We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual review of immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Dionne, M. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+infectious+diseases+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Models of infectious diseases in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Disease models &amp; mechanisms. 1 (1), 43-9 (2008).</li><li>Rutschmann, S., Jung, A. C., Hetru, C., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rel+protein+DIF+mediates+the+antifungal+but+not+the+antibacterial+host+defense+in+Drosophila.">The Rel protein DIF mediates the antifungal but not the antibacterial host defense in Drosophila.</a> Immunity. 12 (5), 569-580 (2000).</li><li>Ayres, J. S., Freitag, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+mutants+altering+defense+of+and+endurance+to+Listeria+monocytogenes+infection.">Identification of Drosophila mutants altering defense of and endurance to Listeria monocytogenes infection.</a> Genetics. 178 (3), 1807-1815 (2008).</li><li>Cronin, S. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+genes+involved+in+intestinal+pathogenic+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen identifies genes involved in intestinal pathogenic bacterial infection.</a> Science. 325 (5938), 340-343 (2009).</li><li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+Drosophila+immunity.">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. , (2014).</li><li>Dionne, M. S., Pham, L. N., Shirasu-Hiza, M., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+and+FOXO+dysregulation+contribute+to+infection-induced+wasting+in+Drosophila.">Akt and FOXO dysregulation contribute to infection-induced wasting in Drosophila.</a> Current biology CB. 16 (20), 1977-1985 (2006).</li><li>McKean, K. a., Yourth, C. P., Lazzaro, B. P., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+costs+of+immunological+maintenance+and+deployment.">The evolutionary costs of immunological maintenance and deployment.</a> BMC evolutionary biology. 8 (1), 76 (2008).</li><li>Kuo, T. -. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish.">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC neuroscience. 11, 17 (2010).</li><li>Panayidou, S., Ioannidou, E., Apidianakis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pathogenic+bacteria,+fungi,+and+viruses+in+Drosophila:+disease+modeling,+lessons,+and+shortcomings.">Human pathogenic bacteria, fungi, and viruses in Drosophila: disease modeling, lessons, and shortcomings.</a> Virulence. 5 (2), 253-269 (2014).</li><li>Keebaugh, E. S., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+natural+host&#8211;parasite+interactions:+The+Drosophila+model.">Insights from natural host&#8211;parasite interactions: The Drosophila model.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 42 (1), 111-123 (2014).</li><li>Howick, V. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+and+diet+shape+resistance+and+tolerance+across+distinct+phases+of+bacterial+infection.">Genotype and diet shape resistance and tolerance across distinct phases of bacterial infection.</a> BMC evolutionary biology. 14 (1), 56 (2014).</li><li>Babin, A., Kolly, S., Kawecki, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+bacterial+infection+improves+aversive+learning+performance+in+Drosophila.">Virulent bacterial infection improves aversive learning performance in Drosophila.</a> Brain, behavior, and immunity. , (2014).</li><li>Chambers, M. C., Song, K. H., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes+infection+causes+metabolic+shifts+in+Drosophila+melanogaster.">Listeria monocytogenes infection causes metabolic shifts in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50679 (2012).</li><li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+food+quality+affects+adult+(but+not+larval)+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition.">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li><li>Stone, E. F., Fulton, B. O., Ayres, J. S., Pham, L. N., Ziauddin, J., Shirasu-Hiza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila.">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS pathogens. 8 (1), e1002445 (2012).</li><li>Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thorax+injury+lowers+resistance+to+infection+in+Drosophila+melanogaster.">Thorax injury lowers resistance to infection in Drosophila melanogaster.</a> Infection and immunity. , (2014).</li><li>Rich, J. T., Neely, J. G., Paniello, R. C., Voelker, C. C. J., Nussenbaum, B., Wang, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+understanding+Kaplan-Meier+curves.">A practical guide to understanding Kaplan-Meier curves.</a> Otolaryngology--head and neck surgery official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 143 (3), 331-336 (2010).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J., Freeman, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biometry. , (1995).</li><li>Frydman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+bacterial+infection+in+Drosophila.">Wolbachia bacterial infection in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (2), 158 (2007).</li><li>Kuo, T. -. H., Handa, A., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+the+immune+response+and+sleep+in+Drosophila.">Quantitative measurement of the immune response and sleep in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (70), e4355 (2012).</li><li>Vodovar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+host+defense+after+oral+infection+by+an+entomopathogenic+Pseudomonas+species.">Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (32), 11414-11419 (2005).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster.">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS pathogens. 3 (11), e173 (2007).</li><li>Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+transmission+of+endosymbiotic+Spiroplasma+by+mites.">Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites.</a> Biology. 3 (1), 23-25 (2007).</li><li>Kanbar, G., Engels, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+bacterial+infection+of+wounds+in+honey+bee+(+Apis+mellifera)+pupae+punctured+by+Varroa+mites.">Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites.</a> Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

El procedimiento descrito aquí produce infección rigurosa y de alta calidad de Drosophila melanogaster. Los ejemplos ilustrados se centraron principalmente en la infección con Providencia rettgeri y E. coli, pero el protocolo es altamente adaptable y se puede aplicar a las infecciones con diversas bacterias sobre un rango de condiciones de cría de acogida y de mantenimiento. Los detalles de un enfoque experimental óptima dependerá de la bacteria utilizada para la infección, el genotipo del huésped, y las condiciones experimentales generales. Se recomienda encarecidamente a prueba piloto nuevas condiciones experimentales antes de iniciar los proyectos más ambiciosos. Un buen punto de partida es poner a prueba tres dosis de infección en un rango de 100 veces. Altamente patógenos virulentos son a menudo mejor introdujeron en dosis infecciosas muy bajas, del orden de 10 a 100 células bacterianas por mosca. Patógenos más moderadas pueden ser inyectados con dosis más altas de alrededor de 1.000 bacterias por fly, y los no patógenos pueden ser inyectados con dosis de hasta 10.000 bacterias por mosca. A menudo es instructiva para definir la cinética de nuevas infecciones por el seguimiento de la carga de patógenos, la mortalidad de acogida, y la actividad del sistema inmune a través de una serie de tiempo longitudinal. Dado que la medición de la carga de patógenos y la expresión génica de acogida son ensayos destructivos, es necesario para infectar las moscas distintas desde el principio del experimento para cada punto de tiempo que se va a medir. Al decidir si utilizar pinchazo o inyección a base de microcapilar, es importante tener en cuenta que hay ventajas y limitaciones de cada enfoque. Inyección capilar introduce un volumen de líquido en la marcha, que tanto aumenta la presión de turgencia y modestamente introduce sales u otras moléculas que están suspendidos o disueltos en el vehículo. Inyección capilar también requiere el acceso a un centro de inyección o compra de los equipos necesarios. Pinchazo séptico no requiere equipo e introduce especialmedios insignificantes en la marcha, y es típicamente más eficiente para infectar a un gran número de moscas. Sin embargo, las infecciones pinchazo no permiten el control preciso sobre dosis de infección que se puede lograr con la inyección capilar. El presente protocolo se centró en un aparato de inyección que regula mecánicamente volumen de inyección, pero también hay sistemas de inyección basado en pulsos discretos de aire a presión. 20,21 Estos son típicamente más caros que el aparato ofrece aquí y requieren de calibración del impulso de aire a cada aguja con el fin de asegurar volúmenes de inyección consistentes. Existe un considerable debate, pero muy pocos datos sobre cómo las moscas se convierten sistémicamente infectado con bacterias en el medio silvestre. Algunos investigadores postulan que la mayoría de las infecciones naturales se producen cuando Drosophila ingerir bacterias patógenas y las bacterias son capaces de escapar posteriormente el intestino para establecer una infección sistémica. Sin embargo, hay muy Febacterias w sabe que son capaces de atravesar el intestino de D. melanogaster, y los que sí tienen esta capacidad son altamente letal para las moscas 22,23. Una teoría alternativa es que vuela regularmente sufrir lesiones cuticulares través de escapar de los intentos fallidos de depredación o ataque de ácaros ectoparásitos. Esta hipótesis está apoyada por la recogida frecuente de salvaje D. melanogaster teniendo manchas melanization que son indicativos de heridas cicatrizadas (observaciones no publicadas). Los ácaros se han demostrado para transmitir infecciones bacterianas en Drosophila y 24 heridas dejadas por los ácaros pueden ser secundariamente infectadas por bacterias en las abejas de miel 25. Sin embargo, la frecuencia en la naturaleza de la infección-ácaros impulsado o de otra manera oportunista de D. melanogaster través de las infracciones de la cutícula no se conoce. El protocolo descrito aquí permite la introducción de bacterias directamente en la hemolinfa través de la inyección cuantitativa que evita cualquier barreras epiteliales o Immu de comportamientonidad. Métodos para la alimentación de las bacterias patógenas a D. melanogaster han sido descritos en Vodovar et al. 22 y Nehme et al. 23. Muchas bacterias entomopatógenos representan poco o ningún riesgo para la salud humana, lo que permite a los investigadores a trabajar con ellos cómodamente. Además, muy pocas bacterias tienen la capacidad de infectar a Drosophila en contacto sin intervención experimental, por lo que el riesgo de &quot;epidemia&quot; propagación de la infección bacteriana a través de un laboratorio a través de superficies contaminadas o escaparon moscas es generalmente muy baja. No obstante, es recomendable asegurarse de que las medidas de contención adecuadas en el lugar para evitar que las moscas infectadas se escape y para recuperar cualquier moscas escaparon. El laboratorio debe ser equipado a un nivel de seguridad biológica en consonancia con la de los agentes patógenos que se utiliza, y se debe emplear las mejores prácticas estándar en microbiología. El infecti experimentalen el método descrito aquí permite infecciones de Drosophila melanogaster con cualquier dosis de cualquier bacteria arbitraria. Una vez que la infección se ha establecido, es sencillo para medir la cinética de proliferación o la eliminación de bacterias, el seguimiento de la mortalidad acogida, y para ensayo de inducción del sistema inmune del huésped. Moscas infectadas pueden ser fácilmente sometidos a otros ensayos fenotípicos, incluyendo pruebas de funciones fisiológicas que pueden dar forma o se forma por la infección. Los procedimientos descritos son de bajo costo, requieren relativamente poco equipo especializado, y se aprenden fácilmente, haciéndolos susceptibles para su uso en diversos proyectos a través de una amplitud de laboratorios de investigación y docencia.

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es uno de los organismos modelo de primera clase para el estudio de la función y la evolución de la defensa inmune. Drosophila son baratos y fáciles de criar, son altamente susceptibles a la manipulación experimental, y están respaldados por una amplia comunidad científica que ha desarrollado una amplia variedad de herramientas de investigación. Muchos aspectos de la inmunidad innata se conservan entre los insectos y mamíferos, incluyendo la transducción de señales mediada por los receptores Toll-like y NF-kB factores de transcripción de la familia, de señalización JAK / STAT, y las respuestas de la vía JNK. 1,2 La función de estos genes y vías lata ser consultados en el D. melanogaster mediante mutaciones o RNAi caídas que aumentan o vía disminución actividades. 3 - 6 Además, Drosophila se puede utilizar para estudiar las consecuencias fisiológicas de la infección y la enfermedad, incluso en el contexto de la teoría evolutiva historia de vida 7.- 9 Todos estos estudios, sin embargo, dependen de la capacidad de infectar de forma fiable moscas experimentales bajo condiciones de tratamiento definidos. El procedimiento descrito aquí presenta un marco metodológico para la entrega de infecciones bacterianas robustos y repetibles a Drosophila melanogaster y posteriormente medir la gravedad de la infección y la cuantificación de la respuesta inmune del huésped. Drosophila puede ser natural y experimentalmente infectado por una amplia variedad de parásitos y agentes patógenos, incluyendo bacterias, hongos, virus, nematodos y avispas parasitoides. El protocolo actual se centra en la entrega de la infección bacteriana sistémica. Muchas bacterias diferentes se pueden utilizar para infectar las moscas, y la elección del experimentador deben basarse en las cuestiones científicas precisas que nos pidieron. Por ejemplo, los aislados clínicos humanos se pueden emplear para estudiar los mecanismos de virulencia bacteriana 10, o ecológicamente cepas pertinentes pueden ser preferred para el estudio de la evolución. 11 Algunas bacterias son patógenos competentes de D. melanogaster, la proliferación tras la infección y causar la enfermedad de host o la muerte. Otras bacterias se administran eficazmente por el sistema inmune del huésped y borran dentro de unos pocos días. En esta demostración, Providencia rettgeri será utilizado como un patógeno proliferativa que puede causar la mortalidad de acogida y persiste en huéspedes supervivientes. Escherichia coli se utilizará como un no patógeno que se elimina por el sistema inmune del huésped. La infección se estableció mediante la introducción de bacterias directamente en la cavidad del cuerpo de la mosca. Este enfoque evita las barreras epiteliales y comportamientos de protección, lo que permite la investigación de la infección sistémica con independencia del modo natural de transmisión. Hay dos métodos principales para establecer experimentalmente la infección sistémica. En el primero, un nanoinjector y capilares de vidrio tirado agujas se utilizan para inyectar un número preciso debacterias en la marcha. Este método tiene las ventajas de permitir un gran rango dinámico de dosis de infección y de ser cuantitativamente altamente repetible. El segundo enfoque es entregar la infección con un pinchazo séptico. Este enfoque tiene las ventajas de ser rápido y no requiere equipo especial. Una vez establecidas las infecciones, se hace posible medir la carga sistémica patógeno, la mortalidad de acogida, y la actividad inducible sistema inmunológico. Por supuesto, cualquier número de fenotipos adicionales posiblemente podría medirse en D. infectada melanogaster, incluyendo post-infección fecundidad 12, la capacidad de aprendizaje 13, estado metabólico 14, o prácticamente cualquier otro rasgo que se puede imaginar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Reagent</td>
			<td style="width:239px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Part Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Incubator</td>
			<td style="width:239px;">Powers Scientific, Inc</td>
			<td style="width:177px;">DROS52SD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">CO2 Flypads</td>
			<td style="width:239px;">FlyStuff</td>
			<td style="width:177px;">59-114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">CO2</td>
			<td style="width:239px;">Airgas</td>
			<td>CD FG50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Drosophila rearing mix&#160;</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene</td>
			<td style="width:239px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:177px;">32-130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nosterile Extra Large Cotton Balls</td>
			<td style="width:239px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:177px;">22-456-882</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:177px;">SZ51</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Drosophila Vials polystyrene</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">89092-720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nosterile Large Cotton Balls</td>
			<td style="width:239px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:177px;">22-456-883</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">2L flask</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td>89000-370</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm;</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">25384-302</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LB Agar, Miller</td>
			<td style="width:239px;">Difco</td>
			<td style="width:177px;">244520</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Innoculing Loop</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td>80094-488</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:399px;">Rainin Clasic Pipettes in various sizes 
			0.1 &#181;l to 2 &#181;l, 
			2 &#181;l to 20 &#181;l, 
			20 &#181;l to 200 &#181;l, 
			100 &#181;l to 1000</td>
			<td style="width:239px;">Rainin</td>
			<td style="width:177px;">PR-2 
			PR-20 
			PR-200 
			PR-1000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Micropipette tips (assorted sizes)</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">30128-376 
			53503-810 
			16466-008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth Base, Miller</td>
			<td style="width:239px;">Difco</td>
			<td>241420</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">47729-576</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">S-500 Orbital Shaker</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">14005-830</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">37001-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">PBS pH 7.4 10x</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">70011044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">170-2501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Semimicrovolume Cuvettes</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">223-9955</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Vertical Capillary Puller</td>
			<td style="width:239px;">Kopf Needle Pipette Puller</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">3.5&#39;&#39; Replacement glass Capillaries for Nanojet II</td>
			<td style="width:239px;">Drummond Sientific Company</td>
			<td style="width:177px;">3-000-203-G/X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nanoject II</td>
			<td style="width:239px;">Drummond Sientific Company</td>
			<td style="width:177px;">3-000-204</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:177px;">11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">10mL Syringe</td>
			<td style="width:239px;">BD</td>
			<td style="width:177px;">309604</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil, White, light</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6358-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">minutein pins</td>
			<td style="width:239px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:177px;">26002-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1.5mL&#160; Microcentrifuge tubes; Seal Rite</td>
			<td style="width:239px;">USA Scientific Inc.</td>
			<td style="width:177px;">1615-5500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer</td>
			<td style="width:239px;">Troemner</td>
			<td style="width:177px;">103</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:239px;">OPS Diagnostics</td>
			<td style="width:177px;">930145</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5/32&#39;&#39; Grinding Balls</td>
			<td>OPS Diagnostics</td>
			<td style="width:177px;">GBSS 156-5000-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Vortex Genie</td>
			<td style="width:239px;">Scientific indurstries inc.</td>
			<td style="width:177px;">G560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Multichannel Pipettor (10uL-300uL)</td>
			<td style="width:239px;">Sartorius</td>
			<td>730360</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td>
			<td style="width:239px;">Microbiology International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Microbiology International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">TRIzol</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:177px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">TLS0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">TCS0803</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">m610a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">m170b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">dNTPs</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">U1240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oligo-dT</td>
			<td style="width:239px;">IDT</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">&#160;SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">172-5260</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">185-5200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in drosophila melanogaster

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es uno de los organismos modelo de primera clase para el estudio de la función y la evolución de la defensa inmune. Muchos aspectos de la inmunidad innata se conservan entre insectos y mamíferos, y desde Drosophila puede ser fácilmente manipulado genéticamente y experimentalmente, que son de gran alcance para el estudio de la función del sistema inmune y las consecuencias fisiológicas de la enfermedad. El procedimiento ha demostrado aquí permite la infección de las moscas por la introducción de bacterias directamente en la cavidad del cuerpo, por encima de las barreras epiteliales y formas más pasivas de defensa y permitiendo enfoque en la infección sistémica. El procedimiento incluye protocolos para las tasas de mortalidad de medición anfitrión, la carga de patógenos sistémica, y el grado de inducción del sistema inmune del huésped. Este procedimiento de infección es barato, robusto y cuantitativamente repetible, y se puede utilizar en estudios de genética funcional, la historia evolutiva, la vida y la fisiología.

Esta sección ilustra los resultados que se pueden obtener después de la infección bacteriana de Drosophila melanogaster. Figura 1 muestra que dosis de infección varía con la densidad óptica de la suspensión bacteriana utilizada para la inyección, y que la dosis administrada puede ser estimado de manera fiable por homogeneización y el chapado vuela inmediatamente después de la inyección . Como se ilustra en la Figura 2, diferentes patógenos pueden causar diferentes niveles de mortalidad host (Figura 2A) y la mortalidad huésped puede ser (Figura 2B) dependiente de la dosis. Es importante destacar que este protocolo permite diferentes tipos de infecciones que deben alcanzarse: Providencia rettgeri puede causar una infección crónica, subletal que persiste durante 20 días o más (Figura 3A). Sin embargo, otras bacterias como Escerichia coli mayormente se borrarán por la mosca de acogida dentro de seis horas después de la infección (Figura 3B). La inducción de los sys inmunesTEM se puede estimar a través de aislamiento de ARN y posterior qRT-PCR de los transcritos de péptidos antibacterianos (Figura 4A y B). Análogamente pero menos cuantitativamente, las moscas que expresan GFP bajo el control de promotores de genes de péptido antimicrobiano puede ser utilizado para visualizar la inducción del sistema inmune (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Figura 1: Determinación de la dosis infecciosa Las moscas fueron inyectados con 50 nl de suspensiones bacterianas que cubren una gama de densidades ópticas (0,0001 a 0,05). Las moscas fueron inmediatamente homogeneizada y se sembraron para determinar el número de bacterias introducido por la inyección. Carga bacteriana inicial se correlaciona fuertemente con OD inicial inyectada (r 2 = 0,96) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2:. supervivencia después de la inyección con patógenos bacterianos Cinco a siete machos viejos día se inyectaron con 50 nl de cualquiera de suspensión bacteriana o medios estériles y se controló para la supervivencia. (A) Tipo de moscas salvajes fueron inyectados con aproximadamente 5.000 bacterias de de una de las tres especies diferentes. La tasa de mortalidad huésped depende en gran medida de las especies bacterianas usadas para la infección. (B) Tipo moscas salvajes fueron inyectados con tres dosis diferentes de Enterococcous faecalis - 50, 500, y 5000 bacterias por mosca. Las moscas mueren más rápidamente cuando se infectan con dosis más altas infecciosas (C) Un mutante sistema inmune y su línea de control isogénicas de tipo salvaje fueron inyectados con aproximadamente 500 Burkholderia cepacia. Una comparación por parejas Log-Rank muestra que la mosca de tipo salvaje sobrevive a la infección significativamente mejor que el mutante (χ 2 = 59,02, df = 1, p &lt;0,0001). Figura 3:. Carga bacteriana después de la inyección Las moscas fueron inyectados con aproximadamente (A) 5000 P. rettgeri (B) 3400 E. coli. La carga bacteriana se determinó inmediatamente después de la inyección y en varios puntos de tiempo posteriores. Cada punto de datos representa la carga bacteriana de una sola mosca. E. coli se elimina rápidamente de anfitriones impugnados mientras que P. rettgeri persiste durante el resto de la vida del anfitrión ,. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Figura 4: Inducción de la expresión génica inmune después de la inyección. Las moscas (A) se inyectaron con 50 nl de P. PBS rettgeri o estéril, ya sea en el abdomen o el tórax, o se dejaron sin manipular aparte de CO <sub&gt; 2 anestesia. Seis horas después de la infección, las moscas fueron recolectados para el aislamiento de ARN y la expresión de la Diptericin Un gen se determinó utilizando qRT-PCR. (A) Los niveles de expresión se representan gráficamente como la relación de Diptericin Una transcripción de transcripción rp49 y ampliarse de manera que el control de CO 2 se define como tener un nivel de expresión de 1. Las barras representan la media y el error estándar de las proporciones de cada condición (n = 4). Niveles (B) de expresión se grafican como ΔΔCT 2 con el valor promedio de C T de CO 2 de control de moscas aesthesia utilizados como la condición no inducido estándar. Las barras representan el error medio y estándar de ΔΔC T de cada condición (n = 4). Mientras que no hay diferencia en la inducción de la transcripción debido a sitio de la inyección, la comparación de los paneles A y B muestra cómo el método ΔΔC T potencialmente puede sobreestimar los niveles de inducción. (C) Moscas que expresan GFP bajo el control del Diptericin Un promotor se inyectaron con 50 nl de P. rettgeri (OD = 0,1) y luego fotografiada 7 días más tarde. El panel de GFP muestra la expresión de GFP en el cuerpo la grasa abdominal de moscas infectadas, lo que indica la activación de la Diptericin Un promotor en las moscas infectadas por bacterias, pero no los controles con inyección de medios de comunicación. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gene </td><td> Adelante </td><td> Reverse </td></tr><tr><td> rp49 (también llamado RPL32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin A </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensina </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin A </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Los cebadores para QRT-PCR.

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Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

24.3K vistas.  Cornell University. Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.