We are grateful to Gurdon laboratory members for useful discussion. K.M. is a Research Fellow at Wolfson College and is supported by the Herchel Smith Postdoctoral Fellowship and the Great Britain Sasakawa Foundation. Gurdon laboratory is supported by grants from the Wellcome Trust (RG69899) and MRC to J.B.G.

<ol>
	<li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B., Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+amphibian+egg+to+understand+the+mammalian+oocyte.">Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte.</a> Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. , 1-11 (2013).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li><li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li><li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection.">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li><li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+'autocatalytic'+nature+of+the+maturation+promoting+factor+(MPF)+in+oocytes+of+Xenopus+laevis.">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens.">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li><li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes.">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes &amp; development. 25 (9), 946-958 (2011).</li><li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method.">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li><li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis).">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li><li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases.">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth &amp; differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nós aqui detalhe um novo método para esgotar fatores maternos ou overexpress fatores exógenos antes da fertilização. Este sistema requer dois micro-injecções, mas em vez disso ignora a cirurgia de sapos, utilizado no método de transferência 7,17 hospedeiro. É ideal para remover a etapa cirurgia sapo em termos de cuidados com os animais. Além disso, não temos de levar em conta a qualidade de rãs do sexo feminino de acolhimento para os experimentos de transferência, o que significa que podemos nos livrar de um fator biológico que afeta o sucesso dos experimentos. Portanto, neste sistema a qualidade dos oócitos obtidos a partir de rãs PMSG-condicionadas é um importante fator biológico que é a chave para as experiências bem-sucedidas. A qualidade dos oócitos pode ser julgado após a coleta de ovário ou após defolliculation. Se qualquer anormalidade for observada nestas fases, é ideal para coletar outro ovário de uma nova rã. Outro ponto em que você pode verificar a qualidade do ovócito é após a maturação do oócito. Se menos do que 80% de progesteronaoócitos tratados-e mostrar sinais de maturação, você pode não ser capaz de obter o número suficiente de embriões para análises posteriores. O uso de defolliculation enzimática em vez de defolliculation manual é também uma outra vantagem de se utilizar este sistema para reduzir o trabalho necessário para defolliculation. No entanto, ainda é possível que defolliculation manual pode dar um desenvolvimento melhor do que o tratamento enzimático. Como mostrado na Figura 3, quase 10% dos oócitos maturados in vitro podem alcançar o estágio natação girino. Estes dados são recolhidos a partir de 13 experimentos independentes, incluindo os relatados em 8 e novos experimentos de injeção. Método de transferência anfitrião precisa 75-150 ovócitos em cada tratamento para a obtenção de dados significativos uma vez que 30-60% dos oócitos transferidos podem chegar à fase neurula 17. O nosso método começa normalmente com 200-300 oócitos em cada grupo experimental, uma vez que aproximadamente 40-60% dos embriões clivados pode chegar afase resposta muscular. Estes dados sugerem que ambos os métodos de desenvolvimento suporta uma taxa razoável. Temos até agora obtido 10 sapos vivos de oócitos com injeção de controle oligo antisense com injecção de mRNA e controle utilizando esta técnica, indicando que esta abordagem apoia o desenvolvimento por meio de metamorfose. Nosso método de manipulação de oócitos-ICSI é uma oportunidade para testar o papel dos fatores maternos durante o desenvolvimento embrionário muito cedo, logo após a fertilização. Além disso, a sobre-expressão de factores de modificação da cromatina antes da fertilização pode tornar possível a remodelação da cromatina materna antes da fertilização para a compreensão estados cromatina materna necessário para o desenvolvimento. Esta estratégia também pode funcionar bem com sistemas de edição gene atuais, como a transcrição ativador-like efetoras nuclease (TALEN) 18,19 e CRISPR / CAS9 20,21 uma vez que estes podem ser expressas, mesmo antes da fertilização. Portanto, a nossa nova abordagem tem uma potentiAl de ser utilizado para muitas aplicações no futuro.

Xenopus laevis é um amplamente utilizado, poderoso organismo modelo para estudar o desenvolvimento 1. Isso ocorre porque os ovos de Xenopus são extraordinariamente grande (cerca de 1,2-1,4 mm, em comparação com congéneres de mamíferos sendo cerca de 0,1 mm) e abundante. Os ovos contêm componentes maternalmente sintetizados e armazenados, que são o suficiente para conduzir o desenvolvimento embrionário até meados de transição blastula (MBT, que ocorre na fase de 8-8,5 com células 4,000-8,000). MBT é acompanhada de ativação do genoma zygotic, que então produz produtos de genes embrionários que direcionam o desenvolvimento. Numerosos estudos teve como objetivo identificar fatores maternos importantes para o desenvolvimento. Muitos estudos baseiam-se na injecção de oligonucleótidos anti-sentido (oligos), incluindo oligonucleótidos de morfolino em embriões fertilizados, caso em que a degradação de proteínas maternas podem ser observados na fase de gástrula 2-4. Alternativamente, os ARNm são injectados para fertilizados inbryos perturbar funções de genes ou para traçar destino de proteínas sobre-expressos. No entanto, a injecção nos embriões em estágio de uma célula normalmente não afeta os níveis de proteínas maternos expressão nas fases embrionárias muito cedo antes MBT. Heasman e Wylie estabelecido o método de transferência de acolhimento para superar esse problema 5. No método, os oócitos desfoliculados manualmente são injectados com oligonucleótidos anti-sentido e transferidos para fêmeas hospedeiras 6. As proteínas são reprimidos antes da fertilização, de modo que os papéis de proteínas downregulated no desenvolvimento embrionário precoce pode ser examinado. Este método de depleção materna levou à identificação de vários papéis de desenvolvimento únicas de proteínas maternas, como revisado em 7. Neste relatório, detalhamos o nosso método desenvolvido recentemente, em que a depleção materna ou sobre-expressão de mRNA antes da fertilização é conseguido sem defolliculation manual e transferência de acolhimento8. Defolliculation manual requer muito tempo e transferência de acolhimento muitas vezes precisa de técnicas hábeis e a licença específica para a cirurgia animal, dificultando, assim, o uso frequente de método de depleção materna. Defolliculation e transferência de acolhimento são substituídos por defolliculation enzimática 9,10 e injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) 11-13, respectivamente. ICSI a ovos foi originalmente usado para produzir rãs transgênicos 12. Esperma e embrionárias núcleos também foram transplantadas para in vitro de oócitos de anfíbios amadureceu 11,14,15. Aqui, vamos mostrar o nosso método passo-a-passo para injetar esperma para oócitos maturados in vitro que foram pré-injectados com oligos anti-sentido ou mRNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)&#160;</td>
			<td style="width:87px;">MSD Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">Vm 01708/4309</td>
			<td>PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Liberase TM Research Grade</td>
			<td style="width:87px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">05 401 127 001</td>
			<td>For oocyte defolliculation. Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:216px;">Drummond Nanoject</td>
			<td style="width:87px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">3-000-205/206</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Alpha laboratories</td>
			<td style="width:119px;">7&#8221; Drummond #3-000-203-G/XL</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:87px;">SUTTER Instrument</td>
			<td style="width:119px;">Model D-97</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td>For invitro maturation and ICSI</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">14 ml ultra-clear centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D1556</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digitonin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D141</td>
			<td>Cell permeabilization reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker</td>
			<td style="width:87px;">Hybaid&#160;</td>
			<td style="width:119px;">HB-SHK-1</td>
			<td>For oocyte defolliculation.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope (Stereo zoom microscope)</td>
			<td style="width:87px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">Semi SV6</td>
			<td>For oocyte collection and microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 &#956;m pore filter</td>
			<td style="width:87px;">CellTrics</td>
			<td style="width:119px;">04-0042-2317</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Optima L-100XP</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:87px;">Cellstar Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">227261 or 210261</td>
			<td>Oocyte collection and defolliculation reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">90 mm Petri dish&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">101VR20/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easy-Grip Cell Culture Dish, 60x15 mm</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easy-Grip Cell Culture Dish, 35x15 mm</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation and in vitro maturation of xenopus laevis oocytes, followed by intracytoplasmic sperm injection, to study embryonic development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

O desenvolvimento embrionário de embriões utilizando ICSI em oócitos maturados in vitro foi analisado (Figura 3A). As taxas de maturação dos oócitos GV para o palco MII são variáveis ​​e depende muito da qualidade do oócito. Em boas experiências, quase 100% dos oócitos GV responder a progesterona e mostrar sinais de maturação do oócito, finalmente se tornando ovos na fase MII. Todos os oócitos foram submetidos a ICSI e cerca de 25% dos ovos injectados clivados (Figura 3A, n = 13 para o controlo scrambled oócitos injectados com oligo e n = 7 para não oócitos injectados com oligo). Cerca de 60% ou 80% dos embriões clivados, produzidos a partir de oócitos injectados com oligo de controlo ou oócitos não injectados, respectivamente, atingiram o estádio de blástula / gástrula. Entre os embriões de blástula / gástrula, cerca de metade dos embriões injectados com amostras em oligo foram de boa qualidade (quase nenhum sinal de clivagem anormal e apoptose), enquanto que 82% dos embriões de blástula / gástrula foram de boa qualidade em namostras em injectados (Figura 3A). Por fim, 41% e 11% dos embriões injectados clivados em amostras de oligo-atingiu a resposta muscular e as fases natação girino, respectivamente, enquanto 60% e 29% dos embriões clivados em amostras não injectados fez (Figura 3A). Estes embriões são ICSI a mistura de embriões normais e anormais (Figura 3B). Alguns deles sofrem metamorfose e desenvolver a amadurecer rãs 8. Estes resultados sugerem que a injecção de oligonucleótidos anti-sentido em oócitos GV, seguido por IVM e ICSI, permite o desenvolvimento embrionário inicial eficiente. Embora a injeção de si oligos antisense diminui o desenvolvimento embrionário, que ainda são capazes de obter embriões suficientes para muitos fins experimentais, como verificar as taxas de desenvolvimento, RT-PCR, Western Blot e assim por diante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> Figo<html> ure 1: Os exemplos típicos de oócitos de Xenopus laevis de boa qualidade ou má qualidade de experimentos in vitro de maturação. (A) Um exemplo de oócitos de má qualidade. Por exemplo, os oócitos que mostram pigmentação irregular não são utilizadas para as experiências subsequentes. Cada oócito de Xenopus laevis é de cerca de 1,2-1,4 mm de diâmetro. (B) Um oócito parcialmente desfoliculados. A metade direita do oócito é coberta por células foliculares, os quais podem ser distinguidas pela presença de vasos sanguíneos. Uma seta mostra uma área livre de células do folículo e em que a agulha de injeção é injetado. (C) Um exemplo de oócitos de boa qualidade, que são do mesmo tamanho e mostram hemisférios animais uniformemente pigmentadas com claro contraste entre o hemisfério animal e do hemisfério vegetal. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Oócitos de Xenopus laevis, antes e após a maturação Após a maturação do oócito, claras manchas brancas aparecem no topo da hemisférios animais e células foliculares são descascadas. Cada laevis oócito Xenopus é de aproximadamente 1 mm de diâmetro. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Figura 3: Desenvolvimento de embriões de ICSI, produzidos a partir de oócitos maturados in vitro. (A) O desenvolvimento de embriões de ICSI para cada fase é resumido. Os oócitos foram injectados com oligonucleótidos anti-sentido de controlo scrambled (controlo) de injecção de oligo ou sem injecção (não injectável), seguido por IVM e ICSI. O número correspondente de embriões em cada fase é mostrado acima das barras. A média ± SEM é mostrado. N = 4-13 experiências independentes / f diferenteemales. (B) Exemplos de sobrevivência de embriões de ICSI. Estes embriões nos estágios tailbud foram produzidos de uma experiência, em que cerca de 200 oócitos foram usadas como um material de partida.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

22.0K visualizações.  University of Cambridge. We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.