We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.

<ol>
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None of the authors have competing interests or conflicting interests.

Das hier beschriebene Verfahren ergibt strenge und hohe Qualität Infektion von Drosophila melanogaster. Die dargestellten Beispiele in erster Linie auf eine Infektion mit Providencia rettgeri und E. konzentriert coli, aber das Protokoll ist sehr anpassungsfähig und kann zu Infektionen mit verschiedenen Bakterien über einen Bereich von Wirts Aufzucht und Wartungsbedingungen angewendet werden. Die Einzelheiten einer optimalen Versuchsansatz wird auf dem Bakterium zur Infektion verwendet, dem Genotyp des Wirts, und der allgemeinen experimentellen Bedingungen abhängen. Es wird dringend Pilotversuch keine neuen Versuchsbedingungen vor Einleitung ehrgeiziger Projekte empfohlen. Ein guter Ausgangspunkt ist es, drei Infektion Dosen über einen 100-fachen Bereich zu testen. Hoch virulenten Erreger sind oft am besten bei sehr niedrigen infektiösen Dosen eingebracht, in der Größenordnung von 10 bis 100 Bakterienzellen pro fly. Moderater Erreger können bei höheren Dosen von etwa 1.000 Bakterien pro fl injiziert werdeny, und nicht-Pathogene in Dosen bis zu 10.000 Bakterien pro Fliege injiziert werden. Es ist oft hilfreich, die besonderen Kinetik neuartiger Infektionen durch Verfolgen Keimmenge sorgt Mortalität und Aktivität des Immunsystems über einen Längenzeitreihe zu definieren. Weil Messung Keimmenge und Wirts Genexpression sind destruktiv Assays ist es notwendig, verschiedene entfernt zu Beginn des Experiments für jeden Zeitpunkt, der zu messen ist, zu infizieren. Bei der Entscheidung über Nadelstich oder Mikrokapillare-basierte Einspritz verwenden, ist es wichtig zu beachten, gibt es Vorteile und Grenzen zu jedem Ansatz. Kapillarinjektion führt ein Flüssigkeitsvolumen in die Fliege, die beide geringfügig erhöht Turgor und führt Salze oder andere Moleküle, die suspendiert sind, oder in dem Träger gelöst. Kapillarinjektion erfordert auch den Zugang zu einer Einspritzeinrichtung oder Kauf der erforderlichen Ausrüstung. Septic Nadelstich erfordert keine spezielle Ausrüstung und stelltvernachlässigbar Medien in die Fliege und ist typischerweise effizienter zu infizieren eine große Anzahl von Fliegen. Allerdings haben pinprick Infektionen erlauben die genaue Kontrolle über die Infektionsdosis, die mit Kapillarinjektion erreicht werden kann. Das vorliegende Protokoll das sich auf einer Einspritzvorrichtung, die mechanisch reguliert Injektionsvolumen, es gibt aber auch Einspritzsysteme Basis diskreter Impulse von Druckluft. 20,21 Dies sind in der Regel teurer ist als die Vorrichtung, die hier gekennzeichnet und erfordern eine Kalibrierung des Luftimpulses zu jedem Nadel, um eine konsistente Injektionsvolumina zu gewährleisten. Es gibt beträchtliche Debatte aber nur sehr wenig Daten darüber, wie Fliegen werden systemisch infizierten mit Bakterien in der Wildnis. Einige Forscher postulieren, daß die Mehrzahl der natürlichen Infektionen auftritt, wenn Drosophila einnehmen pathogene Bakterien und die Bakterien werden anschließend in der Lage, den Darm zu entkommen, um eine systemische Infektion zu etablieren. Es gibt jedoch sehr few Bakterien bekannt, dass in der Lage, den Darm von D. überqueren melanogaster, und diejenigen, die diese Fähigkeit zu tun sind sehr tödlich Fliegen 22,23. Eine alternative Theorie ist, dass regelmäßig fliegt aufrecht kutikulären Verletzungen durch Flucht aus dem gescheiterten Raubversuchen oder Angriffen durch ektoparasitären Milben. Diese Hypothese wird durch die häufige Sammlung von Wild D. unterstützt melanogaster Lager Melanisierung sichtbare Flecken weisen auf geheilten Wunden (unveröffentlichte Beobachtungen) sind. Milben wurde gezeigt, dass bakterielle Infektionen in Drosophila 24 übertragen und Wunden durch Milben links sekundär durch Bakterien bei der Honigbiene 25 infiziert werden. Die Häufigkeit in der Natur von milben angetrieben oder anderweitig opportunistische Infektion von D. melanogaster durch Kutikula Verletzungen ist nicht bekannt. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht Einführung der Bakterien direkt in die Hämolymphe durch quantitative Injektion, die keine Epithelbarrieren oder Verhaltens immu umgehtschaft. Verfahren zum Zuführen von pathogenen Bakterien zu D. melanogaster in Vodovar et al. 22 und Nehme et al. 23 beschrieben worden. Viele entomopathogenen Bakterien darstellen wenig oder gar keine Gefährdung der menschlichen Gesundheit, so dass die Forscher mit ihnen bequem arbeiten. Außerdem haben nur sehr wenige Bakterien die Fähigkeit, auf Drosophila Kontakt ohne experimentelle Intervention zu infizieren, so das Risiko einer &quot;Epidemie&quot; Ausbreitung der bakteriellen Infektion durch eine Labor über kontaminierte Flächen oder entkam Fliegen ist in der Regel sehr gering. Dennoch ist es ratsam, um sicherzustellen, dass angemessene Eindämmungsmaßnahmen vorhanden sind, um infizierte Fliegen Flucht zu verhindern und für die Rückeroberung jede entgangen Fliegen. Das Labor sollte in einem biologischen Sicherheitsniveau im Einklang mit, dass der Erreger verwendet ausgestattet werden, und Standard-Best Practices in der Mikrobiologie sollte eingesetzt werden. Die experimentelle infectihier beschriebene Verfahren ermöglicht Infektionen von Drosophila melanogaster mit jeder Dosis von jedem beliebigen Bakterium. Tretener Infektion festgestellt wurde, ist es einfach, die Kinetik der bakterielle Proliferation oder Luft mißt, die Wirts-Sterblichkeit zu verfolgen und die Induktion von dem Immunsystem des Wirts zu testen. Infizierten Fliegen können leicht auf andere phänotypischen Assays, einschließlich Tests der physiologischen Funktionen, die Form oder durch die Infektion förmigen, zu unterziehen. Die beschriebenen Verfahren sind kostengünstig, erfordern relativ wenig spezialisierte Ausrüstung, und sind leicht zu erlernen, so dass sie zugänglich für die Verwendung in verschiedenen Projekten in einer Breite von Forschung und Lehre Labors.

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist einer der führenden Modellorganismen zur Untersuchung der Funktion und Evolution der Immunabwehr. Drosophila sind billig und leicht nach hinten, sind sehr offen für experimentelle Manipulation und werden von einer umfangreichen wissenschaftlichen Gemeinschaft, die ein breites entwickelt hat, gesichert Reihe von Forschungswerkzeuge. Viele Aspekte der angeborenen Immunität zwischen Insekten und Säugetieren 1,2 konserviert, einschließlich Signaltransduktion von Toll-like Rezeptoren und NF-kB-Familie Transkriptionsfaktoren, JAK / STAT-Signalisierung und JNK-Weg vermittelten Reaktionen. Die Funktion dieser Gene und Signalwege können in D. abgefragt werden melanogaster mit Mutationen oder RNAi Niederschläge, Zunahme oder Abnahme Weg Aktivitäten. 3 - 6 Zusätzlich Drosophila kann verwendet werden, um die physiologischen Folgen der Infektion und Krankheit zu untersuchen, auch im Rahmen der Evolutionstheorie Lebensgeschichte werden 7.- 9. Allen diesen Untersuchungen ist jedoch abhängig von der Fähigkeit, zuverlässig zu infizieren Versuchslinie unter definierten Behandlungsbedingungen. Das hier beschriebene Verfahren stellt einen methodischen Rahmen für die Bereitstellung von robusten und wiederholbare bakterielle Infektionen zu Drosophila melanogaster und anschließend Messen Infektion Schwere und die Quantifizierung der Immunantwort des Wirts. Drosophila können natürlich und experimentell durch eine große Vielzahl von Parasiten und Krankheitserreger, wie Bakterien, Pilze, Viren, Nematoden und Parasitenwespen infiziert werden. Das aktuelle Protokoll wird auf die Bereitstellung von systemischen bakteriellen Infektion konzentriert. Viele verschiedene Bakterien verwendet werden, um Fliegen zu infizieren, und die Wahl des Experimentators sollte über die genauen wissenschaftlichen Fragen auf der Grundlage aufgefordert werden. Zum Beispiel können menschliche klinische Isolate verwendet, um bakterielle Virulenzmechanismen 10 zu untersuchen, oder ökologisch relevanten Isolate liebsten mit seind für evolutionäre Studie. 11 Einige Bakterien sind Krankheitserreger der zuständigen D. melanogaster, wuchernden bei Infektion und verursacht Host Krankheit oder Tod. Andere Bakterien werden effektiv durch das Immunsystem des Wirts verwaltet und innerhalb von wenigen Tagen vollständig. In dieser Demonstration werden Providencia rettgeri als proliferative Krankheitserreger, der Host Sterblichkeit verursachen und bleibt in lebenden Hosts. Escherichia coli wird als nicht-pathogen, die vom Immunsystem des Wirtes freigegeben wird, verwendet werden, verwendet werden. Infektion wird durch die Einführung von Bakterien direkt in die Körperhöhle des Fliegen hergestellt werden. Dieser Ansatz umgeht Epithelbarrieren und Schutzverhalten, so dass Untersuchung der systemischen Infektion unabhängig von der natürlichen Form der Übertragung. Es gibt grundsätzlich zwei Methoden zur Festlegung experimentell systemische Infektion. In der ersten, eine nanoinjector und zog Glaskapillare Nadeln verwendet werden, um eine genaue Anzahl von injizierenBakterien in der Fliege. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass sie einen großen dynamischen Bereich der Infektionsdosis und der quantitativ höchst reproduzierbar. Der zweite Ansatz ist, um eine Infektion mit einem septischen Nadelstich zu liefern. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass eine schnelle und keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist. Sobald die Infektion festgestellt werden, wird es möglich, die systemische Belastung Erreger, Wirt Mortalität und induzierbare Aktivität des Immunsystems zu messen. Natürlich könnte eine beliebige Anzahl von zusätzlichen Phänotypen denkbar in infizierten D. mess melanogaster, auch nach der Infektion Fruchtbarkeit 12, Lernfähigkeit 13, 14 Stoffwechsellage oder praktisch jede andere Eigenschaft, die man sich vorstellen kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Reagent</td>
			<td style="width:239px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Part Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Incubator</td>
			<td style="width:239px;">Powers Scientific, Inc</td>
			<td style="width:177px;">DROS52SD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">CO2 Flypads</td>
			<td style="width:239px;">FlyStuff</td>
			<td style="width:177px;">59-114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">CO2</td>
			<td style="width:239px;">Airgas</td>
			<td>CD FG50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Drosophila rearing mix&#160;</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene</td>
			<td style="width:239px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:177px;">32-130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nosterile Extra Large Cotton Balls</td>
			<td style="width:239px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:177px;">22-456-882</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:177px;">SZ51</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Drosophila Vials polystyrene</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">89092-720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nosterile Large Cotton Balls</td>
			<td style="width:239px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:177px;">22-456-883</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">2L flask</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td>89000-370</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm;</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">25384-302</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LB Agar, Miller</td>
			<td style="width:239px;">Difco</td>
			<td style="width:177px;">244520</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Innoculing Loop</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td>80094-488</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:399px;">Rainin Clasic Pipettes in various sizes 
			0.1 &#181;l to 2 &#181;l, 
			2 &#181;l to 20 &#181;l, 
			20 &#181;l to 200 &#181;l, 
			100 &#181;l to 1000</td>
			<td style="width:239px;">Rainin</td>
			<td style="width:177px;">PR-2 
			PR-20 
			PR-200 
			PR-1000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Micropipette tips (assorted sizes)</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">30128-376 
			53503-810 
			16466-008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth Base, Miller</td>
			<td style="width:239px;">Difco</td>
			<td>241420</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">47729-576</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">S-500 Orbital Shaker</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">14005-830</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">37001-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">PBS pH 7.4 10x</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">70011044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">170-2501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Semimicrovolume Cuvettes</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">223-9955</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Vertical Capillary Puller</td>
			<td style="width:239px;">Kopf Needle Pipette Puller</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">3.5&#39;&#39; Replacement glass Capillaries for Nanojet II</td>
			<td style="width:239px;">Drummond Sientific Company</td>
			<td style="width:177px;">3-000-203-G/X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nanoject II</td>
			<td style="width:239px;">Drummond Sientific Company</td>
			<td style="width:177px;">3-000-204</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:177px;">11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">10mL Syringe</td>
			<td style="width:239px;">BD</td>
			<td style="width:177px;">309604</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil, White, light</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6358-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">minutein pins</td>
			<td style="width:239px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:177px;">26002-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1.5mL&#160; Microcentrifuge tubes; Seal Rite</td>
			<td style="width:239px;">USA Scientific Inc.</td>
			<td style="width:177px;">1615-5500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer</td>
			<td style="width:239px;">Troemner</td>
			<td style="width:177px;">103</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:239px;">OPS Diagnostics</td>
			<td style="width:177px;">930145</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5/32&#39;&#39; Grinding Balls</td>
			<td>OPS Diagnostics</td>
			<td style="width:177px;">GBSS 156-5000-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Vortex Genie</td>
			<td style="width:239px;">Scientific indurstries inc.</td>
			<td style="width:177px;">G560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Multichannel Pipettor (10uL-300uL)</td>
			<td style="width:239px;">Sartorius</td>
			<td>730360</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td>
			<td style="width:239px;">Microbiology International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Microbiology International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">TRIzol</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:177px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">TLS0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">TCS0803</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">m610a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">m170b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">dNTPs</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">U1240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oligo-dT</td>
			<td style="width:239px;">IDT</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">&#160;SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">172-5260</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">185-5200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in drosophila melanogaster

Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist einer der führenden Modellorganismen zur Untersuchung der Funktion und Evolution der Immunabwehr. Viele Aspekte der angeborenen Immunität zwischen Insekten und Säugetieren konserviert, und da Drosophila leicht genetisch und experimentell manipuliert werden, stark für die Untersuchung der Funktion des Immunsystems und die physiologischen Folgen der Krankheit sind. Das hier gezeigte Verfahren ermöglicht Infektion von Fliegen durch die Einführung von Bakterien direkt in die Körperhöhle, unter Umgehung Epithelbarrieren und passive Formen der Verteidigung und damit Fokussierung auf systemische Infektion. Das Verfahren umfasst Protokolle für die Messrate der Wirts Mortalität, systemische Keimmenge und der Grad der Induktion von dem Immunsystem des Wirts. Diese Infektion Verfahren ist preiswert, robust und quantitativ reproduzierbar und kann in Studien der funktionellen Genetik, evolutionäre Lebensgeschichte und Physiologie verwendet werden.

Dieser Teil zeigt Ergebnisse, die nach der bakteriellen Infektion von Drosophila melanogaster, erhalten werden kann. Figur 1 zeigt, dass die Infektionsdosis variiert mit der optischen Dichte der bakteriellen Suspension zur Injektion verwendet werden, und dass das gelieferte zuverlässig durch Homogenisieren und Plattieren abschätzen Dosis fliegt unmittelbar nach der Injektion . Wie in Figur 2 dargestellt ist, kann verschiedene Erreger verschiedenen Ebenen der Host Mortalität (2A) und Host-Sterblichkeit führen kann dosisabhängig (2B) ist. Wichtig ist, ermöglicht dieses Protokoll für verschiedene Typen von Infektionen erreicht werden: Providencia rettgeri kann eine chronische subletaler Infektion, für 20 Tage oder länger (3A) besteht verursachen. Aber auch andere Bakterien wie Escerichia coli wird meist durch den Host-fly innerhalb von sechs Stunden nach der Infektion (3B) gelöscht werden. Induktion der Immun system kann durch RNA-Isolierung und anschließende qRT-PCR von antibakteriellen Peptid-Transkripte (4A und B) geschätzt werden. Analog, jedoch weniger quantitativ, Fliegen, die GFP unter der Kontrolle des antimikrobiellen Peptids Genpromotoren verwendet werden, um die Induktion des Immunsystems (4C) zu visualisieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Abbildung 1: Bestimmung Infektionsdosis Fliegen wurden mit 50 nl von Bakteriensuspensionen, die einen Bereich von optischen Dichten (0,0001 bis 0,05) injiziert. Die Fliegen wurden sofort homogenisiert und ausplattiert, um die Zahl der Bakterien durch die Injektion eingeführt zu bestimmen. Initial bakterielle Belastung korreliert stark mit Anfangs-OD injiziert (r 2 = 0,96) <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2:. Überleben nach der Injektion mit bakterieller Pathogene Fünf bis sieben Tage alte Männer wurden mit 50 nl entweder bakteriellen Suspension oder sterile Medien eingespritzt und für das Überleben überwacht. (A) Wildtyp-Fliegen wurden mit etwa 5.000 Bakterien aus einer von drei verschiedenen Spezies injiziert. Die Rate des Host Mortalität hängt stark von den für die Infektion verwendeten Bakterienspezies. 50, 500 und 5.000 Bakterien pro fly - (B) Wildtyp-Fliegen wurden mit drei verschiedenen Dosen von Enterococcous faecalis injiziert. Fliegen sterben schneller, wenn mit höheren infektiösen Dosen (C) infiziert Ein Immunsystem Mutanten und ihre Wildtyp-isogenen Steuerleitung wurden mit etwa 500 Burkholderia cepacia injiziert. Eine paarweise Log-Rank-Vergleich zeigt, dass die Wildtyp-fly die Infektion deutlich besser als der Mutante (χ 2 = 59.02, df = 1, p &lt;0,0001) überlebt. Abb. 3: bakterielle Belastung nach der Injektion Fliegen wurden mit etwa (A) 5000 P. injiziert rettgeri (B) 3400 E. coli. Bakterielle Belastung wurde unmittelbar nach der Injektion und bei verschiedenen nachfolgenden Zeitpunkte bestimmt. Jeder Datenpunkt stellt die bakterielle Belastung einer einzigen Fliege. E. coli schnell von Hosts in Frage gestellt, während P. gelöscht rettgeri bleibt für den Rest des Hosts Leben ,. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Abbildung 4: Induktion von Immun Gene Expression nach der Injektion. (A) Die Fliegen wurden mit 50 nl injiziert P. rettgeri oder sterilem PBS entweder in den Bauch oder Brustkorb, oder wurden aus CO links unmanipulated beiseite <sub&gt; 2 Anästhesie. Sechs Stunden nach der Infektion wurden die Fliegen für die RNA-Isolierung und Expression des Diptericin Ein Gen wurde mit qRT-PCR bestimmt gesammelt. (A) Expressionsniveaus werden als das Verhältnis der Diptericin graphisch dargestellt, um ein Transkript rp49 Transkript und skaliert, dass die CO 2 Steuerung als eine Expressionsniveau 1. Die Balken stellen den Mittelwert und Standardfehler von Verhältnissen von jeder Bedingung definiert (n = 4). (B) Die Expressionsniveaus werden als 2 ΔΔCT mit der durchschnittlichen C T-Wert von CO 2 aesthesia Kontrollfliegen als Standard nicht-induzierten Zustand gebraucht grafisch dargestellt. Die Balken stellen den Mittelwert und Standardfehler der ΔΔC T von jedem Zustand (n = 4). Zwar gibt es keinen Unterschied in der Niederschrift Induktion aufgrund der Injektionsstelle, Vergleich der Platten A und B zeigt, wie die ΔΔC T Methode kann potenziell zu überschätzen Induktionsniveaus. (C) Fliegt, die GFP unter der Kontrolle des Promotors Diptericin A wurden mit 50 nl injiziert P. rettgeri (OD = 0,1) und dann abgebildet wird 7 Tage später. Die GFP-Panel zeigt die Expression von GFP in der Bauchfettkörper der infizierten Fliegen, was die Aktivierung des Diptericin Ein Promotor in bakteriell infizierten Fliegen, aber nicht medien injizierten Kontrollen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gen </td><td> Vorwärts </td><td> Rückwärts </td></tr><tr><td> rp49 (auch genannt rpL32) </td><td> 5&#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5&#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin A </td><td> 5&#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5&#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5&#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensin </td><td> 5&#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5&#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin A </td><td> 5&#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5&#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5&#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5&#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Primer für qRT-PCR.

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Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

24.3K Aufrufe.  Cornell University. Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.