepare trabalhando sobrenadantes virais pelo crescimento das células de embalagem estáveis ​​para próximo da confluência, em seguida, a colheita do sobrenadante cada manhã, à noite e de manhã a três colheitas. </li><li> Filtrar os sobrenadantes virais e utilizar quer directamente ou dividi-los em alíquotas de 1 ml e armazenar a -80 ° C para uso posterior. Note-se que o sobrenadante viral perde 50% de eficiência de infecção com cada congelamento-descongelamento. Lembre-se de branquear-lavagem antes de descartar tudo o que tem tocado as partículas virais. NOTA: A linha de células produtoras de vírus PA317 estáveis ​​pode ser congelada e mantida a -150 ° C para o armazenamento permanente (meio de congelação é de 10% de DMSO; 90% soro). </li><li> Placa células miogénicas-purificado FACS (descrito nos passos 1,1-1,9) a uma densidade de 5 x 10 4 células / poço em placas de 6 poços revestidas com 0,1% de gelatina. Certifique-se de que as células estão ligados à placa antes de prosseguir com a infecção viral. </li><li> Adicionar 400 ul filtrada, freshly produzido sobrenadante viral ou alíquotas congeladas a cada seis poços durante a noite (manter dois poços como controles). </li><li> Mudar meio alimentando as células com 2,5 ml de poço de media / fresco muscular (4: 1 meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e meio 199 suplementado com 15% de soro fetal de bovino; 0,02 M de tampão HEPES; 1,4 mg / L de vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / l dexametasona, factor de crescimento de hepatócitos de 2,5 ug / L e factor de crescimento de fibroblastos básico / L 10? g). Descartar os meios de comunicação e pipetas contendo as partículas virais em um recipiente de água sanitária. Deixar as células no mesmo meio durante 3 dias para recuperar de infecção, em seguida, tratar por selecção usando 400 ug / ml de neomicina (infecção CDK4) ou 300 ug / ml de higromicina (infecção hTERT). </li><li> Manter as células sob selecção de droga até as células da matriz de controlo prato (1-2 semanas). </li><li> Células de passagem antes de se tornarem confluentes (60-80% de confluência, utilizando tripsina EDTA 0,05%), mesmo durante a selectino período. Células replate 10 centímetros em vários pratos com meio de mioblastos fresco (como descrito em 2.11) suplementadas com a droga seleção. Manter células imortalizadas seleccionados como uma população heterogénea ou clonar obter um fundo genético completamente homogénea (mesma inserção do transgene em todas as células). </li><li> Realizar a selecção clonal utilizando os seguintes passos: <ol><li> Semear as células a uma densidade baixa (por exemplo, 300 a 500 células em placas de 10 cm) e mantê-los durante cerca de duas semanas, até que colónias pequenas são formadas células (10-20). </li><li> Remover a maior parte do meio, neste ponto, deixando apenas uma película fina para evitar que as células de secar. </li><li> Coloque um anel de clonagem (com uma extremidade mergulhada em silicone graxa de vácuo) ao longo de cada clone desejado e adicione algumas gotas de tripsina / EDTA. </li><li> Células colheita, uma vez que se tornam arredondadas com cuidado aspirar as células utilizando uma ponta de 1 ml ou uma pipeta de Pasteur e transferi-las para o menor pla multipoço disponívelte (96 ou 48, 24 ou placas de 12 poços). </li><li> Expandir clones conforme necessário para evitar confluência local. </li></ol></li></ol>

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An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li><li>Park, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+modulates+Wnt+signalling+by+association+with+target+gene+chromatin.">Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin.</a> Nature. 460, 66-72 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Células como um recurso útil O isolamento e cultura de populações de células miogênicas é extremamente útil quando estabelece fenótipos da doença ou em modelos in vitro de doença. O procedimento de isolamento de células miogénica descrito aqui permite o isolamento de fibroblastos a partir de mioblastos e amostras do músculo esquelético, o que pode, em seguida, ser propagadas, diferenciados, ou imediatamente analisadas. Estrutura e função de mioblastos pode ...

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed 1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable. 
Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays 3,4.
We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1197">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"><a name="RANGE!A1:D52">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:207px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:484px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Equipment</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue&#160;culture biosafety hood</td>
			<td style="width:187px;">Baker Company, Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Model SterilGuard Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Benchtop centrifuge, such as Beckman Model&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:207px;">Model Allegra 6R</td>
			<td>If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon</td>
			<td style="width:207px;">Model Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:320px;">Tissue culture incubator, connected to a CO2 source</td>
			<td style="width:187px;">Forma Scientific&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS)</td>
			<td style="width:187px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:207px;">Model Aria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:320px;">Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase II</td>
			<td style="width:187px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:207px;">#04942078001</td>
			<td>Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:207px;">#088882001</td>
			<td>Prepare a stock solution of 10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1x Sterile Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">#14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin, fraction V</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">#05470</td>
			<td>Prepare a sterile&#160; solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">11965-092</td>
			<td>Contains L- glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RBC lysis solution</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:207px;">158904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Propidium Iodide stock 10mg/mL</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">P4170</td>
			<td>Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-human CD56 antibody for flow cytometry</td>
			<td style="width:187px;">Biolegend</td>
			<td>318310</td>
			<td>APC-conjugated antibody, other labels are avaialable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Reagents for immortalization of primary myoblasts</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ecotropic packaging cell line PE</td>
			<td style="width:187px;">Cell Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amphotropic packaging cell line PA3174</td>
			<td style="width:187px;">Cell Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Pig skin gelatin</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">G1890-500g</td>
			<td style="width:484px;">Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37&#176;C for one hour. Remove the solution and add medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">PolyJet&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">G418</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:207px;">345812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:187px;">EMD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">400051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT</td>
			<td style="width:187px;">not commercially available</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>Stadler et al, 2013</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Qiagen plasmid midiprep kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Medium 199</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td>Medium 199 (31150022)</td>
			<td style="width:484px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td>DMEM (11965-092)</td>
			<td style="width:484px;">Mix 4:1 DMEM:199</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:320px;">Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 &#956;g/l hepatocyte growth factor and 10 &#956;g/l beta fibroblast growth factor.</td>
			<td style="width:187px;">Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)&#160;</td>
			<td style="width:207px;">#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60&#181;g/ml); Dex (55&#181;g/&#181;l) separately for easier use. HGF stock solution (5&#181;g/ml) and FGF (20&#181;g/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Myosin heavy chain antibody for immunostaining</td>
			<td style="width:187px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:207px;">MF20</td>
			<td>Clone MF20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Desmin Antibody for immunostaining</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-376-S0</td>
			<td>Clone D33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Reagents for primary skin fibroblast isolation</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Fetal bovine serum: Thermo Scientific</td>
			<td style="width:207px;">SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:207px;">4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:207px;">17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials for isolation of primary myoblasts</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">50ml and 15ml sterile conical tubes</td>
			<td style="width:187px;">GeneMate/Bioexpress</td>
			<td style="width:207px;">C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile scalpels</td>
			<td style="width:187px;">Aspen Surgical</td>
			<td style="width:207px;">372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:207px;">1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes</td>
			<td>Bellco glass</td>
			<td>1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)</td>
			<td>Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)</td>
			<td style="width:187px;">BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile nylon cell strainers (100&#181;m and 40&#181;m size)</td>
			<td style="width:187px;">BD Falcon</td>
			<td colspan="2">352340 (40&#181;m); 352360 (100&#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">&#160;Materials for myoblast immortalization</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 0.45&#181;m filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Cloning rings</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td>#3166-8</td>
			<td>To be cleaned and autoclaved before and after use</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Materials for fibroblast cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile scalpels</td>
			<td>DeRoyal</td>
			<td>D4510A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile T25 tissue culture flasks</td>
			<td>Techno Plastic Product, TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>sold in the USA by MIDSCI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and immortalization of patient-derived cell lines from muscle biopsy for disease modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

A Figura 1 ilustra alguns dos principais passos envolvidos na dissociação de tecido primário: a quantidade exacta de tecido é pesada num estéril de cultura de tecido de petri (Figura 1A, B). O tecido é então finamente picada usando bisturis estéreis, até que uma suspensão de tecido é obtida (figura 1C, D). Após a adição das enzimas de digestão, o tecido muscular primária dissociação é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. A ...

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Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

isolation-immortalization-patient-derived-cell-lines-from-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K visualizações.  UT Southwestern Medical Center. This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.