This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and by the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750, L40 AR057721 and 2R01NS047727).

NOT: insan dokusunun toplanması için protokoller gözden ve Kurumsal IRB komitesi tarafından onaylanmış olmalıdır. Atılan, de tanımlanan insan dokusunun Koleksiyon Boston Çocuk Hastanesi ve Brigham ve Kadın Hastanesi IRB Komiteleri tarafından onaylandı. Aşağıda tarif edilen yöntemler de tanımlanan gelen miyojenik hücre izolasyonu için uygulanmış olan, doku atılır. Tarif edilen yöntemler, razı hasta materyalinin toplanan dokuya uygulanabilir. 1. Hücre İzolasyonu <ol><li> Kas biyopsisi ve kas hücrelerinin saflaştırılması Ayrılma <ol><li> Doku miktarını hesaplamak için kas biyopsisi içeren plaka tartılır ve sonra tekrar ayrıldığı için, bir doku kültürü biyo-güvenlik başlığı içinde bir 10 cm doku kültürü plakası önceden ağırlık, vb. </li><li> Ince steril neşter, kıyma kas dokusu kullanılarak ve kurumasını önlemek için doku steril 1x HBSS birkaç damla ekleyin. </li><li> 3.5 ml di her ekleSpase II ve kas dokusu gramı başına kolajenaz D ile sindirilmiş olan. Bir steril 25 ml pipet ile birkaç kez kıyılmış doku ve enzim çözeltisinin Pipet. 15 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe ve bulamaç kolayca steril 5 ml pipet da geçene kadar doku sindiremez. Not: Doku ayrılma, genellikle 45-90 dakika içinde enzimatik sindirimi ile elde edilir. Ek ayrıntılar için &#39;Temsili Sonuçlar&#39; bölümüne bakınız. </li><li> 329 xg (~ 1,100 rpm) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 ml&#39;lik bir konik tüp ve topak hücreler üzerinde 100 um hücre süzgecinden ayrışmış dokunun, filtre edin steril büyüme ortamı 2 hacim ekleyin. Medya kompozisyon malzemeler Tablo bakınız. </li><li> Steril büyüme ortamı içinde 1 hacim pelet yeniden süspanse edin ve 7 hacim alyuvar lisiz çözeltisini ekleyin. 40 mikron hücre süzgecinden çözüm Filtre, ardından t pelet329 x g hızında 10 dakika, oda sıcaklığı için de hücreler. </li><li> Bir hemositometrede hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / 100 ul bir konsantrasyonda 1x HBSS,% 0.5 BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Bir kenara koyunuz ~ negatif (lekesiz) kontrol olarak kullanılacak bir tek tüp içinde 250,000 hücre. FACS sıralama tarafından CD56 pozitif hücrelerin düzgün yolluk için gerekli propidium iyodür ve CD56 için kenara ek tek renkli lekeli kontrol tüpleri, ayarlayın. Sıralama kılavuzları hücre veya uygun kontrolleri sağlamak için çekirdek tesis uzmanları sıralama FACS dahil danışmak bakınız. </li><li> Leke hücreleri, anti CD56 antikoru 5ul / 10 6 hücreleri ile sıralanacak. 30 dakika boyunca buz üzerinde (kontroller dahil) örnekleri inkübe edin. </li><li> 10 mi 1 x HBSS içinde yıkayın örnekler ve pelet hücreleri soğutmalı santrifüj 329 xg (~ 1,100 rpm) 4 ° C sıcaklıkta 10 dakika karıştırıldı. </li><li> Sor için örnek 1 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda propidyum iyodür eklemeÖlü hücrelerin dışlanması için ted. Floresan aktif hücre sıralayıcı kullanılarak olmayan Miyojenik hücrelerden myojenik CD56 pozitif hücreler arındırın. </li></ol></li><li> Cilt biyopsisi ayrışma Not: kas biyopsilerinde, mevcut olmadığında, dermal fibroblastlar hastadan bir deri zımba izole edilebilir. Dermal fibroblastlar miyojenik hücre elde etmek amacıyla MyoD transdüksiyon dahil olmak üzere birçok çalışmaları için malzeme olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, dermal fibroblastlar, ileri çalışmalar için çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir iPS hücrelerini üretmek için kullanılabilir. <ol><li> Ulaşım ortamında laboratuvara deri biyopsisi taşıyın. Numune alındıktan sonra, en kısa sürede temel kültürünü gerçekleştirmek. Birincil kültür aynı gün tesis edilemez ise, oda sıcaklığında gece boyunca örnek saklayın. </li><li> Laminer akış başlığı içinde steril bir 35 mm&#39;lik petri deri biyopsisi aktarın. </li><li> Steril 1 ile bir petri çanağı içinde deri biyopsisi durulayınx PBS kan ve enkaz kaldırmak için. Steril bir bisturi ile yağ dokusu çıkarın. </li><li> 2 ml kollajenaz solüsyonu eklenir ve neşter ile dokusunu inceltmek, doku boyutuna bağlı olarak 1 saat ile 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> , 15 ml konik tüp ile sindirilmiş doku transferi iki fibroblast kültür ortamına 2 ml petri durulama ve aynı tüp içerisinde ortam toplanır. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de topak hücrelere. </li><li> Süpernatantı atın ve sonra tekrar, pelet hücreleri kollajenaz çıkarmak için fibroblast orta 3 ml pelet yıkayın. Medya kompozisyon malzemeler Tablo bakınız. </li><li> Adım 1.2.7 kez daha tekrarlayın. </li><li> Bir T25 steril doku kültürü şişesi üzerine 5 ml fibroblast orta ve plaka hücrelerinde pelet yeniden askıya. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir balon içinde inkübe edin. </li><li> Önümüzdeki 1-3 gün içinde fibroblast eki ve büyüme için kültür değerlendirin. &lt;br /&gt; Not: Bazı küçük doku parçaları da plaka takmak olabilir ve fibroblastların bu doku parçaları dışarı göç. </li><li> Fibroblastlar, yaklaşık% 80 konflüense kadar büyütülür kadar aynı koşullar altında kültür muhafaza edin. </li><li> Tripsinizasyon ile fibroblastlar toplayın ve ek genişleme için taze kültür şişeler üzerine aktarın. Ca ++ ve Mg ++ serbest Kültürlerin 1x PBS içinde 3 kez yıkanarak trypsinization gerçekleştirin. 37 ° C&#39;de 2 dakika için bir hücre (2 ml / T25 şişesi) ile Tripsin-EDTA (bakınız Materyaller Tablosu) ekleyin. </li><li> Ek şişeler içine müstakil hücreleri bölün. Bazı doku parçaları orijinal T25 şişeler bağlı kalırsa, bu şişeye 5 ml taze kültür ortamı ekleyin ve daha fibroblastlar sürekli dışarı göç edecek. NOT: Genişletilmiş fibroblast kültürü P1 dondurulur ve gelecekteki deneyler için sıvı azot içinde saklanır. </li></ol></li></ol> AndMyogenic Hücreler 2. Ölümsüzleştirme <ol><li&gt;, gece boyunca 4 oranında DMEM ve Medium 199 içinde 10 cm uzunluğunda bir steril doku kültür plakasında Levha 5000000 Phoenix ekotropik paketleme hücreleri (PE):% 10 dana serumu ile takviye edilmiş 1. </li><li> 10 mM kafein ile desteklenmiş taze ortam 5 ml transfeksiyondan 30 dakika önce besleme hücreleri. </li><li> Midi hazırlık (CDK4 veya hTERT plazmid) ve PolyJet plazmid DNA 2 ug homojen bir karışım ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Gecede PE hücrelere plazmid / polyjet karışımı ekleyin. </li><li> Taze ortam ile besleme hücreleri (DMEM ve 4 arasında bir oranda orta 199:% 10 dana serumu ile takviye edilmiş 1). Oniki saat sonra, virüs içeren süpernatan toplamak ve 0.45 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre ediniz. </li><li> (G41 gece boyunca amfotropık paketleme hücre hattı PA317 5 enfekte süpernatan 1 ml kullanın ve ya 0.5 mg / ml neomisin ile seçildikten sonra stabil bir virüs üreten hücre hattı elde edilir8) CDK4 veya 0.5 mg / hTERT için higromisin ml. </li><li> Sonra üç hasat için süpernatant her sabah, akşam ve sabah hasat, yakın konfluansa stabil ambalaj hücreleri büyüyerek viral üst fazlar çalışma hazırlayın. </li><li> Viral süpernatanların, filtre edin ve doğrudan daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler ve deposuna kullanan ya da bölün. Viral süspansiyon her dondurulup çözülerek% 50 enfeksiyonu verimlilik kaybeder unutmayın. Ağartıcı yıkama viral parçacıkların dokundu her şeyi atmadan önce unutmayın. Not: kararlı PA317 virüs üreten hücre çizgisi dondurulmuş ve kalıcı depolama için -150 ° C &#39;de muhafaza edilebilir (orta dondurma,% 10 DMSO,% 90 serum). </li><li> Plaka, FACS ile saflaştırılmış miyojenik hücre / göz% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6-çukurlu levhalarda 5 x 10 4 hücre yoğunluğunda (1.1-1.9 adımlarda tarif edilmiştir). Hücreler viral enfeksiyon geçmeden önce plaka takılı olduğundan emin olun. </li><li> F, süzülmüş 400 ul eklereshly gece boyunca (kontrol olarak 2 kuyu tutun) her biri altı plaka viral süpernatan ya da dondurulmuş alikotları üretti. </li><li> 2.5 ml / oyuk taze kas madde (4 hücrelerin beslenmesi ile orta değiştirin: 0.02 M HEPES tamponu, 1.4 mg / L Vitamin B12,% 15 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş 1 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve Medium 199 0.03 mg / L ZnSO4, 0.055 mg / L, deksametason, 2.5 ug / L hepatosit büyüme faktörü ve 10 ug / L, temel fibroblast büyüme faktörü). Bir ağartıcı kap içinde viral partikülleri ihtiva eden ortam ve pipet atın. 3 gün sonra enfeksiyon kurtarmak 400 ug / ml neomisin (CDK4&#39;ün enfeksiyonu) veya 300 ug / ml higromisin (hTERT enfeksiyonu) kullanarak seçimi için tedavi için aynı ortamda hücreleri bırakın. </li><li> Kontrol çanak kalıp hücrelerin (1-2 hafta) kadar ilaç seçimi altında hücreleri koruyun. </li><li> Hatta selecti sırasında; (EDTA tripsin% 0.05 ile% 60-80 confluency) Geçiş hücreleri birleşik haline gelmeden öncedönemi. Seçim ilaç ile desteklenmiş taze miyoblast ortamı ile birden çok 10 cm tabaklarda Replate hücreleri (2.11 tarif edildiği gibi). Heterojen bir nüfus olarak ölümsüzleştirdi seçilen hücreleri korumak veya tamamen homojen genetik geçmişini (her hücrede transgenin aynı ekleme) elde etmek klon. </li><li> Aşağıdaki adımları kullanarak klonal seçim yapın: <ol><li> Küçük koloniler (10-20 hücreleri) oluşana kadar, düşük yoğunluklu (örneğin 10 cm yemekleri 300 ile 500 hücreler) hücreleri Tohum ve yaklaşık iki hafta boyunca onları korumak. </li><li> Kurumasını hücreleri önlemek için sadece ince bir film bırakarak, bu noktada sıvı ortamı en iyi çıkarın. </li><li> (Bir ucu silikon vakum yağ batırılmış) ile istenen her klon üzerinde klonlama halka yerleştirin ve tripsin / EDTA birkaç damla ekleyin. </li><li> Hasat hücreleri dikkatli bir 1 ml ucu veya Pasteur pipeti kullanarak hücrelerin aspire ve en küçük multiwell pla aktararak yuvarlak hale kezte (96 ya da 48, 24 ya da 12 havuzlu plakalar). </li><li> Yerel confluency önlemek için gerektiği gibi klonlar genişletin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Flanigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+muscular+dystrophies.">The muscular dystrophies.</a> Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).</li><li>Mercuri, E., Muntoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophies.">Muscular dystrophies.</a> Lancet. 381, 845-860 (2013).</li><li>Sharples, A. P., Stewart, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblast+models+of+skeletal+muscle+hypertrophy+and+atrophy.">Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).</li><li>Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+skeletal+muscle+development+and+applications+in+regenerative+medicine.">Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).</li><li>Miller, A. D., Buttimore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesign+of+retrovirus+packaging+cell+lines+to+avoid+recombination+leading+to+helper+virus+production.">Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production.</a> Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).</li><li>Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+antigen+Leu-19+as+a+molecular+marker+of+regeneration+in+human+skeletal+muscle.">Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).</li><li>Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+natural+killer+(NK)+cell-associated+antigen+CD56(Leu-19),+which+is+identical+to+the+140-kDa+isoform+of+N-CAM,+in+neural+and+skeletal+muscle+cells+and+tumors+derived+therefrom.">Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom.</a> Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).</li><li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells.">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li><li>Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+human+and+mouse+satellite+cells+really+the+same.">Are human and mouse satellite cells really the same.</a> J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).</li><li>Belles-Isles, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+selection+of+donor+myoblast+clones+for+muscular+dystrophy+therapy+using+cell+surface+expression+of+NCAM.">Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM.</a> Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).</li><li>Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+human+muscle-derived+cells+to+skeletal+muscle+regeneration+in+dystrophic+host+mice.">Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice.</a> PLoS One. 6, e17454 (2011).</li><li>Zhu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+human+myoblasts+is+overcome+by+human+telomerase+reverse+transcriptase+and+cyclin-dependent+kinase+4:+consequences+in+aging+muscle+and+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies.">Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies.</a> Aging Cell. 6, 515-523 (2007).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet Muscle. 1, 34 (2011).</li><li>Sigmund, C. D., Stec, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).</li><li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution.">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Res. 42, e104 (2014).</li><li>Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+myogenic+cell+populations+obtained+via+the+preplate+technique:+potential+for+rapid+isolation+of+muscle-derived+stem+cells.">Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells.</a> Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).</li><li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique.">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li><li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy.">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).</li><li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+converts+primary+dermal+fibroblasts,+chondroblasts,+smooth+muscle,+and+retinal+pigmented+epithelial+cells+into+striated+mononucleated+myoblasts+and+multinucleated+myotubes.">MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).</li><li>Huard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+dermal+fibroblasts+expressing+MyoD1+in+mouse+muscles.">Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).</li><li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies.">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li><li>Park, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+modulates+Wnt+signalling+by+association+with+target+gene+chromatin.">Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin.</a> Nature. 460, 66-72 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Faydalı Kaynak olarak Hücreler Hastalığın in vitro modellerde veya hastalık fenotipleri kurulurken miyojenik hücre popülasyonlarının izolasyonu ve kültürü son derece yararlıdır. Burada anlatılan Miyojenik hücre izolasyon prosedürü sonra, yayılır farklılaştırılmış, ya da hemen analiz edilebilir iskelet kas örneklerinde, gelen miyoblastların ve fibroblastların izolasyonu sağlar. Miyoblast yapısı ve fonksiyonu, hücre yaşamda kalması, hücre füzyonun...

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed 1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable. 
Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays 3,4.
We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1197">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;"><a name="RANGE!A1:D52">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:207px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:484px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Equipment</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue&#160;culture biosafety hood</td>
			<td style="width:187px;">Baker Company, Inc.</td>
			<td style="width:207px;">Model SterilGuard Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Benchtop centrifuge, such as Beckman Model&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:207px;">Model Allegra 6R</td>
			<td>If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon</td>
			<td style="width:207px;">Model Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:320px;">Tissue culture incubator, connected to a CO2 source</td>
			<td style="width:187px;">Forma Scientific&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fluorescence-activated cell sorter (FACS)</td>
			<td style="width:187px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:207px;">Model Aria</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:320px;">Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase II</td>
			<td style="width:187px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:207px;">#04942078001</td>
			<td>Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:207px;">#088882001</td>
			<td>Prepare a stock solution of 10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1x Sterile Hank&#8217;s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">#14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin, fraction V</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">#05470</td>
			<td>Prepare a sterile&#160; solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">11965-092</td>
			<td>Contains L- glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RBC lysis solution</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td style="width:207px;">158904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Propidium Iodide stock 10mg/mL</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">P4170</td>
			<td>Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-human CD56 antibody for flow cytometry</td>
			<td style="width:187px;">Biolegend</td>
			<td>318310</td>
			<td>APC-conjugated antibody, other labels are avaialable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Reagents for immortalization of primary myoblasts</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Ecotropic packaging cell line PE</td>
			<td style="width:187px;">Cell Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">RV-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amphotropic packaging cell line PA3174</td>
			<td style="width:187px;">Cell Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Pig skin gelatin</td>
			<td style="width:187px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">G1890-500g</td>
			<td style="width:484px;">Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37&#176;C for one hour. Remove the solution and add medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">PolyJet&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">G418</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:207px;">345812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:187px;">EMD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">400051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT</td>
			<td style="width:187px;">not commercially available</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>Stadler et al, 2013</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Qiagen plasmid midiprep kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Medium 199</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td>Medium 199 (31150022)</td>
			<td style="width:484px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td>DMEM (11965-092)</td>
			<td style="width:484px;">Mix 4:1 DMEM:199</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:320px;">Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 &#956;g/l hepatocyte growth factor and 10 &#956;g/l beta fibroblast growth factor.</td>
			<td style="width:187px;">Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)&#160;</td>
			<td style="width:207px;">#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&#160;</td>
			<td style="width:484px;">Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60&#181;g/ml); Dex (55&#181;g/&#181;l) separately for easier use. HGF stock solution (5&#181;g/ml) and FGF (20&#181;g/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Myosin heavy chain antibody for immunostaining</td>
			<td style="width:187px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:207px;">MF20</td>
			<td>Clone MF20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Desmin Antibody for immunostaining</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-376-S0</td>
			<td>Clone D33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Horse serum</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Reagents for primary skin fibroblast isolation</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:187px;">Fetal bovine serum: Thermo Scientific</td>
			<td style="width:207px;">SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized</td>
			<td style="width:187px;">Worthington</td>
			<td style="width:207px;">4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:207px;">17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials for isolation of primary myoblasts</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">50ml and 15ml sterile conical tubes</td>
			<td style="width:187px;">GeneMate/Bioexpress</td>
			<td style="width:207px;">C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile scalpels</td>
			<td style="width:187px;">Aspen Surgical</td>
			<td style="width:207px;">372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:207px;">1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes</td>
			<td>Bellco glass</td>
			<td>1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)</td>
			<td>Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)</td>
			<td style="width:187px;">BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile nylon cell strainers (100&#181;m and 40&#181;m size)</td>
			<td style="width:187px;">BD Falcon</td>
			<td colspan="2">352340 (40&#181;m); 352360 (100&#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">&#160;Materials for myoblast immortalization</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 0.45&#181;m filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Cloning rings</td>
			<td style="width:187px;">Corning</td>
			<td>#3166-8</td>
			<td>To be cleaned and autoclaved before and after use</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Materials for fibroblast cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile scalpels</td>
			<td>DeRoyal</td>
			<td>D4510A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Sterile T25 tissue culture flasks</td>
			<td>Techno Plastic Product, TPP</td>
			<td>90026</td>
			<td>sold in the USA by MIDSCI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:187px;">GIBCO Life Technologies</td>
			<td style="width:207px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and immortalization of patient-derived cell lines from muscle biopsy for disease modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Şekil 1 birincil doku ayrışma yer alan önemli bazı adımlar göstermektedir: dokusunun tam miktarı (Şekil 1A, B) steril doku kültürü petri tartılır. Doku bulamaç (Şekil 1C, D) elde edilinceye kadar Doku daha sonra ince steril neşter kullanılarak çekilir. Sindirim enzim ilavesinden sonra, primer kas dokusu ayrılma, genellikle 45-90 dakika içinde enzimatik sindirimi ile elde edilir. Doku sindirimi ilerlemesi tipik Overdigestion ve hücre ölümünü ön...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling at JoVE.com

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

isolation-immortalization-patient-derived-cell-lines-from-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K Görüntüleme.  UT Southwestern Medical Center. This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.