Yazarlar herhangi bir onayları vardır.

Deney prosedürleri ve hayvanların etik tedavi Pittsburgh IACUC Üniversitesi (protokol # 1104674) tarafından onaylanmıştır. G6PD Boyama karışımının hazırlanması 1. NOT: Her birinin reaktiflerin nihai konsantrasyon olduğunu temin etmek; 5 mM glikoz-6-fosfat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0.35 mM 1-metoksi-5-methylphenazinium metil sülfat (MMPMS) ve 0,8 mM NBT. Başlangıç ​​konsantrasyonu, 40 ml&#39;lik bir nihai hacim için elde edilmiştir, her bir reaktif için 1,8,9. Çözümler, taze hazırlanmış ve her gün kullanıldı. <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde Ekim ortamı 35 ml 200 mM pH 7.4 fosfat tampon maddesi (PB) 2 ml ilave edilir ve kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Solüsyon pH 7.4 pH kağıdı ile onaylayın. Aksi takdirde çözüm atın. </li><li> 61 mg G6P 200 mM PB 0,94 ml içinde çözüldü ekle, 61 mg NADP 200 mM PB 0,94 ml içinde çözüldü ve 41 mg MgCl2 0.96 ml 100 mM PB içerisinde çözündürüldü. PH olduğunu Reconfirm ~ 7,4 with pH kağıdı. Değil ~ 7.4 Eğer çözüm atın. </li><li> 200 mM PB (pH 7.4) 0.25 ml içinde çözüldü MMPMS 5 mg ekleyin. Şiddetle açık koyu kırmızı homojenatın üretmek için ortaya çıkan reaksiyon karışımı sallayın. Çözelti bulanık olduğu takdirde, karışım atılmalıdır. Reaksiyon karışımını içeren tüp ışığa maruz kalmasını en aza indirmek için folyo ile sarılır. Son bileşeni, NBT, hazırlanırken oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı saklayın. </li><li> Bir O-ring kapaklı bir 2 ml tüp içinde NBT 164 mg 0,4 ml susuz dimetil formamid (DMF) ile 0,4 ml susuz etanol eklenerek ayrı ayrı 5 mM NBT solüsyonu hazırlayın. Gevşek kapağını kapatın (ağzı sıkıca kapatılmış değil) ve NBT çözelti içinde olduğu kadar bir yağ banyosu içinde güçlü bir raddeye çözüm getirecek. 8 </li><li> Çözündürülmüş NBT oda sıcaklığına soğumaya bırakıldı ve daha sonra tepkime karışımına Ekim çözüm tüm ekleme ve berrak bir çözelti elde etmek için kuvvetli bir şekilde çalkalanır izin verir. Koyu kırmızı veya amacı ü başlangıç ​​portakal rengi-kırmızı çözelti renk değişimi dikkate alınmalıdırzamanla le rengi. Bu normal. </li><li> Kullanımdan önce 1 saat süreyle 37 ° C sıcak bir odaya son G6PD boyama karışımı yerleştirin. </li></ol> 2. Hayvan Tedavisi ve Doku Toplama <ol><li> DNA hasar verici madde ile, örneğin 6 haftalık C57BL / 6 erkek farelere verilmesi tedavi, ip enjeksiyonu ile 200 ul PBS hacminde 10 mg / kg azoksimetan (AOM). Ip enjeksiyonu ile 200 ul PBS kontrol fareleri tedavi edin. </li><li> 90 gün sonra, CO IACUC protokolü ile onaylanan servikal dislokasyon 2 boğulmaya fareler euthanize. </li><li> Cerrahi sadece sternum tabanına anüs yukarıdan karın boşluğuna açılır. Vücut boşluğundan dışarı ince bağırsağı taşımak ama tüketim yok. Sadece rektum çekum altında alt bağırsak tüketim. 10 </li><li> Dikkatli bir şekilde mikro-disseksiyon makas kullanılarak kolon bir tarafı boyunca dilim ve temiz ve steril PBS ile yıkanarak açılan kolondan dışkı çıkarmak. Tüketim İsviçre ruloBir doku kalıbı içinde luminal dışa bakan tarafı ve yerine d kolon. 10 </li><li> Tamamen bir Dewar sıvı N 2 ihtiva eden Ekim, orta ve yer kalıpta kolon batırmayın. Plastik taban sadece Ekim ortamı donup kadar sıvı N 2 ile temas halinde olacak şekilde kalıp tutun. </li><li> Dondurulmuş bölümleri kesme kadar -80 ° C&#39;de dondurulmuş doku bloğu saklayın. G6PD enzimin inaktivasyonu ile sonuçlanacaktır bir fiksatif, kullanmayın. </li></ol> Dondurulmuş Bölüm 3. Hazırlık <ol><li> -25 ° C de, bir kriyostat kullanarak 7 um kadar bir kalınlıkta donmuş doku bölümleri kesilir. 4 ardışık 7 mikron bölümleri kesmek için ve aynı slayt (Şekil 1) ikisini yerleştirin. Kolon (Şekil 1) bir düzeyde temsil etmek 2 slaytları ya da dört ardışık 7 mikron bölümleri hazırlayın. </li><li> Pr son bölümünden&gt; 50 mikron minimum mesafe ile bir sonraki seviyeye için tekrarlayınevious seviyesi. Bu mesafe, her seviye için değerlendirilen kriptler birbirlerine yinelenen vermedi sağlanmalıdır. </li><li> Sıkça kesme sırasında biriken Ekim artıklarını çıkarın% 100 etanol ile kriyostat bıçağını silin. Kesit sürdürülür önce kuru bıçak birikmiş statik elektriği boşaltmak için, antistatik kurutucu tabaka ile silinir. C o -80 donmuş bölümleri ile mağaza slaytlar </li></ol> Dondurulmuş Bölüm Doku 4. Boyama <ol><li> Yüksek nem ile 37 ° C sıcak odada enzim histokimyası reaksiyonu gerçekleştirin. NOT: Bir kuluçka fırında veya sıcak bir slayt enzimatik reaksiyonu çalışılıyor yoksul ve tutarsız G6PD boyama açtı. </li><li> Silikon gres (Şekil 1) kullanılarak birbirine bağlanmış iki 1.5 cm x 0.15 cm çelik pullar (iç çap x yükseklik) kullanarak doku boyama kuyu oluşturun. Merkezi ile kuyu tabanı sığdırmak için parafilm kesin kesip ve iyi yerslayt doku bölümünde üzerinde d. NOT: yıkayıcı altındaki parafilm slayt ve doku bölümünde viskoz G6PD boyama karışımını tutar yıkama arasında bir mühür oluşturur. Çalışmada her doku bölümü G6PD reaksiyon boyama karışımının aynı hacimde alması 0.5 ml hacminde - Bu yapı, bir 0.4 ile iyi verir. </li><li> 10 dakika boyunca sıcak bir odada 37 o C&#39;de dondurulmuş doku slaytlar inkübe edin. 37 ° C&#39;de, 45-50 dakika boyunca, her doku kesiti oyuk (slayt başına 2 bölüm) için G6PD boyama reaksiyon karışımı ilave edildi. Sıcak odadan slaytları çıkarın ve dikkatle slaytlar kapalı paslanmaz çelik kuyuları kaldırın. </li><li> Uzun kenarında Set slaytlar reaksiyon ortamı boşaltmak için izin vermek. 30-60 dakika boyunca 100 mM PB (pH 7.4) içinde Slaytları, doku lekeleme bozmadan dokudan G6PD boyama tepkime karışımını ayırmak üzere. PB tuzları çıkarmak için 5-10 dakika için damıtılmış su içinde slaytlar batırın </li><li> Add dokuyu Sealdoku üzerine bir damlalık gelen floro-jel ing ve kurutun için ~ 30 dakika bekliyorum. Mutasyona uğramış crypts belirlenmesini bulandırabilir kabarcıkları kaçının. Not: kabarcıklar oluşturan, prosedür damıtılmış su içinde ıslatılarak floro-jel çıkarıldıktan sonra tekrar edilebilir. Onlar tuzak hava kabarcıkları eğilimi gibi kapak fişleri kullanmayın. </li></ol> G6PD Mutant Crypts ve Mutasyon Frekansı 5. belirlenmesi <ol><li> Işık mikroskobu altında G6PD mutant crypts için slaytlar analiz edin. NOT: Tam mutant crypt tanımlamak için kullanılan kriterleri: (i) tüm crypt mavi renk yoksun; (ii) crypt dış yapısı (iii) mutant crypt (iv) iki gözlemci bir mutant aynı crypt tanımlamak zorunda bitişik 7 mikron kesitlerinde gözlenen ve oldu, bozulmamış oldu. Bitişik 7 mikron bölümlerde gözlenen mutantlar tek mutant olarak sayılır. </li><li> Görüntü her G6PD mutant 40x büyütme crypt ve 5.0 megapiksel kamera ile kullanarak görüntüleri kataloggörüntüleme yazılımı. </li><li> 10x büyütme (Şekil 1C) yüzölçümü en küçük ve görüntünün o ile seviyeden, her fare için bir temsilci bölüm seçerek fare muayene kriptalarının toplam sayısını ölçmek. NOT: A level nedeniyle yakınlığı genellikle birden fazla bölümünde crypts mutasyona gösterirler arka arkaya dört 7 mikron bölümleri (Şekil 1D), temsil eder. Seviyeleri kolonun farklı alanlardan crypts görselleştirmek için um 50&gt; ayrılır. </li><li> Her resim dosyasını açın ve görsel (Şekil 1C kutuları olarak gösterilen) dosyalarını analiz ederek bir seviyede crypts sayısını. Görüntüler dosyalar tek bir dosya olarak düşük 300&gt; 20 olarak crypts gözlenen kriptalarının sayısı değişecektir. </li><li> Her bir kolon için G6PD mutant crypts için taranmıştır seviye sayısı, her bir fare için seçilen seviyeye (Şekil 1C) gelen kript sayısı çarpın. Örneğin, toplam sayımMutant kriptlerin için tarama 8 seviyeleri ile çarpılarak seçilen seviye başına 1250 kriptler 10.000 crypts toplam sayısını eşittir. İstatistiksel analiz için her kolon için 10.000 crypts az değerlendirin. </li><li> Her tedavi için MF hesaplamak için filtrelenmiş kript toplam sayısı tüm hayvanların gözlenen mutantların sayısı birleştirin. Tedavi edilmeyen farelerdeki arka kök hücre MF seviyesi &lt;0.1x10 -4 önce C57BL / 6 farelerinde bildirilen yakındır (Tablo 1). 11&#39;dir </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Genellikle bir bileşimin genotoksik etki DNA değiştirme kabiliyeti tarafından belirlenir. Bu, normal olarak doku izole DNA adduct küresel seviyesinin ölçülmesiyle yapılır. AOM için bu kolonda Ø 6 -methylguanine aduktlar miktarının içerecektir. Böyle kök hücre niş gibi özel hücre tipleri, içinde hasar bu yaklaşım bilgileri kullanarak, kaybolur. Adüktlerinin sadece küçük bir alt grubu sonunda sabit mutasyonlara dönüştürülür Ek olarak, bir DNA adükt mutasyon ile aynı değildir...

Kolon kanseri DNA zarar verebilir çevresel ajanlar ve diyet bileşenlerin etkilenmemesi içerir ve (örneğin, APC), tümör baskılayıcı genler mutasyonları onkojenler somatik mutasyonlar aktive (örneğin, ß-katenin) ya da inaktive üretmek düşünülmektedir. Bu kritik mutasyonlar kolon kök hücrelerinde meydana geldiği kabul edilir. Çünkü kolon epitel eşsiz kript mimarisi, bu kolon kanserinin ilişkili kimyasallara maruz hayvanların sonra kolonda kök hücre mutasyonları ölçmek mümkündür. Mutasyonlar, bir kript içinde tüm hücrelerde mevcut olacak şekilde çeşitli X-bağlantılı enzimler, kök hücrelerin meydana mutasyon için gösterge olarak görev yapabilir. Daha önce, bir prosedür farelerde kalın bağırsak tümörlerini neden kimyasallar da X-bağlı glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G6PD) geni mutasyonlarının analizi ile kolon somatik kök hücre mutasyonlan oluşturulan gösteren basıldı. 1-3Yöntem herhangi bir seçim baskısı olmadan kolon kök hücrelerin rastgele somatik mutasyon sıklığı quantifies. Prosedür muamele edilmiş olan ve kontrol farelerinin sabitlenmemiş dondurulmuş kolon bölümlerinin üretimi ve işlevsel G6PD aktiviteye hücrelerinden yoksun kript tanımlanmasını içerir. , Beyaz görünmesini bu mutasyona uğramış kriptler, mutasyon da mutasyona uğramış G6PD geni barındıran soyu doğurdu kök hücre meydana geldiğini göstermektedir. Enzimatik tahlilde, G6PD eksikli mutant kript nitro mavi tetrazolium (NBT) azalması için gerekli olan glikoz-6-fosfat, okside edilemez. G6PD enzimi işlevsel olduğu zaman, boyama karışımında NBT enzim ve mavi &quot;boyama&quot; hücre yerde biriken çözünmeyen formazana ve çökeltileri düşürülür. G6PD mutantlar hücreler mavi lekeli vahşi tip crypts aksine beyazımsı kalır. Bu yöntem, bir &quot;boş&quot; fenotipe sahip mutasyonları ölçer. Tr Çünküenzimler, örneğin G6PD gibi bölümler, sulu bir çözeltiye yerleştirilmiş ise, bir tespit edilmemiş dokuda bölümündeki hücrelerin üzerinden difüze olabilir, bu analiz edilecek doku kesitlerinde enzim stabilize etmek için gerekli olan. 4 enzim stabilizasyon Doku G6PD enzimatik reaksiyon için gerekli olan küçük reajan moleküllerinin difüzyon engel olmamalıdır. Biz orijinal prosedüre önemli bir dizi değişiklik yaptık. Kritik enzimatik boyama ortam pH&#39;ının kontrolüne ve deneyde kullanılan bileşenlerin çözünürlüğünü kolaylaştırır Optimal Kesme Sıcaklık Bileşim (Ekim), polivinil alkolden değiştirilmiştir. Her bir doku kesiti G6PD reaksiyon karışımının, aynı hacimde, böylece çelik pullar imal 0,5 mi kuyu - boyama 0,4 kullanılarak gerçekleştirilir. Bir prosedür kalmadan kolon dokusunun büyük bir örnekleme sağlayan görüntülü bölümünde kriptalarının sayısını tahmin için geliştirilmiştirEl&gt; Her kolon için 10 5 crypts saymak. Bitişik 7 mikron doku kesitlerinde analizi, potansiyel boyama eserler azaltır birden fazla slayt üzerinde bir mutant crypt görselleştirme tanıyor. Bu değişiklikler prosedürü daha verimli ve tekrarlanabilir hale. Bu yeniden protokolü kullanarak, kemirgenlerde iyi bilinen kolon kanserojen azoksimetan C57BL / 6 farelerinin maruz kaldıktan sonra kolon kök hücrelerinde mutasyon sıklığı sayısal var. 5-7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitroblue tetrazolium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose-6-phosphate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm room&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of  colonic stem cell mutations

Kök hücre mutasyonları ölçmek için yeteneği, kimyasal potansiyel kansere yol mutasyonlar neden olabilir eğer ve ne ölçüde eleştirel bir hücre popülasyonu ölçmek için güçlü bir araçtır. X-bağlantılı glikoz-6-fosfat dehidrojenaz geni kök hücre mutasyonlan ölçmek için bir enzim testi kullanımı daha önce bildirilmiştir. 1 Bu yöntem, bir veren bir reaksiyon karışımı ile kesitli doku dondurulmuş bölümleri ve inkübasyon hazırlık gerektirir Hücreler fonksiyonel glikoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzim üreten eğer mavi renk. Eğer değilse, hücreler beyaz görünür. Bu polivinil alkol yerine optimal kesme sıcaklık Bileşik (Ekim) ortamı kullanılarak reaksiyon karışımı olarak var. Bu pH ölçme kolaylaştırır G6PD boyama bileşenlerin çözünürlüğünü arttırır ve G6PD enzimin yayılmasını engellemektedir. Bir mutasyonun kök hücre meydana geldiğini göstermek için, tüm kript G6PD enzimatik yoksun olmalıdırfaaliyet. Bir kök hücre barındıran Sadece eğer bir fenotipik G6PD mutasyon crypt döl tüm G6PD enzimatik aktivitesini yoksun olacak. Kök hücre mutasyonu olan crypts belirlemek için, arka arkaya dört bitişik dondurulmuş kesitler (seviye) 7 um kalınlığında kesildi. Bitişik kesim yapma Bu yaklaşım, aynı mutasyona uğramış crypt bitişik bölümlerde görüleceği beri crypt tam mutasyona edildi uymasını sağlar. 50&#39;den fazla um ayrı olan doku örnekleri ile slaytlar fare başına&gt; 10 4 crypts toplam değerlendirmek için hazırlanmıştır. Mutasyon sıklığı tedavi grubunda yabani tip (mavi) kript sayısına göre ÷ gözlemlenen mutasyona uğramış (beyaz) kript sayısıdır.

Hayvanlarda kolon kök hücre mutasyonlarını ölçmek için yeteneği kanser indüksiyon mutasyonlar ilişkilendirmek için özel bir yol sağlar. Normal olarak, bu karsinogenezde önemli bir adım onkojenlerde mutasyonlar aktive edilmesi ve / veya tümör süpresör genler mutasyon inaktive içerir varsayılmıştır. Biz 200 ul PBS ya da PBS 200 ul 10 mg / kg AOM ile C57BL / 6 fareler enjekte edildi. AOM bilinen kolon kanserojendir. Kolonlar kök hücre mutasyonları için analiz edildi 90 gün sonra 5-7....

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations at JoVE.com

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.5K Görüntüleme.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Video: Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

Myh6-Promotörle Seçim ile kombinasyonu ES-Hücre-Programlama dayanarak Kemirgen Kardiyak Kalp Pili Hücre Agregaların Üretimi

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Gelişim Biyolojisi

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller<em&gt; Cre-lox</em&gt; Fare Modelleri

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...