Este método puede ayudar a responder preguntas clave con respecto a la regulación genética de la formación y el mantenimiento de la barrera blood - brain durante múltiples etapas de desarrollo de la drosophila. Este método también se puede adaptar para examinar la permeabilidad de otras barreras, como el epitelio intestinal en una variedad de organismos. La principal ventaja de esta técnica es que permite evaluar la función de barrera hematoencefálica en los tejidos vivos.
La demostración visual de este método es crítica, ya que las manipulaciones de ejemplo pueden ser difíciles y muchos pasos requieren mucha atención a los detalles. Para la recogida de embriones colocar un mínimo de 50 hembras vírgenes con 20 a 25 machos por botella con alimentos de agar harina de maíz e incubar estas moscas durante uno o dos días antes de comenzar las colecciones. El día antes de la recolección, platos calientes de agar con jugo de manzana a 25 grados centígrados durante la noche.
A la mañana siguiente transfiera las moscas anestesiadas de dióxido de carbono a una jaula de recolección y coloque un plato de agar de jugo de manzana precalejado con un pequeño frotis de pasta de levadura en el extremo abierto de la jaula. A continuación, fije el plato a la jaula con la manga roja. Para limpiar embriones más viejos, permita que las moscas pongan huevos en un plato de agar de jugo de manzana durante una hora a 25 grados centígrados.
Al final de la incubación, invierta el lado de la malla de la jaula hacia abajo y toque las moscas en el fondo de la jaula. Sustituya el agar jugo de manzana por un nuevo plato de agar de jugo de manzana precalegado con un pequeño frotis de pasta de levadura. Deje que las moscas pongan huevos en el nuevo plato durante otra hora a 25 grados centígrados.
Para recoger embriones de la etapa tardía 17 para inyección, sustituya el plato de agar de jugo de manzana por un nuevo plato precalgado por un frotis de pasta de levadura. Y dejar que las moscas pongan huevos en el plato a 25 grados centígrados. Después de una hora, reemplace la placa y la edad de la placa con embriones recogidos durante 19 horas a 25 grados Celsius para que los embriones tendrán de 20 a 21 horas de edad en el momento de la toma de imágenes.
Al final de la incubación de 19 horas, retire la placa de recogida de embriones de la incubadora y cubra la superficie de la placa con PbTx. Utilice un pincel para aflojar los embriones de la superficie de la placa en un colador de malla de nylon de 70 micrómetros. Y coloque el colador con embriones en una solución de 50% de lejía en un plato de Petri de 100 milímetros durante cinco minutos con agitación ocasional a temperatura ambiente para descorionarlos.
Al final de la incubación, enjuague los embriones tres veces remolinos el colador en PbTx fresco, utilizando un nuevo plato Petri para cada lavado. Lave los embriones a un lado del colador con PbTx y utilice una pipeta de vidrio para transferir los embriones a una losa de gel de 2% agarosa. Retire el exceso de líquido con papel de filtro.
Alinee de seis a ocho embriones en la losa con los posteriores a la derecha y los lados dorsales hacia arriba y presione firmemente un trozo de cinta adhesiva de doble cara colocado en una diapositiva en la parte superior de los embriones. A continuación, desiccele los embriones a temperatura ambiente durante unos 25 minutos antes de cubrir los especímenes con aceite de halocarbono. Para la recolección larvaria, establezca una cruz con 5 a 10 moscas hembra vírgenes del genotipo deseado y la mitad de los machos del genotipo deseado en un vial con alimento de agar harina de maíz.
Después de cinco a siete días a 25 grados Celsius, dependiendo del genotipo, utilice fórceps para recoger suavemente larvas de tercera estrella errantes del vial y enjuague las larvas con PBS para eliminar cualquier alimento atascado. Transfiera las larvas a un plato de agar de jugo de manzana para su genotipado según sea necesario antes de usar un pincel para secar las larvas en un tejido. A continuación, utilice fórceps para transferir de seis a ocho larvas a un portaobjetos preparado con cinta adhesiva de doble cara.
Antes de la inyección, utilice un tirador de micropipetas para tirar de los tubos capilares en una forma de aguja estándar para las inyecciones de D.Melanogaster y ancle las agujas en arcilla en un plato petri. Para la inyección de embriones, utilice una punta de pipeta de carga de gel de 20 microlitros para cargar una aguja preparada con 5 microlitros de 10 kilodatones dextrán conjugados con cloruro ácido sulforhodamine 101 y cargue la aguja en un soporte de aguja. Coloque la aguja en un micromaniprógrafo asegurado a una base de acero y ajuste el aparato de inyección a 50 libras por pulgada cuadrada y de 5 a 10 milisegundos con un rango de 10.
Coloque la corredera en la etapa del micromanipulador y cepille el borde de la aguja contra el borde de la cinta de doble cara en un ángulo de 45 grados para crear una punta ligeramente inclinada rota lo suficiente como para permitir el flujo del dextrán de 10 kilodalton a través de la abertura. Bombee el pedal hasta que el tinte esté en la punta de la aguja. Alinee la aguja de modo que sea paralela al embrión y perfore el extremo posterior de la muestra.
Bombee el pedal para inyectar dos nanolitros de tinte en la muestra. Tenga en cuenta el tiempo de inyección para fines de incubación y continúe por el portaobjetos para inyectar muestras adicionales. Para la inyección larvaria, haga una abertura en ángulo ligeramente mayor que la que se utiliza para inyectar embriones y angulo la aguja ligeramente hacia abajo hacia la muestra antes de inyectar las larvas con 220 nanolitros similares a los demostrados para las muestras embrionarias.
Al final de la incubación por inyección de 10 minutos, utilice un aplicador con punta de algodón para aplicar vaselina en los lados derecho e izquierdo de las muestras en la diapositiva como espaciador. Coloque el resbalón de la cubierta en la parte superior y coloque la diapositiva en la etapa del microscopio confocal. Seleccione el objetivo 20X e imagine las muestras a lo largo de la profundidad de cada embrión.
Luego calcule el porcentaje de muestras con una barrera hematoencefálica comprometida de acuerdo con la fórmula. Antes de comenzar el procedimiento de disección, utilice esmalte de uñas para montar dos resbalones de cubierta espaciados aproximadamente 0,5 centímetros de separación en un portaobjetos y coloque una larva inyectada en PBS en el portaobjetos al final de la incubación de 30 minutos. Usando un par de fórceps, agarre la larva a la mitad del cuerpo larvario y use un segundo par de fórceps para separar las mitades anterior y posterior de la larva.
A continuación, utilice un par de fórceps para agarrar la región anterior en los ganchos de la boca y utilice el segundo par de fórceps para invertir la pared del cuerpo sobre la punta del primer par de fórceps. El cerebro y el cordón nervioso ventral estarán expuestos. Separe el cerebro y el cordón nervioso ventral de la pared del cuerpo cortando los nervios si es necesario y retire la pared del cuerpo de la diapositiva.
Cubra la muestra con 10 microlitros de 80% de glicerol. A continuación, coloque un resguardo de cubierta en la parte superior de la muestra para obtener imágenes e imágenes de las muestras para determinar el porcentaje de muestras con una barrera hematoencefálica comprometida como se ha demostrado. Cuando los embriones de tipo salvaje en la etapa tardía 17 se inyectan con 10 kilodalton dextran conjugados con sulforhodamine 101 acid chloride fluorescent dye, la molécula de dextrán grande se excluye del cordón nervioso ventral, como se esperaba.
Los embriones mutantes crudos 1 exhiben una barrera hematoencefálica intacta, similar a la observada en embriones de control de tipo salvaje. Por el contrario, los embriones mutantes crudos homocigoto 1 presentan defectos en la integridad de la barrera hematoencefálica, con la inundación de 10 kilodalton dextrán en el cordón nervioso ventral, lo que indica un fallo en la barrera hematoencefálica que se está formando. En muestras larvales de control de tipo salvaje, 10 kilodalton dextran no penetra en la barrera hematoencefálica y se excluye del cerebro y del cordón nervioso ventral.
Al intentar este procedimiento, el envejecimiento adecuado de los embriones es fundamental para garantizar que las muestras se examinen a una edad a la que se espera que la formación de barreras hematoencefálicas sea completa. Después de este procedimiento, los mutantes que exhiben una barrera hematoencefálica comprometida pueden ser estudiados usando genética, inmunohistoquímica y microscopía para entender mejor la función genética a nivel celular. Esta técnica permitirá a los investigadores identificar genes adicionales que son críticos para el establecimiento y mantenimiento de la barrera hematoencefálica.
