We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual review of immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Dionne, M. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+infectious+diseases+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Models of infectious diseases in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Disease models &amp; mechanisms. 1 (1), 43-9 (2008).</li><li>Rutschmann, S., Jung, A. C., Hetru, C., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster.">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS pathogens. 3 (11), e173 (2007).</li><li>Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+transmission+of+endosymbiotic+Spiroplasma+by+mites.">Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites.</a> Biology. 3 (1), 23-25 (2007).</li><li>Kanbar, G., Engels, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+bacterial+infection+of+wounds+in+honey+bee+(+Apis+mellifera)+pupae+punctured+by+Varroa+mites.">Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites.</a> Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

O procedimento descrito aqui produz infecção rigorosa e de alta qualidade de Drosophila melanogaster. Os exemplos ilustrados focado principalmente na infecção com Providencia rettgeri e E. coli, mas o protocolo é extremamente adaptável e pode ser aplicada a diversas infecções com bactérias ao longo de um intervalo de condições de criação de acolhimento e de manutenção. Os detalhes de uma abordagem experimental óptimo dependerá da bactéria utilizada para a infecção, o genótipo do hospedeiro e as condições experimentais gerais. É altamente recomendável para teste piloto quaisquer novas condições experimentais antes de iniciar projetos mais ambiciosos. Um bom ponto de partida é testar três doses de infecção ao longo de um intervalo de 100 vezes. Altamente patógenos virulentos são muitas vezes melhor introduzido em doses infecciosas muito baixos, na ordem de 10-100 células bacterianas por mosca. Agentes patogénicos mais moderadas podem ser injectados com doses mais elevadas de cerca de 1.000 bactérias por FLY, e não-patogénicos pode ser injectado em doses tão elevadas como 10.000 bactérias por mosca. Muitas vezes, é instrutivo para definir a cinética de infecções novas, acompanhando carga de patógenos, a mortalidade de acolhimento, e atividade do sistema imunológico através de uma série de tempo longitudinal. Como medida de carga de patógenos e de expressão génica do hospedeiro são ensaios destrutivos, é necessário infectar moscas distintas no início da experiência para cada ponto de tempo que é para ser medida. Ao decidir se quer usar ou picada de agulha de injeção baseada microcapilar, é importante notar que há vantagens e limitações de cada abordagem. Injecção capilar apresenta um volume de líquido para dentro da mosca, que tanto aumenta modestamente a pressão de turgescência e introduz sais ou outras moléculas que estão suspensos ou dissolvidos no veículo. Injeção capilar também exige o acesso a uma instalação de injecção ou compra do equipamento necessário. Alfinetada fossa séptica não requer nenhum equipamento especial e introduzmídia negligenciáveis ​​na mosca, e é normalmente mais eficiente para infectar um grande número de moscas. No entanto, as infecções pinprick não permitem o controlo preciso sobre a dose de infecção que pode ser conseguido com injecção capilar. O presente protocolo focada em um aparelho de injecção que regula mecanicamente volume de injecção, mas também são baseados em sistemas de injecção de pulsos discretos de ar pressurizado. 20,21 Estes são tipicamente mais caro do que o aparelho apresentado aqui e requerem calibração do impulso de ar para cada agulha, a fim de assegurar o volume de injecção consistente. Há um debate considerável, mas muito poucos dados sobre como se tornar sistemicamente moscas infectadas com a bactéria em estado selvagem. Alguns investigadores postulam que a maioria das infecções naturais ocorrem quando Drosophila ingerir bactérias patogénicas e as bactérias são capazes de escapar posteriormente do intestino para estabelecer uma infecção sistémica. No entanto, existem muito few bactérias conhecidas como sendo capazes de atravessar o intestino de D. melanogaster, e aqueles que têm essa capacidade são altamente letal para moscas 22,23. Uma teoria alternativa é que voa regularmente sustentar os ferimentos cuticulares através de fuga de tentativas fracassadas de predação ou o ataque de ácaros ectoparasitas. Esta hipótese é apoiada pela coleta frequente de D. selvagem melanogaster tendo pontos melanização que são indicativos de feridas cicatrizadas (observações não publicadas). Os ácaros foram mostrados para transmitir infecções bacterianas em Drosophila 24 e feridas deixadas por ácaros pode ser secundariamente infectadas por bactérias em abelhas de mel 25. No entanto, a freqüência na natureza da infecção do ácaro-driven ou de outra forma oportunista de D. melanogaster através de violações de cutícula não é conhecido. O protocolo descrito aqui permite introdução de bactérias diretamente na hemolinfa através de injeção quantitativo que ignora quaisquer barreiras epiteliais ou IMMU comportamentaisnidade. Métodos para a alimentação de bactérias patogénicas para D. melanogaster têm sido descritos em Vodovar et al. 22 e Nehme et ai. 23. Muitas bactérias entomopatogênicos representam pouco ou nenhum risco a saúde humana, permitindo aos pesquisadores para trabalhar com eles confortavelmente. Além disso, muito poucas bactérias têm a capacidade de infectar de Drosophila em contacto sem intervenção experimental, de modo que o risco de &quot;epidemia&quot; propagação da infecção bacteriana através de um laboratório através de superfícies contaminadas ou escapou moscas é geralmente muito baixa. No entanto, é aconselhável para assegurar que as medidas de contenção adequados estão no lugar para evitar moscas infectadas de escapar e para recapturar qualquer escapou moscas. O laboratório deve ser equipado com um nível de segurança biológica comensurável com a dos agentes patogénicos que está sendo utilizado, e melhores práticas padrão em microbiologia deve ser empregue. O infecti experimentalno método descrito aqui permite infecções de Drosophila melanogaster com qualquer dose de qualquer bactéria arbitrária. Uma vez que a infecção tenha sido estabelecido, é simples para medir a cinética de proliferação bacteriana ou recarga, para acompanhar a mortalidade hospedeiro, e a ensaio de indução do sistema imunitário do hospedeiro. Moscas infectadas podem facilmente ser submetido a outros ensaios fenotípicos, incluindo testes de funções fisiológicas que podem moldar ou ser moldados pela infecção. Os procedimentos descritos são baratos, requerem relativamente pouco equipamento especializado, e são facilmente aprendido, tornando-os propícios para o uso em diversos projetos através de uma amplitude de laboratórios de pesquisa e de ensino.

A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um dos organismos modelo premier para estudar a função e evolução de defesa imunológica. Drosophila são baratos e fáceis de criar, são altamente passíveis de manipulação experimental, e são apoiados por uma extensa comunidade científica que desenvolveu uma ampla conjunto de ferramentas de pesquisa. Muitos aspectos da imunidade inata são conservadas entre insectos e mamíferos, incluindo a transdução de sinal mediada por receptores Toll-like e NF-kB, factores de transcrição da família de sinalização de JAK / STAT, e as respostas das vias JNK. 1,2 A função destes genes e vias lata ser consultado em D. melanogaster usando mutações ou RNAi knockdowns que as actividades de aumento ou diminuição da via. 3 - 6 Além disso, Drosophila pode ser usado para estudar as conseqüências fisiológicas de infecções e doenças, incluindo no contexto da teoria da história de vida evolutiva 7.- 9 Todos esses estudos, no entanto, depender da capacidade de infectar de forma fiável moscas experimentais sob condições de tratamento definidos. O procedimento aqui descrito apresenta um quadro metodológico para a entrega de infecções bacterianas robustos e repetíveis para Drosophila melanogaster e, posteriormente, medindo a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro. Drosophila pode ser natural e experimentalmente infectados por uma grande variedade de parasitas e organismos patogénicos, incluindo bactérias, fungos, vírus, nematóides e vespas parasitóides. O protocolo atual está focada no fornecimento infecção bacteriana sistêmica. Muitas bactérias diferentes podem ser usados ​​para infectar as moscas, e escolha do experimentador deve basear-se nas questões científicas precisas ser perguntado. Por exemplo, isolados clínicos humanos podem ser utilizados para estudar os mecanismos de virulência da bactéria 10, ou ecologicamente isolados relevantes podem ser preferred para o estudo evolutivo 11. Algumas bactérias são patógenos competentes do D. melanogaster, proliferando em cima de infecção e causando doença host ou morte. Outras bactérias são efectivamente controlado pelo sistema imunitário do hospedeiro e aclarado em poucos dias. Nesta demonstração, Providencia rettgeri vai ser utilizado como um agente patogénico proliferativa que pode causar mortalidade hospedeiro e persiste em sobreviventes hospedeiros. Escherichia coli vai ser utilizado como um agente patogénico que não é eliminado pelo sistema imunitário do hospedeiro. Infecção será estabelecido pela introdução de bactérias directamente para dentro da cavidade do corpo da mosca. Esta abordagem ignora barreiras epiteliais e comportamentos de proteção, permitindo a investigação de infecção sistêmica, independentemente do modo natural de transmissão. Existem dois métodos principais para estabelecer experimentalmente infecção sistêmica. Na primeira, uma nanoinjector capilares de vidro e puxado agulhas são utilizadas para injectar um número exacto debactérias na mosca. Este método tem a vantagem de permitir uma grande gama dinâmica de doses de infecção e de ser quantitativamente altamente repetível. A segunda abordagem é a de proporcionar a infecção com uma picada de agulha séptico. Esta abordagem tem as vantagens de ser rápida e não necessitando de equipamento especial. Uma vez estabelecidas as infecções, torna-se possível medir a carga sistêmica do patógeno, a mortalidade de acolhimento, e atividade do sistema imunológico induzível. É claro, qualquer número de fenótipos adicionais podem concebivelmente ser medidos em D. infectada melanogaster, incluindo pós-infecção fecundidade 12, capacidade de aprendizagem 13, estado metabólico 14, ou virtualmente qualquer outro traço que pode ser imaginado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Reagent</td>
			<td style="width:239px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Part Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Incubator</td>
			<td style="width:239px;">Powers Scientific, Inc</td>
			<td style="width:177px;">DROS52SD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">CO2 Flypads</td>
			<td style="width:239px;">FlyStuff</td>
			<td style="width:177px;">59-114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">CO2</td>
			<td style="width:239px;">Airgas</td>
			<td>CD FG50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Drosophila rearing mix&#160;</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene</td>
			<td style="width:239px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:177px;">32-130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nosterile Extra Large Cotton Balls</td>
			<td style="width:239px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:177px;">22-456-882</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:177px;">SZ51</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Drosophila Vials polystyrene</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">89092-720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nosterile Large Cotton Balls</td>
			<td style="width:239px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:177px;">22-456-883</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">2L flask</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td>89000-370</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm;</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">25384-302</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LB Agar, Miller</td>
			<td style="width:239px;">Difco</td>
			<td style="width:177px;">244520</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Innoculing Loop</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td>80094-488</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:399px;">Rainin Clasic Pipettes in various sizes 
			0.1 &#181;l to 2 &#181;l, 
			2 &#181;l to 20 &#181;l, 
			20 &#181;l to 200 &#181;l, 
			100 &#181;l to 1000</td>
			<td style="width:239px;">Rainin</td>
			<td style="width:177px;">PR-2 
			PR-20 
			PR-200 
			PR-1000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Micropipette tips (assorted sizes)</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">30128-376 
			53503-810 
			16466-008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth Base, Miller</td>
			<td style="width:239px;">Difco</td>
			<td>241420</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">47729-576</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">S-500 Orbital Shaker</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">14005-830</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">37001-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">PBS pH 7.4 10x</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">70011044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">170-2501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Semimicrovolume Cuvettes</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">223-9955</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Vertical Capillary Puller</td>
			<td style="width:239px;">Kopf Needle Pipette Puller</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">3.5&#39;&#39; Replacement glass Capillaries for Nanojet II</td>
			<td style="width:239px;">Drummond Sientific Company</td>
			<td style="width:177px;">3-000-203-G/X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nanoject II</td>
			<td style="width:239px;">Drummond Sientific Company</td>
			<td style="width:177px;">3-000-204</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:177px;">11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">10mL Syringe</td>
			<td style="width:239px;">BD</td>
			<td style="width:177px;">309604</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil, White, light</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6358-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">minutein pins</td>
			<td style="width:239px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:177px;">26002-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1.5mL&#160; Microcentrifuge tubes; Seal Rite</td>
			<td style="width:239px;">USA Scientific Inc.</td>
			<td style="width:177px;">1615-5500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer</td>
			<td style="width:239px;">Troemner</td>
			<td style="width:177px;">103</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:239px;">OPS Diagnostics</td>
			<td style="width:177px;">930145</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5/32&#39;&#39; Grinding Balls</td>
			<td>OPS Diagnostics</td>
			<td style="width:177px;">GBSS 156-5000-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Vortex Genie</td>
			<td style="width:239px;">Scientific indurstries inc.</td>
			<td style="width:177px;">G560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Multichannel Pipettor (10uL-300uL)</td>
			<td style="width:239px;">Sartorius</td>
			<td>730360</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td>
			<td style="width:239px;">Microbiology International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Microbiology International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">TRIzol</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:177px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">TLS0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">TCS0803</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">m610a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">m170b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">dNTPs</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">U1240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oligo-dT</td>
			<td style="width:239px;">IDT</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">&#160;SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">172-5260</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">185-5200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in drosophila melanogaster

A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um dos organismos modelo premier para estudar a função e evolução de defesa imunológica. Muitos aspectos da imunidade inata são conservadas entre insectos e mamíferos, e uma vez que a Drosophila pode ser facilmente manipulado geneticamente e experimentalmente, que são poderosos para estudar a função do sistema imunitário e as consequências fisiológicas da doença. O processo demonstrado aqui permite a infecção de moscas através da introdução de bactérias directamente na cavidade do corpo, contornando barreiras epiteliais e formas mais passivas de defesa e permitindo que o foco sobre a infecção sistémica. O procedimento inclui protocolos para medir as taxas de mortalidade de acolhimento, carga patógeno sistémica, e grau de indução do sistema imunitário do hospedeiro. Este procedimento de infecção é barato, robusto e quantitativamente reprodutível, e pode ser utilizado em estudos de genética funcional, história de vida evolucionária, e fisiologia.

Esta secção ilustra os resultados que podem ser obtidos após a infecção bacteriana de Drosophila melanogaster. A Figura 1 mostra que a dose de infecção varia com a densidade óptica da suspensão bacteriana utilizada para a injecção, e que a dose administrada pode ser estimado de forma fiável por homogeneização e revestimento voa imediatamente após a injecção . Tal como ilustrado na Figura 2, diferentes agentes patogénicos podem causar diferentes níveis de mortalidade de acolhimento (Figura 2A) e de mortalidade hospedeira pode ser (Figura 2B), dependente da dose. Importante, este protocolo permite que diferentes tipos de infecções a atingir: Providencia rettgeri pode causar uma infecção crónica, sub-letal que persiste durante 20 dias ou mais (Figura 3A). No entanto, outras bactérias como Escerichia coli vai ser maioritariamente apuradas pela mosca acolhimento no prazo de seis horas após a infecção (Figura 3B). A indução dos sys imunesTEM pode ser estimado através do isolamento de ARN e subsequente qRT-PCR de transcritos de péptidos antibacterianos (Figura 4A e B). De forma análoga, mas menos quantitativamente, moscas expressando GFP sob o controlo de promotores de gene de um péptido antimicrobiano pode ser utilizado para visualizar a indução do sistema imunitário (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Figura 1: Determinação Dose Infecciosa Moscas foram injectados com 50 nl de suspensões bacterianas que cobrem uma gama de densidades ópticas (,0001-,05). As moscas foram imediatamente homogeneizados e plaqueados para determinar o número de bactérias introduzidas por injecção. A carga bacteriana inicial se correlaciona fortemente com o OD inicial injectado (r 2 = 0,96) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2:. A sobrevida após injeção com bacterianas Pathogens Cinco a sete dias homens de idade foram injectados com 50 nl de qualquer suspensão bacteriana ou meios estéreis e monitorados para a sobrevivência. (A), as moscas de tipo selvagem foram injetados com aproximadamente 5.000 bactérias a partir de uma das três espécies diferentes. A taxa de mortalidade do hospedeiro depende fortemente das espécies bacterianas utilizadas para a infecção. (B) Tipo Selvagem moscas foram injectados com três doses diferentes de Enterococcous faecalis - 50, 500, e 5.000 bactérias por mosca. Moscas morrem mais rapidamente quando infectados com doses superiores infecciosas (C) Um mutante sistema imunológico e sua linha de controle isogênica de tipo selvagem foram injetados com aproximadamente 500 Burkholderia cepacia. Uma comparação aos pares de Log-Rank mostra que o de tipo selvagem mosca sobrevive à infecção significativamente melhor do que o mutante (χ 2 = 59,02, df = 1, p &lt;0,0001). Figura 3:. A carga bacteriana após injeção moscas foram injectados com aproximadamente (a) 5000 P. rettgeri (B) 3400 E. coli. A carga bacteriana foi determinada imediatamente após a injecção e em vários pontos de tempo subsequentes. Cada ponto de dados representa a carga bacteriana de uma única mosca. E. coli é rapidamente eliminado do anfitriões desafiados enquanto P. rettgeri persistir para o resto da vida do hospedeiro ,. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Figura 4: Indução de Expressão Gênica imune após a injeção. (A) As moscas foram injectados com 50 nl de P. PBS rettgeri ou estéril tanto no abdómen ou tórax, ou foram deixados de lado unmanipulated de CO <sub&gt; 2 anestesia. Seis horas após a infecção, as moscas foram recolhidas para isolamento de ARN e a expressão do Diptericin Um gene foi determinada por meio de qRT-PCR. (A) Os níveis de expressão são representados graficamente como a razão entre Diptericin A transcrição de rp49 transcrição e dimensionado de tal modo que o controlo de CO 2 é definida como possuindo um nível de expressão 1. As barras representam a média e o erro padrão de rácios de cada condição (n = 4). Níveis (B) de expressão são representadas graficamente como um ΔΔCT 2 com o valor de C T média de CO 2 aesthesia moscas de controle usados ​​como a condição não induzida padrão. As barras representam o erro médio e padrão da ΔΔC T a partir de cada condição (n = 4). Embora não exista uma diferença na indução da transcrição devido ao local de injecção, a comparação dos painéis A e B mostra como o método ΔΔC T pode potencialmente sobrestimar os níveis de indução. (C) Moscas que expressa GFP sob o controle do promotor Diptericin A foram injectados com 50 nl de P. rettgeri (OD = 0,1) e em seguida trabalhada 7 dias mais tarde. O painel GFP mostra a expressão de GFP no corpo de gordura abdominal de moscas infectadas, indicando ativação do Diptericin Um promotor em moscas infectadas por bactérias, mas não controles injecção de mídia. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gene </td><td> Para a frente </td><td> Reversa </td></tr><tr><td> rp49 (também chamado rpL32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> A Diptericin </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensina </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> A atacina </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Iniciadores de qRT-PCR.

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Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

24.3K visualizações.  Cornell University. Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.