Agradecemos a Jesper Kronhamn y Dan Hultmark, Michael Galko, y la Bolsa de Centro Bloomington para las poblaciones de la mosca. Un agradecimiento especial a Courtney Onodera de asesoramiento con el análisis estadístico. Damos las gracias a Katrina Oro para la lectura crítica del manuscrito, y Kalpana Makhijani, Katrina Oro, los miembros del laboratorio Derynck, y los miembros del laboratorio Nystul para su discusión y comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de la UCSF Programa para la Investigación Biomédica Breakthrough (pBBR), Broad Center, Fundación Hellman, la Sociedad Americana del Cáncer RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, Institutos Nacionales de Salud y 1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (en KB).

1. Hemocyte Bleed / Ensayo Raspe <ol><li> Preparación de diapositivas: <ol><li> Opción 1 para los microscopios de barrido baldosas sin función: Para cada larva a analizar, preparará un portaobjetos de vidrio con cerca de 5 pozos Pap-pluma de 2 mm cuadrados cada una, correspondiente a la zona de visión de campo del microscopio; añadir aproximadamente 5 - 10 l de los medios de comunicación a cada S2 (Figura 1A). Mantenga portaobjetos en cámara húmeda para evitar que los pozos se sequen. </li><li> Opción 2 para microscopios con función de exploración del azulejo: Para cada larva a analizar, preparar una diapositiva de cristal con 3 a 4 pozos Pap-pluma de ~ 3 - 4 mm cuadrados cada uno; añadir aproximadamente 15 - 20 l de los medios de comunicación S2 a cada pocillo (Figura 1B). Mantenga portaobjetos en cámara húmeda para evitar que los pozos se sequen. NOTA: El número de arriba recomendada de pozos es suficiente para los totales de hasta 3.000 hemocitos por larva (finales de larvas 2º, ~ 2,5-3 mm de longitud, transgén etiquetar la mayoría de larval células sanguíneas). Al evaluar el número de células de sangre más grandes, podrían ser necesarios más pozos para evitar el hacinamiento. </li></ol></li><li> Colección de larvas: <ol><li> Aplique agua en un vial que contiene larvas de mosca y larvas a ras en una placa de Petri, o cuchara algo de comida que contiene larvas en una placa Petri y se diluye con agua usando una botella con atomizador. </li><li> Recoger suavemente las larvas de la placa de Petri con un pincel y colocarlos en el agua en un plato de cavidad o en una diapositiva en un bloque frío. NOTA: Las larvas se puede mantener durante un tiempo limitado en el agua o en un bloque de frío; utilizar muestras dentro de 45 minutos o menos para evitar la muerte de las larvas o los efectos no deseados en hemocitos. </li></ol></li><li> Disección: <ol><li> Seleccionar larvas bajo un microscopio de fluorescencia en un bloque de metal frío. Mida tamaños y larvas imagen si lo desea. </li><li> Aislamiento de hemocitos circulantes (&quot;Bleed&quot;): <ol><li> Una vez que se seleccionan las larvas, coloque una larva en el primer Pap-pen así (Figura 1C,2A). </li><li> Utilice 2 agujas limpias o tijeras de disección y pinzas para hacer una incisión en los extremos anterior y posterior de la larva. Para evitar molestar hemocitos residentes, lo mejor es hacer las incisiones en la parte ventral de la larva. Para obtener resultados consistentes, hacer las incisiones en los mismos lugares por cada larva. Por 1ª estadio las larvas, 1 incisión (en el ventral anterior) es suficiente. </li><li> Permita larva a sangrar durante unos segundos y sin ningún tipo de presión o agitación física (Figura 2). NOTA: Si está trabajando en larvas múltiple es mejor hacer estas incisiones para cada uno antes de continuar con el siguiente paso para evitar mantener las larvas en el hielo demasiado tiempo que podría afectar a la integridad de las muestras. </li><li> Levante con cuidado la larva con las agujas o fórceps e introducirlo en el segundo pozo para enjuagar cualquier hemocitos circulantes restantes. Después de eso, siga con el lanzamiento de hemocitos residentes. </li></ol></li><li&gt; El aislamiento de hemocitos residentes (&quot;Raspe&quot;): <ol><li> Transferir suavemente la larva al siguiente pozo (Figura 2C). </li><li> Identificar la glándula de la linfa de la larva, que normalmente se encuentra aproximadamente a un tercio desde el extremo anterior de la larva, y que puede emitir fluorescencia dorsalmente a través de la pared del cuerpo larval. Evite la glándula linfática mientras suelta hemocitos residentes fijando por la larva con una aguja lo más cerca posible a la glándula de la linfa para evitar la punción (Figura 2C). NOTA: Durante el desarrollo normal de la maduración de las glándulas linfáticas hemocitos se retrasa en comparación con hemocitos larvarios, y los reporteros fluorescentes de hemocitos diferenciadas no puede mostrar una señal en la glándula de la linfa de las larvas jóvenes. En estos casos, necesita menos atención a pagar a la glándula linfática como no hay contaminación del diferenciados hemocitos larvales marcados con fluorescencia por hemocitos de las glándulas de la linfa que se espera. </li><li> Suelte glóbulos residentes en un dissectiel proceso de raspado y / o golpeando. Utilice una punta de aguja para fijar de manera efectiva por la larva, cerca de la glándula linfática (ver arriba) u otras áreas del cuerpo como sea necesario. Utilice otra aguja para pinchar en los grupos de hemocitos que son visibles a través de la pared corporal de larvas (Figura 2C, E), con el objetivo de separar los hemocitos. Hemocitos también puede ser liberado en un movimiento de raspado. Sin embargo, rasgando la epidermis temprana puede liberar grandes racimos de células de la sangre, lo que podría hacer el conteo automatizado más difícil. NOTA: Dependiendo de la edad y el genotipo de la larva, el número de hemocitos totales variará. Distribuir el proceso de liberación se ha descrito anteriormente en varios pozos para evitar el hacinamiento de algunos pozos con células de la sangre, lo que podría hacer que el análisis de imágenes de células individuales más difícil. </li><li> Si algunos hemocitos permanecen en la canal final, contar estos hemocitos por observación a través del microscopio y el uso de un contador de conteo manual (Figura 2E). Para facilitar el recuento, pencaje de la carcasa en un área limpia de la misma diapositiva y difundirlo lo más finas posible para reducir el número de planos ópticos. </li><li> Una vez que la disección está completa, espere entre el 5 - 10 min para sedimentar las células (pero no necesariamente se adhieren) antes de la formación de imágenes de los pozos. Incubar el portaobjetos en una cámara húmeda para evitar la desecación, y evitar la manipulación brusca de las diapositivas, que podrían perturbar los hemocitos asentadas. NOTA: Cuando se determinan los recuentos de hemocitos, células liberadas no son fijos y las células deben obtener imágenes poco después de la disección, preferiblemente dentro de 30 minutos después de la liberación de la larva. Dependiendo del volumen de medio y celulares propiedades, la gran mayoría de las células se han asentado dentro de 5 a 10 minutos, que debe ser confirmado por centrarse través de los planos ópticas del medio en el pozo. Sin embargo, sólo una fracción de células de la sangre se han adherido a la superficie de deslizamiento en ese momento, un hecho que debe tenerse en cuenta si la modificación de este protocolo para approache basada fijación de célulass. </li></ol></li></ol></li><li> Cuantificación: <ol><li> Tomar imágenes de los hemocitos asentados bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 2 B, D, F). Siga con cuantificación de hemocitos utilizando el software ImageJ. </li><li> Imagen Prepárese para ImageJ algoritmo de recuento de células: <ol><li> Abrir imagen del bien utilizando ImageJ: Archivo → Abrir → (localizar el archivo y seleccionar). </li><li> Asegúrese de que la imagen (s) es de 8 bits o 16 bits. Ajuste el umbral para la imagen seleccionando Imagen y luego haga clic en Ajustar y seleccione Umbral. Observe la ventana &quot;Umbral&quot; (Figura 3A). </li><li> Marque la opción &quot;Fondo Oscuro&quot;. Seleccione &quot;Red&quot; y aumentar el nivel inferior de umbral (véase la flecha negro) hasta que cada célula en la imagen está marcado con un punto rojo (células que no están siendo cubiertos se verá en escala de grises; Figura 3B). A medida que el umbral inferiorse incrementaron algunas células se convertirán en no marcado. Esto puede ser el indicador de hasta qué punto para establecer el umbral inferior. NOTA: De vez en cuando grupos de células no se pueden resolver y se cuentan como uno por el contador de partículas. En tales casos, el número de células en un clúster se puede estimar mediante el examen de la imagen (zoom si es necesario) y el conteo manual usando un contador de recuento. Alternativamente, el umbral inferior se puede aumentar para resolver grupos de células; las células no marcadas resultantes de esta manipulación se pueden entonces contaron usando un contador de recuento. </li></ol></li><li> Analizar el número de células usando ImageJ: <ol><li> Inicie el Analizador de partículas para contar las células (Figura 3C). Seleccione Analizar y haga clic en Analizar partículas. Opcionalmente seleccione &quot;Overlay contornos&quot; para ver las partículas de la cuenta algoritmo (Figura 3D). Alternativamente, establecer un límite para el tamaño o área de píxeles de una unidad (por ejemplo,., Célula, grupo de células, etc.) para el algoritmo para contar. </li><li> Haga clic en Aceptar. Observar una ventana de resumen con el conde (Figura 3E). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Hemocyte Perturbación Ensayo <ol><li> Para molestar hemocitos, seleccione larvas y colocarlos en un tubo de microcentrífuga de 2 ml con aproximadamente 0,5 g de perlas de vidrio (212 - 600 micras) y añadir 0,5 ml de agua. </li><li> Vortex el tubo, a mano, a la velocidad de 10 durante 1 min. </li><li> Recuperar las larvas de las perlas de vidrio por derramar el contenido del tubo de microcentrífuga en un plato de Petri y elegir las larvas con un pincel. </li><li> Para la fase de recuperación, coloque larvas en platos preparados con anterioridad Petri con pequeñas cantidades de comida mosca. Permitir que las larvas de restablecer su patrón de hemocitos por un período de 45 min o como se desee. NOTA: Deseche las larvas que han dejado de moverse, ya que han muerto en el proceso. Sin embargo, vemos típicamente ldaños oco después de 1 minuto de vórtice (ver a continuación y Suplementario Figura 1). </li><li> Después de que el período de recuperación, continuar con el / Ensayo Raspe Bleed como se ha descrito anteriormente en la Sección 1. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

A continuación, describimos el primer método para recuperar cuantitativamente glóbulos residentes y circulantes de larvas de Drosophila sola, y cuantificar estas dos poblaciones de hemocitos. El protocolo comprende la liberación secuencial de circulantes y residentes células de la sangre, seguido por formación de imágenes y el recuento de células automatizado. Hemocitos residentes larvas pueden ser transitoriamente movilizaron en circulación por perturbación mecánica, un proceso que se conoce que se invierta en gran medida dentro de un 30 - período de recuperación min 60 6. En consecuencia, este protocolo se probó en dos formas, (1) mediante la evaluación del número total de hemocitos por larva y la fracción de la circulación de hemocitos en el transcurso de desarrollo de las larvas, y (2) por desalojar experimentalmente hemocitos residentes usando un método automatizado, que confirmó la estrecha correlación de la localización de hemocitos y el número de hemocitos en el residente y poblaciones circulantes. Además, la reproducibilidad del método se demostró por comparing dos conjuntos de datos de réplicas biológicas. En el pasado, los laboratorios han utilizado una serie de técnicas para cuantificar hemocitos larval 6,13,21. Este protocolo establece un estándar común para recuperar y cuantificar las poblaciones de células de la sangre que residan y que circulan a partir de larvas de Drosophila, proporcionando una plataforma fácilmente adaptable. El método descrito es fundamental para los estudios que se centran en el papel de hemocitos residentes y su microambiente, hematopoyético Bolsillos 4-6, y es adecuado para estudiar las cepas transgénicas portadoras de la proteína fluorescente de Drosophila en el tipo salvaje y fondos modificados genéticamente. El protocolo también es relevante para los estudios que se centran en la movilización hemocyte después de la estimulación inmune o lesión, y la señalización genéticamente o ambientalmente inducida que activa movilización de hemocitos residentes o cambios en el número de hemocitos totales (revisado en 4). Cabe señalar que, en los casos de di prematuraferenciación y la liberación de los hemocitos de la glándula linfática, distinguiendo embrionario / larval frente a linajes de glándula de linfa pueden estar limitadas por el patrón de expresión del reportero hemocyte fluorescente usada. El protocolo que aquí se presenta se basa en vivo de formación de imágenes, hemocitos marcados con fluorescencia. En el futuro, puede ser modificado para permitir la detección de células liberadas después de la fijación, por ejemplo, usando inmunocitoquímica. En este caso, puede ser necesario el protocolo que ser adaptado para asegurar la adhesión completa de las células de la sangre, por ejemplo mediante el aumento de los tiempos de incubación de adhesión, y la adición de recubrimiento de deslizamiento adhesivo, tal como concanavalina A. Dado que el método permite la recuperación de hemocitos y su manipulación ex vivo, se beneficiará de una amplia gama de estudios biológicos y bioquímicos de desarrollo, de células. Células residentes y sangre circulante se encuentran en todas las etapas de desarrollo de los postembryonic Drosophila y otros invertebrados 22, suggesting que la adaptación de este método se beneficiará de una amplia gama de estudios más allá del sistema hematopoyético de larvas de Drosophila.

La investigación en el modelo de invertebrados Drosophila melanogaster ha conducido al descubrimiento de la inmunidad innata 1, y ha facilitado la comprensión de diversos aspectos del desarrollo de células sanguíneas 2-4. Drosophila hematopoyesis se puede dividir en el linaje de hemocitos embrionarias / larvales, que se originan en el embrión y expandirse en la larva, y el linaje de los ganglios linfáticos hemocitos 4,5. A continuación, presentamos un protocolo que se centra en el linaje de hemocitos embrionarias / larval, que en la larva de Drosophila comprende principalmente plasmatocitos (macrófagos) y algunas células de cristal 4. En la larva, hemocitos del embrión persisten y colonizan bolsillos segmentally repetidas y terminales hematopoyéticas (HPS), ubicado entre la epidermis y las capas musculares de la pared del cuerpo larval 5,6. Sobre la base de su naturaleza como macrófagos auto-renovación de 6, su residencia predominante en microambientes tisulares locales 6, 7, y su linaje de las células sanguíneas más tempranos emergentes durante el desarrollo 6,8, esta población de células de la sangre se considera similar a los macrófagos del tejido de vertebrados auto-renovación, un linaje mieloide independiente recientemente identificado en una variedad de especies 4,9,10. Sin embargo, en Drosophila, algunas o todas de estas células residentes muestran también la plasticidad para dar lugar a otros tipos de células sanguíneas tales como células de cristal 11,12. Hemocitos larvas son predominantemente residente (sésiles), pero están en un estado de equilibrio dinámico entre varias postas de salud. Se liberan progresivamente en circulación, en particular, como el estadio de larva 3ª acerca pupariation 5-7. Retos inmunes, lesión o perturbación mecánica de plomo a una prematura, en este último caso reversibles, la movilización de hemocitos residentes en la hemolinfa 4,6,13. Estudios previos han sugerido que los residentes y circulanteshemocitos larvas son del mismo linaje, pero difieren en sus propiedades adhesivas o homing 6,7,13,14. Aislamiento selectivo de circulante frente hemocitos residentes reveló niveles elevados de proliferación en la población de hemocitos residente, lo que sugiere su exposición a las señales inductivas de las HPs larvas HPs 6. Drosophila están revestidos por epidermis y las capas musculares y albergar más racimos de neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico (SNP) y la función hepática se asemeja oenocytes 6. Funcionalmente, los experimentos de ablación de células mutantes y genéticos han demostrado que las neuronas sensoriales presentes en los HPs apoyar la supervivencia trófico y localización de los hemocitos de las larvas 6. Aquí se describe un método para el aislamiento específico y cuantificación de residentes y circulantes hemocitos de las larvas de Drosophila sola, y un protocolo para la movilización de hemocitos mecánica. Los métodos se pueden utilizar para la ex vivoestudio de hemocitos y, además se puede adaptar a otras etapas de desarrollo de Drosophila tales como la pupa y adulto, y otros sistemas de invertebrados. Dado que los estudios anteriores no distinguen entre los residentes y los hemocitos circulantes, este protocolo ofrece un estándar común para el estudio de las células sanguíneas residentes y ayudará a aumentar la coherencia de la investigación con células de sangre de invertebrados. En primer lugar, la purga / Ensayo Raspe Hemocyte describe el aislamiento diferencial y cuantificación automática de residente proteína marcada fluorescente y circula poblaciones hemocitos de las larvas de Drosophila sola; el protocolo ofrece dos opciones para microscopios comunes y azulejos equipadas escanear (Figura 1). Como resultado, se obtienen el porcentaje de hemocitos circulantes y el número total de hemocitos por larva. El método se basa en larvas de Drosophila transgénicos que expresan la proteína fluorescente entre sus células de la sangrepoblación. La elección del conductor hemocyte o reportero determina el resultado, es decir, que se visualiza población de células de la sangre y se cuantifica. Para etiquetar principalmente macrófagos (plasmatocitos), que comprenden la gran mayoría de la población residente y de circulación de hemocitos de la larva de Drosophila 6, transgenes adecuados incluyen Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ Gal4 15, Pxn Gal4 16, CRQ-GAL4 (por H. Agaisse 16), o come-GAL4 17; para el etiquetado de la relativamente pequeña población de células de cristal, líneas adecuadas son BcF6-PPC y GFP 18 o lz-GAL4 (por J. Pollock 19); para lamellocytes etiquetado, un tipo de célula especializada inducida principalmente por los retos y las lesiones 13 inmunes, por ejemplo, MSNF9mo-mCherry se puede utilizar 17. Algunos conductores transgénicas se expresan en una amplia gama de sangre diferenciadacélulas y progenitores, tales como He - GAL4 20, que las etiquetas de alrededor del 80% de todas las células de la sangre de larvas 20. Tenga en cuenta que en todos los casos en que se utilizan los conductores GAL4, se requiere combinación con UAS-GFP u otra proteína UAS-transgén fluorescente. En la sección Resultados, este método se utiliza para supervisar el número de células de la sangre y el comportamiento de circulación en el transcurso del desarrollo de las larvas. En segundo lugar, la perturbación Ensayo Hemocyte describe una etapa precedente diseñado para separar los hemocitos residentes por manipulación externa, lo que permite posteriormente la evaluación de la capacidad de los hemocitos de volver a adherirse y el hogar de HPs dentro de un marco de tiempo limitado (30 - 60 min) 6. Típicamente este ensayo es seguido por el / Ensayo Raspe Bleed para determinar el porcentaje de hemocitos circulantes por larva. Se presenta un protocolo simplificado para este ensayo (Figura 1 D), que utiliza la perturbación por el ingenio vórtexperlas de vidrio h, en lugar de manipulación de la larva individual con un cepillo de pintura como se ha descrito previamente 6. En la sección de resultados, este ensayo se usa para demostrar que flotador hemocitos transitoriamente individual en la hemolinfa y puede ser recuperada en la fracción de hemocitos circulantes. El ensayo también es útil para cuantificar las diferencias de hemocitos en su homing / adherencia a los sitios residentes, comparando por ejemplo, los diversos antecedentes genéticos o condiciones de estimulación. Tenga en cuenta que esta manipulación mecánica refleja un proceso reversible y es distinta de la movilización hemocyte residente Infección o inducida por la lesión, que por lo general no son reversibles en un corto período de tiempo 4,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6cm/9cm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>One for each genotype to be evaluated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water squirt bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spoon/spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. a &#34;liner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cavity dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen: Super PAP PEN IM3580</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila cell culture media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 1ml syringes with needles (27G &#189;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>For dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 212-600 micron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>One per genotype evaluating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: Hml&#916;-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or Hml&#916;-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope with camera attachment</td>
			<td>Leica or Keyence</td>
			<td></td>
			<td>With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying blood cell populations of the drosophila melanogaster larva

En los vertebrados, la hematopoyesis está regulada por microambientes inductivas (nichos). Del mismo modo, en el modelo de invertebrados organismo Drosophila melanogaster, microambientes inductivos conocidos como bolsillos hematopoyéticas larvales (HPS) se han identificado como sitios anatómicos para el desarrollo y la regulación de la sangre células (hemocitos), en particular del linaje de los macrófagos auto-renovación. HPs son segmentally repetida bolsas entre la epidermis y las capas musculares de la larva, que también comprenden las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. En la larva, residentes (sésiles) hemocitos están expuestos a anti-apoptótica, adhesivo y señales proliferativas de estas neuronas sensoriales y, potencialmente, otros componentes de los hps, tales como el músculo y las capas epiteliales de revestimiento. Durante el desarrollo normal, la liberación gradual de hemocitos residentes de los combustibles HPs la población de hemocitos circulantes, que culmina en la liberación de most de los hemocitos residentes en el inicio de la metamorfosis. Ataques inmunológicos, lesiones físicas o perturbación mecánica desencadenan la liberación prematura de hemocitos residentes en circulación. El interruptor de hemocitos de larvas entre ubicaciones residentes y la circulación plantea la necesidad de una norma / procedimiento común para aislar selectivamente y cuantificar estas dos poblaciones de células de sangre de larvas de Drosophila sola. En consecuencia, este protocolo describe un método automatizado para liberar y cuantificar el residente y hemocitos circulantes de larvas sola. El método facilita enfoques ex vivo, y puede ser adaptado para servir a una variedad de etapas de desarrollo de Drosophila y otros organismos invertebrados.

Para ilustrar los resultados típicos de los métodos descritos, se utilizó por primera vez la purga / Ensayo Raspe Hemocyte para delinear la progresión de números hemocyte larvas y su residencia en el transcurso del desarrollo de las larvas (Figura 4). Residente y circula poblaciones larvarias de hemocitos fueron aisladas de las larvas sola (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Él-GAL4 etiquetar la gran mayoría de los hemocitos de las larvas) y se cuantificó usando ImageJ. Las cohortes de larvas de tamaño 1.2 mm (~ 48 AEL hora o 1 st estadio), 2,5 mm (~ 80 AEL hr o tarde 2º estadio), y 3,5 mm fueron examinados (~ 96 AEL hr o 3er estadio) (Figura 4) . Número de hemocitos se expandieron a lo largo del desarrollo larvario, se correlaciona con y superando las estimaciones previas sobre la base de microscopía de luz de tinte manchado larvas 7 y contando en directo de proteína marcada hemocitos fluorescentes a través de la cutícula larval 6. En 1 ins stlarvas de alquitrán de casi todos los hemocitos fueron residente, mientras que la fracción de hemocitos circulantes aumentó progresivamente durante el curso del desarrollo de las larvas (Figura 4B, C), consistente con las publicaciones anteriores 6,7. A continuación examinamos si el método monitorea fielmente la transición de hemocitos entre el residente y poblaciones circulantes. Tomando ventaja del fenómeno que hemocitos residentes pueden ser transitoriamente individual aislada por la perturbación mecánica y que re-se adhieren a sus sitios residentes espontáneamente 6, nos dispersamos hemocitos residentes por agitación con perlas de vidrio como se describe en el Ensayo de perturbaciones Hemocyte. De hecho, la perturbación mecánica de las larvas condujo a un aumento espectacular en la población de hemocitos circulantes a expensas de hemocitos residentes (Figura 5). Después de un período de recuperación de 45 min, hemocitos habían regresado en gran medida a su estado adherente, tanto por inspección visual y por el comosessed porcentaje de células circulantes (Figura 5D, E). Como era de esperar, el número total de hemocitos se mantuvieron estables en el tiempo, a pesar del cambio de hemocitos entre las que circulan y residentes poblaciones. Varias consideraciones adicionales fueron tomadas en cuenta. Para confirmar que vórtex no causar daños importantes tejido, vórtex con perlas de vidrio se realizó en presencia de azul de tripano (Sigma) durante diversos períodos de tiempo (1, 5, 20 min). Tanto 1 y 5 min vórtex no causó ninguna interrupción del tejido obvia, mientras que 20 min vórtex resultó en pequeñas áreas de daño, se asemeja a los daños causados ​​por puntos de sutura aguja utilizada como control positivo (Figura Suplementaria 1). Mientras que el daño interno de la epidermis o en otros tejidos sin dañar la cutícula no se puede excluir, parece este escenario bastante improbable como hemocitos de 1 min y 5 larvas de re-adherido en el patrón esperado y los plazos min-tratada, lo que sugiere la integridad de las larvas no era de compromisod (Figura Suplementario 1). En contraste, las larvas vórtex durante 20 min sufrido de una falta de re-adherencia, y ni siquiera muestran la unión de hemocitos circulantes a los sitios de heridas epidérmicas, como se ha descrito previamente 14. Por último, para demostrar la reproducibilidad del método, se compararon las réplicas biológicas de 2,5 mm larvas de los dos experimentos anteriores, que se llevaron a cabo por los experimentadores distintas. Como se ilustra en la Figura 2 Suplementario, ambas cohortes mostraron números totales comparables de hemocitos por larva, y el porcentaje de hemocitos circulantes. T prueba de Student no mostró diferencias estadísticamente significativas, lo que sugiere que el método es reproducible y ampliamente aplicables. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Hemocyte Bleed / Raspe y Disturbio Ensayo s<html> etup y esquemática. (A) de una única imagen de instalación de diapositivas: cinco cuadrados de 2 mm para imágenes con un objetivo de 5X (B) Azulejos de configuración de diapositivas Scan:. Cuatro plazas 3 mm para purga de imágenes / raspaduras de ≤2.5 mm larvas con un microscopio de barrido de baldosas. Objetivos recomendados para imágenes son 5X o 10X. (C) Bleed / Raspe ensayo cuantificaciones esquemáticos y resultantes utilizando ImageJ. (D) en el ensayo de perturbación, el patrón de hemocitos se interrumpe mecánicamente por agitación larvas con cuentas de vidrio. Las larvas se les permitió recuperarse durante un período de 45 min durante el cual hemocitos volver a adherirse a los bolsillos hematopoyéticas. Las propiedades adhesivas de hemocitos pueden ser evaluados por este método, cuantificando el porcentaje de hemocitos en circulación después de la perturbación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> formas &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Bleed / Ensayo Raspe para liberar circulante y hemocitos residentes. (A) Para purgar una larva, incisiones ventrales en los extremos anterior y posterior de la larva se hacen (tijeras de símbolos). (B) hemocitos en circulación, que saldrán de las incisiones y asentarse en la superficie de la diapositiva. (C) El ganglio linfático (LG) se encuentra inmovilizado y, sin pincharlo. Hemocitos residentes son liberados por golpeando y / o raspado de la larva con una aguja hemocitos (D) residentes en la diapositiva.. (E, F) El proceso Raspe se repite hasta que todos los hemocitos residentes son liberados. El cadáver de larvas que contiene la glándula linfática intacta se quede atrás. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. automatizado cuantificación de hemocitos usando ImageJ. (A, B) Después de abrir un archivo de imagen de hemocitos en ImageJ, el nivel umbral inferior se ajusta para tener en cuenta todas las celdas de la imagen. (C, D) Analizar partículas requiere establecer el tamaño de píxel de células, la circularidad, y la lectura del resultado formato (por ejemplo, superposición de contornos). (E) ventana Resumen muestra el número de hemocitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. Los resultados representativos (1). Número de hemocitos y estado de residencia durante el<html> curso del desarrollo larval. (A) Información general de las etapas larvales utilizados; 1 st estadio (48 hr AEL; ~ longitud 1,2 mm); 2º (AEL 80 h; 2,5 mm de longitud) instar; 3º estadio (96 hr AEL; ~ 3.5 mm de longitud). El genotipo es Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Él-GAL4. Etapas fueron confirmados mediante la evaluación mouthhooks larvales. (B) Diagrama de Abogados de circulante y número de hemocitos residente en las respectivas fases larvarias. (C) Porcentaje de hemocitos circulantes. Tenga en cuenta que la fracción de hemocitos circulantes aumenta desproporcionadamente en el transcurso de desarrollo de las larvas. (D) hemocitos totales, resultante de la suma de circulante y hemocitos residentes por larva. Hemocitos se cuantificaron utilizando el método de purga / Raspe; n ≥ 6 larvas / estado, barras de error muestran la desviación estándar, los hallazgos confirmados en 3 replicar experimentos independientes.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> Figura 5. Los resultados representativos (2). Efectos de la perturbación mecánica en la residencia de hemocitos. (AC) Ejemplo de una larva antes y después vórtex con cuentas de vidrio, seguido por la recuperación de 45 min (A) No hay control de disturbios.; hemocitos se localizan en los bolsillos hematopoyéticas (B) Patrón hemocyte Interrumpió a 0 minutos después de vórtex larvas en una suspensión de cuentas de vidrio y agua (C) Patrón Hemocyte a los 45 min de la recuperación posterior a la perturbación..; muchos hemocitos se han trasladado a los bolsillos hematopoyéticas; nota ampliada dorsal-vasos grupos asociados y rayas dorsales que son sitios predominantes de la acumulación temprana posterior a la perturbación (flechas). El genotipo es Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Él-GAL4 x yw. (D) Porcentaje de hemocitos cuantificados por el método de purga / Raspe circulante. (E) hemocitos totales, resultante de la suma de circulante y hemocitos residentes por larva. n ≥ 4 larvas / estado, barras de error muestran la desviación estándar, los hallazgos confirmados en 3 replicar experimentos independientes. La prueba t de Student para confirmar importancia, NS (no significativo), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Analizando poblaciones de células sanguíneas de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

12.2K vistas.  University of California San Francisco. Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

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Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

La cría de la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bajo axénicos y Condiciones gnotobióticos

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelación, cultivo y criopreservación de líneas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Captura de la respuesta de la lesión cardíaca de las poblaciones celulares objetivo a través de imágenes tridimensionales del corazón despejado

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Imágenes en animales enteros de Drosophila melanogaster mediante tomografía microcomputada

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Imágenes de explantes cerebrales vivos de larvas de Drosophila melanogaster en el tercer estadio

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor destacado: Investigación de la dinámica de la división celular asimétrica: un protocolo para la obtención de imágenes en vivo de explantes cerebrales de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...