We are grateful to Gurdon laboratory members for useful discussion. K.M. is a Research Fellow at Wolfson College and is supported by the Herchel Smith Postdoctoral Fellowship and the Great Britain Sasakawa Foundation. Gurdon laboratory is supported by grants from the Wellcome Trust (RG69899) and MRC to J.B.G.

<ol>
	<li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B., Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+amphibian+egg+to+understand+the+mammalian+oocyte.">Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte.</a> Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. , 1-11 (2013).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li><li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li><li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection.">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li><li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+'autocatalytic'+nature+of+the+maturation+promoting+factor+(MPF)+in+oocytes+of+Xenopus+laevis.">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens.">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li><li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes.">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes &amp; development. 25 (9), 946-958 (2011).</li><li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method.">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. 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The authors have nothing to disclose.

Nos detalle aquí un nuevo método para agotar factores maternos o para sobreexpresar factores exógenos antes de la fertilización. Este sistema requiere dos microinyecciones, pero en su lugar se salta de la cirugía de las ranas, utilizado en el método de transferencia de 7,17 host. Es óptimo para eliminar el paso de la cirugía rana en términos de cuidado de los animales. Por otra parte, no tenemos que tener en cuenta para la calidad de las ranas hembra de acogida para los experimentos de transferencia, lo que significa que podemos deshacernos de un factor biológico que afecta el éxito de los experimentos. Por lo tanto en este sistema la calidad de los ovocitos obtenidos de ranas cebados con PMSG es un factor biológico importante que es la clave para experimentos exitosos. La calidad de los ovocitos puede ser juzgado después de la recogida de ovario o después defolliculation. Si se observa alguna anomalía en estas etapas, es óptimo para recoger otro ovario de una nueva rana. Otro punto en el que se puede comprobar la calidad de los ovocitos es después de la maduración de ovocitos. Si es menos de 80% de progesteronaovocitos e tratados muestran signos de maduración, es posible que no pueda obtener el número suficiente de embriones para otros análisis. El uso de defolliculation enzimática en lugar de defolliculation manual es también otra ventaja de utilizar este sistema para reducir la mano de obra requerida para defolliculation. Sin embargo, todavía es posible que defolliculation manual puede dar un mejor desarrollo que el tratamiento enzimático. Como se muestra en la Figura 3, casi 10% de los ovocitos madurados in vitro se puede llegar a la etapa de natación renacuajo. Estos datos se recogen de 13 experimentos independientes, incluyendo los reportados en 8 y nuevos experimentos de inyección. Método de transferencia Host necesita 75-150 ovocitos en cada tratamiento para obtener datos significativos desde 30 a 60% de los ovocitos transferidos puede llegar a la etapa neurula 17. Nuestro método normalmente se inicia con 200 a 300 ovocitos en cada grupo experimental ya que aproximadamente el 40-60% de los embriones escindidos puede llegar a laetapa respuesta muscular. Estos datos sugieren que ambos métodos apoyan una tasa de desarrollo razonable. Hasta ahora hemos obtenido 10 ranas vivas de control de mRNA inyectado y control antisentido ovocitos oligo-inyectado utilizando esta técnica, lo que indica que este enfoque apoya el desarrollo a través de la metamorfosis. Nuestro método de manipulación-ICSI de ovocitos ofrece la oportunidad de probar el papel de los factores maternos durante el desarrollo embrionario temprano, poco después de la fertilización. Además, la sobreexpresión de factores de modificación de la cromatina antes de la fertilización puede hacer posible para remodelar la cromatina materna antes de la fertilización para la comprensión de los estados de la cromatina materna necesario para el desarrollo. Esta estrategia también puede trabajar bien con los sistemas de edición gen de actualidad como la transcripción del tipo activador de efector nucleasa (TALEN) 18,19 y CRISPR / CAS9 20,21 ya que éstos pueden expresarse incluso antes de la fertilización. Por lo tanto, nuestro nuevo enfoque tiene un potential que debe utilizarse para muchas aplicaciones en el futuro.

Xenopus laevis es un ampliamente utilizado, poderoso organismo modelo para estudiar el desarrollo 1. Esto es porque los huevos de Xenopus son inusualmente grande (aproximadamente 1.2 a 1.4 mm, en comparación con sus homólogos de mamíferos ser aproximadamente 0,1 mm) y abundante. Los huevos contienen maternalmente sintetizadas y almacenadas componentes, que son suficientes para impulsar el desarrollo embrionario hasta la transición a mediados de blástula (MBT, que se producen en la etapa de 8-8,5 con 4.000-8.000 células). MBT es acompañada por la activación del genoma cigóticos, que entonces produce productos de genes embrionarios que dirigen el desarrollo adicional. Numerosos estudios dirigidos a identificar los factores maternos importantes para el desarrollo. Muchos estudios se basan en la inyección de oligonucleótidos antisentido (oligos) incluyendo oligonucleótidos morfolino en embriones fertilizados, en los que la degradación caso de las proteínas maternas se puede observar en la etapa de gástrula 2-4. Alternativamente, los ARNm se inyectan a em fertilizadobryos que perturban las funciones de genes o para rastrear destinos de proteínas sobreexpresados. Sin embargo, la inyección en los embriones en estadio de una célula que normalmente no afecta a los niveles de expresión de proteínas materna en las primeras etapas embrionarias antes de MBT. Heasman y Wylie establecieron el método de transferencia de acogida para superar este problema 5. En su método, los ovocitos desfolicularon manualmente son inyectados con oligonucleótidos antisentido y se transfirieron a hembras de acogida 6. Las proteínas están regulados a la baja antes de la fertilización para que funciones de las proteínas downregulated en el desarrollo embrionario temprano pueden ser examinados. Este método agotamiento de la madre llevó a la identificación de varias funciones de desarrollo únicas de proteínas maternas, tal como fue revisado en 7. En este informe, detallamos nuestro método recientemente desarrollado, en el que se alcanza el agotamiento materno o sobreexpresión de ARNm antes de la fertilización sin defolliculation manual y transferencia de acogida8. Defolliculation manual requiere una gran cantidad de tiempo y de transferencia de acogida a menudo necesita técnicas de expertos y la licencia específica para la cirugía animal, lo que dificulta el uso frecuente de método de agotamiento de la madre. Defolliculation y transferencia de acogida son sustituidos por defolliculation enzimática 9,10 y la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) 11-13, respectivamente. ICSI a los huevos se utilizó originalmente para producir ranas transgénicos 12. Esperma y embriones de núcleos también fueron trasplantadas en in vitro de ovocitos de anfibios madurado 11,14,15. Aquí, mostramos nuestro método paso a paso para inyectar espermatozoides ovocitos madurados in vitro que fueron pre-inyectados con oligonucleótidos antisentido o ARNm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)&#160;</td>
			<td style="width:87px;">MSD Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">Vm 01708/4309</td>
			<td>PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Liberase TM Research Grade</td>
			<td style="width:87px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">05 401 127 001</td>
			<td>For oocyte defolliculation. Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:216px;">Drummond Nanoject</td>
			<td style="width:87px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">3-000-205/206</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Alpha laboratories</td>
			<td style="width:119px;">7&#8221; Drummond #3-000-203-G/XL</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:87px;">SUTTER Instrument</td>
			<td style="width:119px;">Model D-97</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td>For invitro maturation and ICSI</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">14 ml ultra-clear centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D1556</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digitonin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D141</td>
			<td>Cell permeabilization reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker</td>
			<td style="width:87px;">Hybaid&#160;</td>
			<td style="width:119px;">HB-SHK-1</td>
			<td>For oocyte defolliculation.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope (Stereo zoom microscope)</td>
			<td style="width:87px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">Semi SV6</td>
			<td>For oocyte collection and microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 &#956;m pore filter</td>
			<td style="width:87px;">CellTrics</td>
			<td style="width:119px;">04-0042-2317</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Optima L-100XP</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:87px;">Cellstar Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">227261 or 210261</td>
			<td>Oocyte collection and defolliculation reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">90 mm Petri dish&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">101VR20/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easy-Grip Cell Culture Dish, 60x15 mm</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easy-Grip Cell Culture Dish, 35x15 mm</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation and in vitro maturation of xenopus laevis oocytes, followed by intracytoplasmic sperm injection, to study embryonic development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

El desarrollo embrionario de embriones ICSI utilizando en ovocitos madurados in vitro fue examinado (Figura 3A). Tasas de maduración de ovocitos GV a la etapa MII son variables y dependen en gran medida de la calidad de los ovocitos. En los buenos experimentos, casi el 100% de los ovocitos GV responder a la progesterona y muestran signos de maduración de ovocitos, finalmente convertirse huevos en la etapa MII. Todos los ovocitos madurados fueron sometidos a ICSI y aproximadamente 25% de los huevos inyectados escindidos (Figura 3A, n = 13 para el control revueltos ovocitos oligo-inyectado y n = 7 para no ovocitos oligo-inyectada). Aproximadamente el 60% o 80% de los embriones escindidos, producidos a partir de ovocitos inyectados con oligo de control o de ovocitos no inyectada, respectivamente, alcanzaron la etapa de blástula / gástrula. Entre los embriones blástula / gástrula, aproximadamente la mitad de los embriones en las muestras de oligo-inyectado eran de buena calidad (casi no hay signos de división anormal y apoptosis), mientras que el 82% de los embriones blástula / gástrula eran de buena calidad nmuestras inyectadas en (Figura 3A). Finalmente, 41% y 11% de los embriones escindidos en muestras de oligo-inyectada llegaron a la respuesta muscular y las etapas de natación renacuajo, respectivamente, mientras que el 60% y el 29% de los embriones escindidos en muestras no inyectados hicieron (Figura 3A). Estos embriones ICSI son la mezcla de los embriones normales y anormales (Figura 3B). Algunos de ellos sufren metamorfosis y desarrollar a madurar ranas 8. Estos resultados sugieren que la inyección de oligonucleótidos antisentido en oocitos GV, seguido de IVM y ICSI, permite el desarrollo embrionario temprano eficiente. Aunque la inyección de sí mismo oligos antisentido disminuye el desarrollo embrionario, todavía somos capaces de obtener suficientes embriones para muchos propósitos experimentales como la comprobación de las tasas de desarrollo, RT-PCR, western blot y así sucesivamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> Higo<html> Ure 1: Ejemplos típicos de Xenopus laevis ovocitos de buena calidad o mala calidad de los experimentos in vitro de maduración. (A) Un ejemplo de ovocitos de mala calidad. Por ejemplo, los ovocitos que muestran la pigmentación irregular no se utilizan para experimentos posteriores. Cada oocito de Xenopus laevis es de aproximadamente 1/2 a 1/4 mm de diámetro. (B) un ovocito parcialmente desfolicularon. La mitad derecha del ovocito está cubierto por las células del folículo, que se pueden discernir por la presencia de vasos sanguíneos. Una flecha muestra un área libre de células del folículo y en la que se inyecta la aguja de inyección. (C) Un ejemplo de ovocitos de buena calidad, que son de igual tamaño y muestran hemisferios animales uniformemente pigmentados con un claro contraste entre el hemisferio animal y el hemisferio vegetal. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Oocitos de Xenopus laevis antes y después de la maduración Después de la maduración de ovocitos, manchas blancas claros aparecen en la parte superior de los hemisferios animales y las células del folículo se pelan. Cada oocito de Xenopus laevis es de aproximadamente 1 mm de diámetro. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Figura 3: Desarrollo de embriones ICSI, producidos a partir de ovocitos madurados in vitro. (A) Desarrollo de embriones ICSI a cada etapa se resume. Los oocitos fueron inyectados con control mezclado oligonucleótidos antisentido (oligo de inyección de control) o sin inyección (no inyección), seguido de IVM y ICSI. El número correspondiente de embriones en cada etapa se muestra por encima de las barras. Media ± SEM se muestra. N = 4-13 experimentos independientes / diferente females. (B) Ejemplos de sobrevivir embriones ICSI. Estos embriones tailbud etapa fueron producidos en un experimento, en el que se utilizaron aproximadamente 200 ovocitos como material de partida.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

22.0K vistas.  University of Cambridge. We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.