We are grateful to Gurdon laboratory members for useful discussion. K.M. is a Research Fellow at Wolfson College and is supported by the Herchel Smith Postdoctoral Fellowship and the Great Britain Sasakawa Foundation. Gurdon laboratory is supported by grants from the Wellcome Trust (RG69899) and MRC to J.B.G.

<ol>
	<li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B., Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+amphibian+egg+to+understand+the+mammalian+oocyte.">Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte.</a> Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. , 1-11 (2013).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li><li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos.">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li><li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus.">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li><li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos.">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li><li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming.">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li><li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter.">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li><li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li><li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection.">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li><li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+'autocatalytic'+nature+of+the+maturation+promoting+factor+(MPF)+in+oocytes+of+Xenopus+laevis.">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens.">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li><li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes.">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes &amp; development. 25 (9), 946-958 (2011).</li><li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method.">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li><li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis).">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li><li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases.">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth &amp; differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 여기에 세부 산모의 요인을 고갈하거나 수정하기 전에 외생 적 요인을 과발현하는 새로운 방법. 이 시스템은 두 microinjections 필요하지만, 대신에 호스트 전송 방법에 사용 7,17 개구리 수술을 건너 뛴다. 그것은 동물 보호의 관점에서 개구리 수술 단계를 제거하는 최적이다. 또한, 우리는 우리가 실험의 성공에 영향을 미치는 하나의 생물학적 요인을 제거 할 수 있다는 것을 의미, 전송 실험에 대한 호스트 여성 개구리의 품질을 고려 할 필요가 없습니다. 따라서이 시스템에 PMSG 감작 개구리에서 얻은 난자의 질이 성공적으로 실험을위한 핵심 주요 생물학적 요인이다. 난자의 품질은 난소 또는 후 defolliculation의 수집 후 판단 할 수있다. 어떤 이상이 이러한 단계에서 관찰되는 경우, 새로운 개구리에서 다른 난소를 수집하는 최적이다. 당신이 난자의 품질을 확인하는 또 다른 점은 난자의 성숙 후입니다. progesteron의 경우 80 % 미만전자 처리 된 난자가 성숙의 징후를 보여, 당신은 더 분석을위한 배아의 충분한 수를 얻을 수없는 경우가 있습니다. 효소 defolliculation 대​​신 수동 defolliculation의 사용은 또한 defolliculation 필요한 시간을 삭감하는 본 시스템의 또 다른 장점이다. 그러나, 수동 defolliculation 효소 처리가보다 나은 개발을 줄 수 있다는 것을 여전히 가능하다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 시험 관내에서의 거의 10 %가 수영 올챙이 스테이지에 도달 할 수 난자 성숙. 이 자료는 8 및 새로운 주입 실험에서보고 된 13 개의 독립적 인 실험에서 수집됩니다. 호스트 전사 방법은 전사 난자 30-60 %의 neurula 스테이지 (17)에 도달 할 수 있기 때문에 의미있는 데이터를 얻기위한 각 난자 75-150 치료를 필요로한다. 우리의 방법은 일반적으로 절단 배아의 약 40-60%가 도달 할 수 있기 때문에 각 실험군에서 200 ~ 300 난자로 시작근육 응답 무대. 이러한 데이터는 두 가지 방법이 합리적인 개발 속도를 지원하는 것이 좋습니다. 우리는 지금까지이 방법은 변형을 통해 개발을 지원하는 것을 나타내는,이 기술을 사용하여 제어 mRNA의 주입 및 제어 안티센스 올리고 주입 된 난자에서 10 살아있는 개구리를 얻었다. 우리 난자 조작-ICSI 방법 곧 수정 후, 초기 배아 발달 동안 모체 인자의 역할을 테스트 할 수있는 기회를 제공한다. 또한, 수정 전에 염색질 수정 인자의 과발현은 가능한 개발에 필요한 산모의 염색질 상태를 이해하기위한 수정하기 전에 산모의 염색질을 개조 할 수 있습니다. 이 전략은 또한 이들도 수정하기 전에 표현 될 수 있기 때문에 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALEN) 18, 19 및 CRISPR / CAS9 (20, 21)로 현재 유전자 편집 시스템과 잘 작동 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 새로운 접근 방식은 potenti가알은 미래 많은 응용에 사용될 수있다.

아프리카 발톱 개구리 laevis의 개발 1 연구 널리 사용되는 강력한 모델 생물이다. 제노 푸스 달걀 풍부한 (포유 동물 대응 물에 비해 약 0.1 mm 인에 약 1.2-1.4 mm) 비정상적으로 큰 때문이다. 계란 (4,000-8,000 세포 단계 8-8.5에서 발생, MBT) 중간 포배 전이 될 때까지 배아 발달을 구동하기에 충분하다 모계 합성 및 저장 구성 요소가 포함되어 있습니다. MBT이어서 발전 지시 배아 유전자 산물을 생산 접합체 게놈 활성화를 수반한다. 많은 연구 개발을위한 중요한 산모 요인을 파악하는 것을 목표로. 많은 연구는 단백질의 경우 모계 저하 스테이지 낭배 2-4에서 관찰 될 수있는 수정 된 배아에 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 포함 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (올리고)의 주입에 의존한다. 대안 적으로,이 수정 된 mRNA를 주입하여 EMbryos 유전자 기능을 방해하거나 과발현 단백질의 운명을 추적. 그러나, 하나의 세포 단계 배아 내로 주입 정상적으로 MBT 전에 초기 배아 단계에서 모체 단백질의 발현 수준에 영향을 미치지 않는다. 와일리 Heasman 및 5는이 문제를 극복하기 위해 호스트 전송 방법을 확립. 이들 방법에서, 수동 defolliculated 난자 안티센스 올리고으로 주입되고, 호스트 (6)에 전송 암컷. 초기 배아 발달의 하향 조절 단백질의 역할을 조사 할 수 있도록 단백질을 하향 조절되기 전에 수정된다. 7에서 평가로서이 모체 공핍있어서, 모체 단백질의 몇몇 독특한 역할 발달 식별되었다. 수정 이전의 mRNA의 모성 결핍 또는 과잉 발현이 매뉴얼 defolliculation 및 호스트 전송없이 달성되는이 보고서, 우리는 세부 사항 우리의 최근에 개발 된 방법에서,8. 수동 defolliculation 시간과 호스트의 전송은 종종 많은 따라서 임산부 공핍 방법의 빈번한 사용을 방해하는, 숙련 된 기술과 동물의 수술 별 라이선스를 필요로 요구한다. Defolliculation 및 호스트 전송은 각각 효소 defolliculation 9, 10 및 세포질 내 정자 주입 (ICSI) 11 ~ 13로 치환된다. 계란 ICSI 원래 형질 개구리 (12)를 제조 하였다. 정자와 배아 핵은 체외 성숙 양서류의 난자 11,14,15에 이식했다. 여기, 우리가 있었던 체외 성숙 난자에 정자를 주입하는 단계별 방법을 보여 안티센스 올리고 또는 ​​mRNA의 사전을 주입.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)&#160;</td>
			<td style="width:87px;">MSD Animal Health</td>
			<td style="width:119px;">Vm 01708/4309</td>
			<td>PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Liberase TM Research Grade</td>
			<td style="width:87px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">05 401 127 001</td>
			<td>For oocyte defolliculation. Store at -20oC</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:216px;">Drummond Nanoject</td>
			<td style="width:87px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:119px;">3-000-205/206</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Alpha laboratories</td>
			<td style="width:119px;">7&#8221; Drummond #3-000-203-G/XL</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Puller&#160;</td>
			<td style="width:87px;">SUTTER Instrument</td>
			<td style="width:119px;">Model D-97</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td>For invitro maturation and ICSI</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">14 ml ultra-clear centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td>
			<td style="width:119px;">344060</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D1556</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digitonin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D141</td>
			<td>Cell permeabilization reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shaker</td>
			<td style="width:87px;">Hybaid&#160;</td>
			<td style="width:119px;">HB-SHK-1</td>
			<td>For oocyte defolliculation.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscope (Stereo zoom microscope)</td>
			<td style="width:87px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">Semi SV6</td>
			<td>For oocyte collection and microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 &#956;m pore filter</td>
			<td style="width:87px;">CellTrics</td>
			<td style="width:119px;">04-0042-2317</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Optima L-100XP</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:87px;">Cellstar Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">227261 or 210261</td>
			<td>Oocyte collection and defolliculation reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td>For sperm purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">90 mm Petri dish&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">101VR20/C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easy-Grip Cell Culture Dish, 60x15 mm</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Easy-Grip Cell Culture Dish, 35x15 mm</td>
			<td style="width:87px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation and in vitro maturation of xenopus laevis oocytes, followed by intracytoplasmic sperm injection, to study embryonic development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

체외 성숙 난자에 사용 ICSI 배아의 배아 개발 (그림 3A)를 조사 하였다. MII 단계에 GV 난자의 성숙 속도는 가변적 크게 난자의 품질에 따라 달라집니다. 좋은 실험에서, GV 난자의 거의 100 %가 마침내 MII 단계에서 계란되고, 난자의 성숙의 프로게스테론과 쇼 징후에 응답합니다. 모든 성숙 된 난자는 ICSI를 실시하고 주입 절단 계란의 약 25 % (그림 3A, N = 제어 (13)는 올리고 주입 난 모세포를 스크램블 N = 더 올리고 주입 난 모세포 7) 하였다. 약 60 % 또는 제어 올리고 주입 난 모세포 또는 비 - 주입 난 모세포로부터 생성 된 절단 배아의 80 %는 각각, 포배 / 스테이지 낭배 도달. 포배 / 낭배 배아의 82 %를 n에 좋은 품질의했다 반면 포배 / 낭 배기 배아 중 올리고 주입 시료에서 배아의 약 절반 (이상 분열 및 세포 사멸의 거의 흔적) 좋은 품질했다에 주입 된 샘플 (도 3A). 비 주입 시료에서 60 % 및 절단 배아의 29 %는 (그림 3A)를 한 동안 마지막으로, 41 % 및 올리고 주입 시료에서 절단 배아의 11 %는 각각 근육 반응과 수영 올챙이 단계에 도달했다. 이 ICSI 배아는 정상 및 비정상 배아 (그림 3B)의 혼합물이다. 그들 중 일부는 변형을 거쳐 개구리 8 성숙 개발한다. 이러한 결과는 IVM과 ICSI 다음 GV 난자에 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 주입, 효율적인 초기 배아 발달을 허용하는 것이 좋습니다. 안티센스 올리고 자체의 주입 배아 개발을 감소하지만, 우리는 여전히 성장 발달 검사로 많은 실험을 위해 충분한 배아를 획득 할 수 있으며, RT-PCR, 등등 웨스턴 블롯합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> 무화과<html> 우레 1 : 아프리카 발톱 개구리의 전형적인 예는 체외 성숙 실험을위한 좋은 품질 또는 나쁜 품질의 난자를 laevis의. (A) 나쁜 품질 난자의 예. 예를 들어, 곳곳에 색소 침착을 보여주는 난자 후속 실험에 사용되지 않습니다. 각 Xenopus의 난자는 직경 약 1.2-1.4 mm이다 laevis의. (B) 부분 defolliculated 난자. 난자의 우측 절반은 혈관의 존재에 의해 식별 될 수있는 모낭 세포에 의해 덮여있다. 화살표는 모낭 세포의 자유와 주사 바늘이 주입된다되는 영역을 도시한다. (C)의 동일한 크기이며 동물 반구 및 식물성 반구 사이에 명확한 명암 고르게 착색 동물 반구 표시 양질 난자의 예. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; 그림 2 :. Xenopus의 전과 후 성숙 난자를 laevis의 난자 성숙 후, 분명 흰색 반점 동물 반구 모낭 세포의 상단에 나타납니다 박리된다. 각 아프리카 발톱 개구리 laevis의 난자는 직경이 약 1mm이다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 체외 성숙 난자에에서 생산 ICSI 배아의 개발. 각 단계에 ICSI 배아의 (A) 개발이 요약되어있다. 컨트롤이 IVM과 ICSI 다음 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (제어 올리고 주입) 또는 주입 (비 주입)을하지 않고, 스크램블와 난 모세포가 주입되었다. 각 단계에서 배아의 해당 번호는 바 위에 표시됩니다. ± SEM이 표시됩니다 의미. N = 4-13 독립적 인 실험 / 다른 Females. (B) ICSI 배아 생존의 예. 이러한 tailbud 단계 배아 약 200 난자 출발 물질로서 사용 된 하나의 실험 제작 하였다.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

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Developmental Biology

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

22.0K 조회수.  University of Cambridge. We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.