We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual review of immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Dionne, M. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+infectious+diseases+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Models of infectious diseases in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Disease models &amp; mechanisms. 1 (1), 43-9 (2008).</li><li>Rutschmann, S., Jung, A. C., Hetru, C., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rel+protein+DIF+mediates+the+antifungal+but+not+the+antibacterial+host+defense+in+Drosophila.">The Rel protein DIF mediates the antifungal but not the antibacterial host defense in Drosophila.</a> Immunity. 12 (5), 569-580 (2000).</li><li>Ayres, J. S., Freitag, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+mutants+altering+defense+of+and+endurance+to+Listeria+monocytogenes+infection.">Identification of Drosophila mutants altering defense of and endurance to Listeria monocytogenes infection.</a> Genetics. 178 (3), 1807-1815 (2008).</li><li>Cronin, S. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+genes+involved+in+intestinal+pathogenic+bacterial+infection.">Genome-wide RNAi screen identifies genes involved in intestinal pathogenic bacterial infection.</a> Science. 325 (5938), 340-343 (2009).</li><li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+Drosophila+immunity.">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. , (2014).</li><li>Dionne, M. S., Pham, L. N., Shirasu-Hiza, M., Schneider, D. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster.">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS pathogens. 3 (11), e173 (2007).</li><li>Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+transmission+of+endosymbiotic+Spiroplasma+by+mites.">Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites.</a> Biology. 3 (1), 23-25 (2007).</li><li>Kanbar, G., Engels, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+bacterial+infection+of+wounds+in+honey+bee+(+Apis+mellifera)+pupae+punctured+by+Varroa+mites.">Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites.</a> Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

La procedura qui descritta produce infezione qualità rigoroso e alto di Drosophila melanogaster. Gli esempi illustrati concentrati principalmente sulla infezione da Providencia rettgeri ed E. coli, ma il protocollo è altamente adattabile e può essere applicato alle infezioni con diversi batteri su una gamma di condizioni di allevamento host e manutenzione. I dettagli di un approccio sperimentale ottimale dipenderà batterio utilizzato per l&#39;infezione, il genotipo dell&#39;ospite, e le condizioni sperimentali generali. E &#39;fortemente raccomandato di test pilota eventuali nuove condizioni sperimentali prima di avviare i progetti più ambiziosi. Un buon punto di partenza è quello di testare tre dosi di infezione in un range di 100 volte. Altamente patogeni virulenti sono spesso meglio introdotti a dosi infettive molto bassi, dell&#39;ordine di 10 - 100 cellule batteriche per mosca. Gli agenti patogeni più moderati possono essere iniettati in dosi più elevate di circa 1.000 batteri per fly, e non gli agenti patogeni possono essere iniettati in dosi fino a 10.000 batteri per volare. Spesso è istruttivo definire le cinetiche di infezioni nuovi tracciando carico patogeno, la mortalità host e l&#39;attività del sistema immunitario su una serie temporale longitudinale. Poiché la misura del carico patogeno e l&#39;espressione genica ospitante sono prove distruttive, è necessario per infettare le mosche distinti fin dall&#39;inizio dell&#39;esperimento per ogni punto di tempo che deve essere misurato. Al momento di decidere se utilizzare puntura di spillo o iniezione a base microcapillare-, è importante notare che ci sono vantaggi e limitazioni di ogni approccio. Iniezione capillare presenta un volume di liquido nella mosca, che sia modestamente aumenta la pressione turgore e introduce sali o altre molecole che sono sospesi o disciolti nel veicolo. Iniezione capillare richiede anche l&#39;accesso ad un impianto di iniezione o l&#39;acquisto delle attrezzature necessarie. Pinprick Septic non richiede attrezzature speciali e introducesupporti trascurabili nel volo, ed è in genere più efficace per infettare un gran numero di mosche. Tuttavia, le infezioni puntura di spillo non consentono il controllo preciso dosaggio infezione che può essere raggiunto con iniezione capillare. Il presente protocollo focalizzata su un apparato di iniezione che regola meccanicamente volume di iniezione, ma ci sono anche sistemi di iniezione a base di impulsi discreti di aria pressurizzata. 20,21 Questi sono in genere più costosi dei apparecchiatura descritta qui e richiedono la calibrazione dell&#39;impulso aria per ciascun aghi per garantire volumi di iniezione coerenti. Vi è un ampio dibattito, ma pochissimi dati su come le mosche diventano sistemica infettati con i batteri in natura. Alcuni ricercatori ipotizzano che la maggior parte delle infezioni naturali si verificano quando Drosophila ingerire batteri patogeni e batteri sono successivamente in grado di sfuggire l&#39;intestino per stabilire una infezione sistemica. Tuttavia, ci sono molto few batteri noti per essere in grado di attraversare l&#39;intestino di D. melanogaster, e quelli che hanno questa capacità sono altamente letale per le mosche 22,23. Una teoria alternativa è che vola regolarmente subire lesioni cuticolari attraverso fuga dai tentativi di predazione falliti o attacco di acari ectoparassiti. Questa ipotesi è supportata dalla raccolta frequente di selvaggio D. melanogaster recanti macchie melanizzazione che sono indicativi delle ferite guarite (osservazioni non pubblicate). Gli acari sono stati indicati per la trasmissione di infezioni batteriche in Drosophila 24 e le ferite lasciate da acari possono essere secondariamente infettato da batteri nelle api 25. Tuttavia, la frequenza naturale di infezione acari-driven o altrimenti opportunistica di D. melanogaster attraverso violazioni cuticola non è noto. Il protocollo qui descritto consente l&#39;introduzione di batteri direttamente nella emolinfa attraverso l&#39;iniezione quantitativa che bypassa le barriere epiteliali o Immu comportamentalicomunitario. Metodi per alimentare i batteri patogeni a D. melanogaster sono stati descritti in Vodovar et al. 22 e Nehme et al. 23. Molti batteri entomopatogeni rappresentano poco o nessun rischio per la salute umana, consentendo ai ricercatori di lavorare con loro in modo confortevole. Inoltre, molto pochi i batteri hanno la capacità di infettare Drosophila in contatto senza intervento sperimentale, per cui il rischio di diffusione &quot;epidemica&quot; di infezione batterica attraverso un laboratorio di via superfici contaminate o fuggiti mosche è generalmente molto basso. Tuttavia, è opportuno garantire che adeguate misure di contenimento sono in atto per evitare che le mosche infette di fuggire e per riconquistare qualsiasi mosche sfuggito. Il laboratorio deve essere attrezzato ad un livello di sicurezza biologica commisurata a quella dei patogeni in uso, e migliori pratiche standard in microbiologia deve essere impiegato. Il infecti sperimentaleil metodo qui descritto permette di infezioni di Drosophila melanogaster, con qualsiasi dosaggio di qualsiasi batterio arbitrario. Una volta che l&#39;infezione è stata stabilita, è semplice per misurare la cinetica di proliferazione batterica o di liquidazione, per monitorare la mortalità di accoglienza, e di saggiare l&#39;induzione del sistema immunitario dell&#39;ospite. Mosche infetti possono essere facilmente sottoposti ad altri test fenotipici, compresi i test di funzioni fisiologiche che possono modellare o essere modellati dal infezione. Le procedure descritte sono poco costosi, richiedono relativamente poco attrezzature specializzate, e sono facilmente apprese, che li rende suscettibili per l&#39;utilizzo in diversi progetti attraverso una larghezza di laboratori di ricerca e di insegnamento.

La mosca della frutta Drosophila melanogaster è uno degli organismi modello premier per lo studio della funzione e l&#39;evoluzione di difesa immunitaria. Drosophila sono poco costosi e facili da dietro, sono altamente suscettibili di manipolazione sperimentale, e sono supportato da una vasta comunità scientifica che si è sviluppato un ampio serie di strumenti di ricerca. Molti aspetti dell&#39;immunità innata sono conservate tra insetti e mammiferi, tra cui trasduzione del segnale mediata da recettori Toll-like e NF-kB fattori di trascrizione della famiglia, di segnalazione JAK / STAT, e le risposte via di JNK. 1,2 La funzione di questi geni e vie can essere interrogato in D. melanogaster con mutazioni o RNAi abbattimenti che le attività di aumentare o diminuire pathway. 3 - 6 Inoltre, Drosophila può essere usato per studiare le conseguenze fisiologiche della infezione e la malattia, anche nel contesto della teoria evoluzionistica storia di vita 7.- 9 Tutti questi studi, tuttavia, dipendono dalla capacità di infettare in modo affidabile le mosche sperimentali in condizioni di trattamento definite. La procedura qui descritta presenta un quadro metodologico per la consegna di infezioni batteriche resistenti e ripetibili di Drosophila melanogaster e successivamente misurare infezione gravità e quantificare la risposta immunitaria. Drosophila può essere naturalmente e sperimentalmente infettato da una grande varietà di parassiti e patogeni, tra cui batteri, funghi, virus, nematodi e vespe parassitoidi. Il protocollo attuale è focalizzata sulla fornitura di un&#39;infezione batterica sistemica. Molti batteri differenti possono essere utilizzati per infettare le mosche, e la scelta dello sperimentatore dovrebbero essere basati sulle precise questioni scientifiche essere chiesto. Ad esempio, isolati clinici umani possono essere impiegati per studiare i meccanismi di virulenza batterica 10, o ecologicamente pertinenti isolati possono essere preferite lad per lo studio evolutivo. 11 Alcuni batteri sono patogeni competenti di D. melanogaster, proliferando su infezioni e che causa la malattia di accoglienza o la morte. Altri batteri sono effettivamente gestiti dal sistema immunitario ospite e cancellati entro pochi giorni. In questa dimostrazione, Providencia rettgeri sarà utilizzato come un agente patogeno proliferativa che può causare la mortalità ospitante e persiste in hosts sopravvissuti. Escherichia coli viene utilizzata come non patogeno che viene eliminato dal sistema immunitario dell&#39;ospite. Infezione sarà stabilito dalla introduzione di batteri direttamente nella cavità del corpo della mosca. Questo approccio bypassa barriere epiteliali e comportamenti protettivi, consentendo indagini di infezione sistemica indipendentemente dal modo naturale della trasmissione. Ci sono due metodi principali per stabilire sperimentalmente infezione sistemica. Nel primo, un nanoinjector e capillare di vetro tirato aghi sono usati per iniettare un numero preciso dibatteri nel volo. Questo metodo ha il vantaggio di consentire una vasta gamma dinamica di dosi infettive e di essere quantitativamente altamente ripetibili. Il secondo approccio è quello di fornire l&#39;infezione con una puntura di spillo settico. Questo approccio ha il vantaggio di essere rapida e non richiede attrezzature speciali. Una volta che le infezioni sono stabiliti, diventa possibile misurare il carico sistemico patogeno, la mortalità host e l&#39;attività inducibile sistema immunitario. Naturalmente, qualsiasi numero di fenotipi supplementari potrebbe concepibilmente essere misurata in infetto D. melanogaster, anche post-infezione fecondità 12, la capacità di apprendimento 13, stato metabolico 14, o per qualsiasi altra caratteristica che si possa immaginare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Reagent</td>
			<td style="width:239px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:177px;">Part Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Incubator</td>
			<td style="width:239px;">Powers Scientific, Inc</td>
			<td style="width:177px;">DROS52SD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Paintbrush</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">CO2 Flypads</td>
			<td style="width:239px;">FlyStuff</td>
			<td style="width:177px;">59-114</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">CO2</td>
			<td style="width:239px;">Airgas</td>
			<td>CD FG50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Drosophila rearing mix&#160;</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene</td>
			<td style="width:239px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:177px;">32-130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nosterile Extra Large Cotton Balls</td>
			<td style="width:239px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:177px;">22-456-882</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus Corporation</td>
			<td style="width:177px;">SZ51</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Drosophila Vials polystyrene</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">89092-720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nosterile Large Cotton Balls</td>
			<td style="width:239px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:177px;">22-456-883</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">2L flask</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td>89000-370</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm;</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">25384-302</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">LB Agar, Miller</td>
			<td style="width:239px;">Difco</td>
			<td style="width:177px;">244520</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Innoculing Loop</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td>80094-488</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:399px;">Rainin Clasic Pipettes in various sizes 
			0.1 &#181;l to 2 &#181;l, 
			2 &#181;l to 20 &#181;l, 
			20 &#181;l to 200 &#181;l, 
			100 &#181;l to 1000</td>
			<td style="width:239px;">Rainin</td>
			<td style="width:177px;">PR-2 
			PR-20 
			PR-200 
			PR-1000</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:399px;">Micropipette tips (assorted sizes)</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">30128-376 
			53503-810 
			16466-008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Broth Base, Miller</td>
			<td style="width:239px;">Difco</td>
			<td>241420</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">47729-576</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">S-500 Orbital Shaker</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">14005-830</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">VWR international</td>
			<td style="width:177px;">37001-300</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">PBS pH 7.4 10x</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:177px;">70011044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">170-2501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Semimicrovolume Cuvettes</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">223-9955</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Vertical Capillary Puller</td>
			<td style="width:239px;">Kopf Needle Pipette Puller</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">3.5&#39;&#39; Replacement glass Capillaries for Nanojet II</td>
			<td style="width:239px;">Drummond Sientific Company</td>
			<td style="width:177px;">3-000-203-G/X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Nanoject II</td>
			<td style="width:239px;">Drummond Sientific Company</td>
			<td style="width:177px;">3-000-204</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:177px;">11255-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">10mL Syringe</td>
			<td style="width:239px;">BD</td>
			<td style="width:177px;">309604</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil, White, light</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>6358-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">minutein pins</td>
			<td style="width:239px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:177px;">26002-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1.5mL&#160; Microcentrifuge tubes; Seal Rite</td>
			<td style="width:239px;">USA Scientific Inc.</td>
			<td style="width:177px;">1615-5500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer</td>
			<td style="width:239px;">Troemner</td>
			<td style="width:177px;">103</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:239px;">OPS Diagnostics</td>
			<td style="width:177px;">930145</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5/32&#39;&#39; Grinding Balls</td>
			<td>OPS Diagnostics</td>
			<td style="width:177px;">GBSS 156-5000-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Vortex Genie</td>
			<td style="width:239px;">Scientific indurstries inc.</td>
			<td style="width:177px;">G560</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Multichannel Pipettor (10uL-300uL)</td>
			<td style="width:239px;">Sartorius</td>
			<td>730360</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">WASP2 Whitley Automated Spiral Plater</td>
			<td style="width:239px;">Microbiology International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:399px;">ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Microbiology International</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">TRIzol</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:177px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">TLS0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">TCS0803</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">m610a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">m170b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">dNTPs</td>
			<td style="width:239px;">Promega</td>
			<td style="width:177px;">U1240</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oligo-dT</td>
			<td style="width:239px;">IDT</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">&#160;SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">172-5260</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td style="width:239px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:177px;">185-5200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2115</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in drosophila melanogaster

La mosca della frutta Drosophila melanogaster è uno degli organismi modello premier per lo studio della funzione e l&#39;evoluzione di difesa immunitaria. Molti aspetti dell&#39;immunità innata sono conservate tra insetti e mammiferi, e dato che Drosophila può essere facilmente manipolato geneticamente e sperimentalmente, sono potenti per studiare la funzione del sistema immunitario e le conseguenze fisiologiche della malattia. La procedura permette dimostrato qui infezione di mosche dall&#39;introduzione di batteri direttamente nella cavità del corpo, bypassando barriere epiteliali e forme più passivi di difesa e consentendo attenzione alla infezione sistemica. Il procedimento comprende i protocolli per i tassi di mortalità misurazione ospitante, carico patogeno sistemica, e il grado di induzione del sistema immunitario dell&#39;ospite. Questa procedura infezione è poco costoso, robusto e quantitativamente ripetibile, e può essere usato in studi di genetica funzionale, storia di vita evolutiva e fisiologia.

Questa sezione illustra i risultati ottenibili dopo l&#39;infezione batterica di Drosophila melanogaster. La Figura 1 mostra quella dose infezione varia con la densità ottica della sospensione batterica utilizzato per l&#39;iniezione, e che la dose erogata può essere attendibilmente stimato omogeneizzazione e placcatura vola immediatamente dopo l&#39;iniezione . Come illustrato in figura 2, diversi agenti patogeni possono causare diversi livelli di mortalità host (figura 2A) e mortalità ospitante può essere dose-dipendente (Figura 2B). È importante sottolineare che questo protocollo consente diversi tipi di infezioni da raggiungere: Providencia rettgeri può causare un&#39;infezione cronica, subletale che persiste per 20 giorni o più (Figura 3A). Tuttavia, altri batteri come Escerichia coli saranno per lo più cancellati dalla mosca ospitante entro sei ore dopo l&#39;infezione (Figura 3B). Induzione di sys immunitarioTEM può essere stimata attraverso l&#39;isolamento di RNA e la successiva qRT-PCR dei trascritti peptidi antibatterici (Figura 4A e B). Analogamente ma meno quantitativamente, mosche esprimendo GFP sotto il controllo del peptide antimicrobico promotori genici può essere utilizzato per visualizzare l&#39;induzione del sistema immunitario (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> . Figura 1: Determinazione Infectious Dose mosche sono stati iniettati con 50 nl di sospensioni batteriche che coprono una gamma di densità ottiche (,0001-,05). Le mosche erano immediatamente omogeneizzati e piastrate per determinare il numero di batteri introdotto dalla iniezione. Carica batterica iniziale è strettamente correlato con OD iniziale iniettato (r 2 = 0,96) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2:. La sopravvivenza dopo iniezione con batteri patogeni cinque a sette maschi vecchi giorni sono stati iniettati con 50 nl di una sospensione di batteri o supporti sterili e monitorato per la sopravvivenza. (A) mosche wild type sono stati iniettati con circa 5.000 batteri di una delle tre specie diverse. Il tasso di mortalità di accoglienza dipende in larga misura dalla specie batterica usati per l&#39;infezione. (B) mosche wild type sono stati iniettati con tre diverse dosi di Enterococcous faecalis - 50, 500 e 5.000 batteri per volare. Le mosche muoiono più rapidamente quando infettati con dosi superiori infettive (C) Un mutante del sistema immunitario e la sua wild-type linea di controllo isogenico sono stati iniettati con circa 500 Burkholderia cepacia. Un confronto Log-Rank coppie dimostra che la wild-type fly sopravvive l&#39;infezione significativamente migliore rispetto al mutante (χ 2 = 59,02, df = 1, p &lt;0,0001). Figura 3:. Carica batterica dopo iniezione mosche sono state iniettate con circa il (A) 5000 P. rettgeri (B) 3.400 E. coli. Carica batterica è stata determinata immediatamente dopo l&#39;iniezione e in vari punti temporali successivi. Ciascun punto di dati rappresenta la carica batterica di una mosca. E. coli è rapidamente eliminato da host sfidato mentre P. rettgeri persiste per il resto della vita dell&#39;ospite ,. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> Figura 4: Induzione immunitario genica dopo l&#39;iniezione. (A) Le mosche sono stati iniettati con 50 nl di P. rettgeri o PBS sterile sia nel torace, o sono stati lasciati non manipolata a parte CO <sub&gt; 2 anestesia. Sei ore dopo l&#39;infezione, le mosche sono stati raccolti per l&#39;isolamento di RNA e espressione del Diptericin Un gene è stato determinato utilizzando qRT-PCR. (A) I livelli di espressione sono rappresentati graficamente come rapporto tra Diptericin Una trascrizione di rp49 trascrizione e scalato in modo tale che il controllo CO 2 è definito come aventi un livello di espressione di 1. Le barre rappresentano la media e l&#39;errore standard di rapporti da ciascuna condizione (n = 4). Livelli (B) di espressione vengono rappresentati graficamente come ΔΔCT 2 con il valore medio C T da CO 2 aesthesia linea di controllo utilizzati come condizione uninduced standard. Le barre rappresentano l&#39;errore medio e standard ΔΔC T da ciascuna condizione (n = 4). Mentre non vi è alcuna differenza di induzione trascrizione causa al sito di iniezione, il confronto di pannelli A e B mostra come il metodo ΔΔC T può potenzialmente sovrastimare i livelli di induzione. (C) Vola esprimono GFP sotto il controllo del Diptericin Un promotore sono stati iniettati con 50 nl di P. rettgeri (OD = 0,1) e poi ripreso sette giorni più tardi. Il pannello GFP mostra l&#39;espressione di GFP nel corpo grasso addominale di mosche infette, indicando l&#39;attivazione della Diptericin Un promotore in linea con infezione da batteri, ma non controlli multimediali a iniezione. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gene </td><td> Avanti </td><td> Reverse </td></tr><tr><td> rp49 (chiamato anche rpL32) </td><td> 5 &#39;AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3&#39; </td><td> 5 &#39;GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3&#39; </td></tr><tr><td> Diptericin A </td><td> 5 &#39;GCGGCGATGGTTTTGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;CGCTGGTCCACACCTTCTG 3&#39; </td></tr><tr><td> Drosomycin </td><td> 5 &#39;CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3 &#39; </td><td> 5 &#39;TCCCTCCTCCTTGCACACA 3&#39; </td></tr><tr><td> Defensin </td><td> 5 &#39;GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3&#39; </td><td> 5 &#39;TCGCTTCTGGCGGCTATG 3&#39; </td></tr><tr><td> Attacin A </td><td> 5 &#39;CGTTTGGATCTGACCAAGG 3&#39; </td><td> 5 &#39;AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Metchnikowan </td><td> 5 &#39;AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3&#39; </td><td> 5 &#39;ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Primer per qRT-PCR.

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Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

24.3K Views.  Cornell University. Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.