Yazarlar herhangi bir onayları vardır.

Deney prosedürleri ve hayvanların etik tedavi Pittsburgh IACUC Üniversitesi (protokol # 1104674) tarafından onaylanmıştır. G6PD Boyama karışımının hazırlanması 1. NOT: Her birinin reaktiflerin nihai konsantrasyon olduğunu temin etmek; 5 mM glikoz-6-fosfat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0.35 mM 1-metoksi-5-methylphenazinium metil sülfat (MMPMS) ve 0,8 mM NBT. Başlangıç ​​konsantrasyonu, 40 ml&#39;lik bir nihai hacim için elde edilmiştir, her bir reaktif için 1,8,9. Çözümler, taze hazırlanmış ve her gün kullanıldı. <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde Ekim ortamı 35 ml 200 mM pH 7.4 fosfat tampon maddesi (PB) 2 ml ilave edilir ve kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Solüsyon pH 7.4 pH kağıdı ile onaylayın. Aksi takdirde çözüm atın. </li><li> 61 mg G6P 200 mM PB 0,94 ml içinde çözüldü ekle, 61 mg NADP 200 mM PB 0,94 ml içinde çözüldü ve 41 mg MgCl2 0.96 ml 100 mM PB içerisinde çözündürüldü. PH olduğunu Reconfirm ~ 7,4 with pH kağıdı. Değil ~ 7.4 Eğer çözüm atın. </li><li> 200 mM PB (pH 7.4) 0.25 ml içinde çözüldü MMPMS 5 mg ekleyin. Şiddetle açık koyu kırmızı homojenatın üretmek için ortaya çıkan reaksiyon karışımı sallayın. Çözelti bulanık olduğu takdirde, karışım atılmalıdır. Reaksiyon karışımını içeren tüp ışığa maruz kalmasını en aza indirmek için folyo ile sarılır. Son bileşeni, NBT, hazırlanırken oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı saklayın. </li><li> Bir O-ring kapaklı bir 2 ml tüp içinde NBT 164 mg 0,4 ml susuz dimetil formamid (DMF) ile 0,4 ml susuz etanol eklenerek ayrı ayrı 5 mM NBT solüsyonu hazırlayın. Gevşek kapağını kapatın (ağzı sıkıca kapatılmış değil) ve NBT çözelti içinde olduğu kadar bir yağ banyosu içinde güçlü bir raddeye çözüm getirecek. 8 </li><li> Çözündürülmüş NBT oda sıcaklığına soğumaya bırakıldı ve daha sonra tepkime karışımına Ekim çözüm tüm ekleme ve berrak bir çözelti elde etmek için kuvvetli bir şekilde çalkalanır izin verir. Koyu kırmızı veya amacı ü başlangıç ​​portakal rengi-kırmızı çözelti renk değişimi dikkate alınmalıdırzamanla le rengi. Bu normal. </li><li> Kullanımdan önce 1 saat süreyle 37 ° C sıcak bir odaya son G6PD boyama karışımı yerleştirin. </li></ol> 2. Hayvan Tedavisi ve Doku Toplama <ol><li> DNA hasar verici madde ile, örneğin 6 haftalık C57BL / 6 erkek farelere verilmesi tedavi, ip enjeksiyonu ile 200 ul PBS hacminde 10 mg / kg azoksimetan (AOM). Ip enjeksiyonu ile 200 ul PBS kontrol fareleri tedavi edin. </li><li> 90 gün sonra, CO IACUC protokolü ile onaylanan servikal dislokasyon 2 boğulmaya fareler euthanize. </li><li> Cerrahi sadece sternum tabanına anüs yukarıdan karın boşluğuna açılır. Vücut boşluğundan dışarı ince bağırsağı taşımak ama tüketim yok. Sadece rektum çekum altında alt bağırsak tüketim. 10 </li><li> Dikkatli bir şekilde mikro-disseksiyon makas kullanılarak kolon bir tarafı boyunca dilim ve temiz ve steril PBS ile yıkanarak açılan kolondan dışkı çıkarmak. Tüketim İsviçre ruloBir doku kalıbı içinde luminal dışa bakan tarafı ve yerine d kolon. 10 </li><li> Tamamen bir Dewar sıvı N 2 ihtiva eden Ekim, orta ve yer kalıpta kolon batırmayın. Plastik taban sadece Ekim ortamı donup kadar sıvı N 2 ile temas halinde olacak şekilde kalıp tutun. </li><li> Dondurulmuş bölümleri kesme kadar -80 ° C&#39;de dondurulmuş doku bloğu saklayın. G6PD enzimin inaktivasyonu ile sonuçlanacaktır bir fiksatif, kullanmayın. </li></ol> Dondurulmuş Bölüm 3. Hazırlık <ol><li> -25 ° C de, bir kriyostat kullanarak 7 um kadar bir kalınlıkta donmuş doku bölümleri kesilir. 4 ardışık 7 mikron bölümleri kesmek için ve aynı slayt (Şekil 1) ikisini yerleştirin. Kolon (Şekil 1) bir düzeyde temsil etmek 2 slaytları ya da dört ardışık 7 mikron bölümleri hazırlayın. </li><li> Pr son bölümünden&gt; 50 mikron minimum mesafe ile bir sonraki seviyeye için tekrarlayınevious seviyesi. Bu mesafe, her seviye için değerlendirilen kriptler birbirlerine yinelenen vermedi sağlanmalıdır. </li><li> Sıkça kesme sırasında biriken Ekim artıklarını çıkarın% 100 etanol ile kriyostat bıçağını silin. Kesit sürdürülür önce kuru bıçak birikmiş statik elektriği boşaltmak için, antistatik kurutucu tabaka ile silinir. C o -80 donmuş bölümleri ile mağaza slaytlar </li></ol> Dondurulmuş Bölüm Doku 4. Boyama <ol><li> Yüksek nem ile 37 ° C sıcak odada enzim histokimyası reaksiyonu gerçekleştirin. NOT: Bir kuluçka fırında veya sıcak bir slayt enzimatik reaksiyonu çalışılıyor yoksul ve tutarsız G6PD boyama açtı. </li><li> Silikon gres (Şekil 1) kullanılarak birbirine bağlanmış iki 1.5 cm x 0.15 cm çelik pullar (iç çap x yükseklik) kullanarak doku boyama kuyu oluşturun. Merkezi ile kuyu tabanı sığdırmak için parafilm kesin kesip ve iyi yerslayt doku bölümünde üzerinde d. NOT: yıkayıcı altındaki parafilm slayt ve doku bölümünde viskoz G6PD boyama karışımını tutar yıkama arasında bir mühür oluşturur. Çalışmada her doku bölümü G6PD reaksiyon boyama karışımının aynı hacimde alması 0.5 ml hacminde - Bu yapı, bir 0.4 ile iyi verir. </li><li> 10 dakika boyunca sıcak bir odada 37 o C&#39;de dondurulmuş doku slaytlar inkübe edin. 37 ° C&#39;de, 45-50 dakika boyunca, her doku kesiti oyuk (slayt başına 2 bölüm) için G6PD boyama reaksiyon karışımı ilave edildi. Sıcak odadan slaytları çıkarın ve dikkatle slaytlar kapalı paslanmaz çelik kuyuları kaldırın. </li><li> Uzun kenarında Set slaytlar reaksiyon ortamı boşaltmak için izin vermek. 30-60 dakika boyunca 100 mM PB (pH 7.4) içinde Slaytları, doku lekeleme bozmadan dokudan G6PD boyama tepkime karışımını ayırmak üzere. PB tuzları çıkarmak için 5-10 dakika için damıtılmış su içinde slaytlar batırın </li><li> Add dokuyu Sealdoku üzerine bir damlalık gelen floro-jel ing ve kurutun için ~ 30 dakika bekliyorum. Mutasyona uğramış crypts belirlenmesini bulandırabilir kabarcıkları kaçının. Not: kabarcıklar oluşturan, prosedür damıtılmış su içinde ıslatılarak floro-jel çıkarıldıktan sonra tekrar edilebilir. Onlar tuzak hava kabarcıkları eğilimi gibi kapak fişleri kullanmayın. </li></ol> G6PD Mutant Crypts ve Mutasyon Frekansı 5. belirlenmesi <ol><li> Işık mikroskobu altında G6PD mutant crypts için slaytlar analiz edin. NOT: Tam mutant crypt tanımlamak için kullanılan kriterleri: (i) tüm crypt mavi renk yoksun; (ii) crypt dış yapısı (iii) mutant crypt (iv) iki gözlemci bir mutant aynı crypt tanımlamak zorunda bitişik 7 mikron kesitlerinde gözlenen ve oldu, bozulmamış oldu. Bitişik 7 mikron bölümlerde gözlenen mutantlar tek mutant olarak sayılır. </li><li> Görüntü her G6PD mutant 40x büyütme crypt ve 5.0 megapiksel kamera ile kullanarak görüntüleri kataloggörüntüleme yazılımı. </li><li> 10x büyütme (Şekil 1C) yüzölçümü en küçük ve görüntünün o ile seviyeden, her fare için bir temsilci bölüm seçerek fare muayene kriptalarının toplam sayısını ölçmek. NOT: A level nedeniyle yakınlığı genellikle birden fazla bölümünde crypts mutasyona gösterirler arka arkaya dört 7 mikron bölümleri (Şekil 1D), temsil eder. Seviyeleri kolonun farklı alanlardan crypts görselleştirmek için um 50&gt; ayrılır. </li><li> Her resim dosyasını açın ve görsel (Şekil 1C kutuları olarak gösterilen) dosyalarını analiz ederek bir seviyede crypts sayısını. Görüntüler dosyalar tek bir dosya olarak düşük 300&gt; 20 olarak crypts gözlenen kriptalarının sayısı değişecektir. </li><li> Her bir kolon için G6PD mutant crypts için taranmıştır seviye sayısı, her bir fare için seçilen seviyeye (Şekil 1C) gelen kript sayısı çarpın. Örneğin, toplam sayımMutant kriptlerin için tarama 8 seviyeleri ile çarpılarak seçilen seviye başına 1250 kriptler 10.000 crypts toplam sayısını eşittir. İstatistiksel analiz için her kolon için 10.000 crypts az değerlendirin. </li><li> Her tedavi için MF hesaplamak için filtrelenmiş kript toplam sayısı tüm hayvanların gözlenen mutantların sayısı birleştirin. Tedavi edilmeyen farelerdeki arka kök hücre MF seviyesi &lt;0.1x10 -4 önce C57BL / 6 farelerinde bildirilen yakındır (Tablo 1). 11&#39;dir </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Genellikle bir bileşimin genotoksik etki DNA değiştirme kabiliyeti tarafından belirlenir. Bu, normal olarak doku izole DNA adduct küresel seviyesinin ölçülmesiyle yapılır. AOM için bu kolonda Ø 6 -methylguanine aduktlar miktarının içerecektir. Böyle kök hücre niş gibi özel hücre tipleri, içinde hasar bu yaklaşım bilgileri kullanarak, kaybolur. Adüktlerinin sadece küçük bir alt grubu sonunda sabit mutasyonlara dönüştürülür Ek olarak, bir DNA adükt mutasyon ile aynı değildir...

Kolon kanseri DNA zarar verebilir çevresel ajanlar ve diyet bileşenlerin etkilenmemesi içerir ve (örneğin, APC), tümör baskılayıcı genler mutasyonları onkojenler somatik mutasyonlar aktive (örneğin, ß-katenin) ya da inaktive üretmek düşünülmektedir. Bu kritik mutasyonlar kolon kök hücrelerinde meydana geldiği kabul edilir. Çünkü kolon epitel eşsiz kript mimarisi, bu kolon kanserinin ilişkili kimyasallara maruz hayvanların sonra kolonda kök hücre mutasyonları ölçmek mümkündür. Mutasyonlar, bir kript içinde tüm hücrelerde mevcut olacak şekilde çeşitli X-bağlantılı enzimler, kök hücrelerin meydana mutasyon için gösterge olarak görev yapabilir. Daha önce, bir prosedür farelerde kalın bağırsak tümörlerini neden kimyasallar da X-bağlı glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G6PD) geni mutasyonlarının analizi ile kolon somatik kök hücre mutasyonlan oluşturulan gösteren basıldı. 1-3Yöntem herhangi bir seçim baskısı olmadan kolon kök hücrelerin rastgele somatik mutasyon sıklığı quantifies. Prosedür muamele edilmiş olan ve kontrol farelerinin sabitlenmemiş dondurulmuş kolon bölümlerinin üretimi ve işlevsel G6PD aktiviteye hücrelerinden yoksun kript tanımlanmasını içerir. , Beyaz görünmesini bu mutasyona uğramış kriptler, mutasyon da mutasyona uğramış G6PD geni barındıran soyu doğurdu kök hücre meydana geldiğini göstermektedir. Enzimatik tahlilde, G6PD eksikli mutant kript nitro mavi tetrazolium (NBT) azalması için gerekli olan glikoz-6-fosfat, okside edilemez. G6PD enzimi işlevsel olduğu zaman, boyama karışımında NBT enzim ve mavi &quot;boyama&quot; hücre yerde biriken çözünmeyen formazana ve çökeltileri düşürülür. G6PD mutantlar hücreler mavi lekeli vahşi tip crypts aksine beyazımsı kalır. Bu yöntem, bir &quot;boş&quot; fenotipe sahip mutasyonları ölçer. Tr Çünküenzimler, örneğin G6PD gibi bölümler, sulu bir çözeltiye yerleştirilmiş ise, bir tespit edilmemiş dokuda bölümündeki hücrelerin üzerinden difüze olabilir, bu analiz edilecek doku kesitlerinde enzim stabilize etmek için gerekli olan. 4 enzim stabilizasyon Doku G6PD enzimatik reaksiyon için gerekli olan küçük reajan moleküllerinin difüzyon engel olmamalıdır. Biz orijinal prosedüre önemli bir dizi değişiklik yaptık. Kritik enzimatik boyama ortam pH&#39;ının kontrolüne ve deneyde kullanılan bileşenlerin çözünürlüğünü kolaylaştırır Optimal Kesme Sıcaklık Bileşim (Ekim), polivinil alkolden değiştirilmiştir. Her bir doku kesiti G6PD reaksiyon karışımının, aynı hacimde, böylece çelik pullar imal 0,5 mi kuyu - boyama 0,4 kullanılarak gerçekleştirilir. Bir prosedür kalmadan kolon dokusunun büyük bir örnekleme sağlayan görüntülü bölümünde kriptalarının sayısını tahmin için geliştirilmiştirEl&gt; Her kolon için 10 5 crypts saymak. Bitişik 7 mikron doku kesitlerinde analizi, potansiyel boyama eserler azaltır birden fazla slayt üzerinde bir mutant crypt görselleştirme tanıyor. Bu değişiklikler prosedürü daha verimli ve tekrarlanabilir hale. Bu yeniden protokolü kullanarak, kemirgenlerde iyi bilinen kolon kanserojen azoksimetan C57BL / 6 farelerinin maruz kaldıktan sonra kolon kök hücrelerinde mutasyon sıklığı sayısal var. 5-7

<table><tbody><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitroblue tetrazolium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glucose-6-phosphate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimethyl formamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer (pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>warm room&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of  colonic stem cell mutations

Kök hücre mutasyonları ölçmek için yeteneği, kimyasal potansiyel kansere yol mutasyonlar neden olabilir eğer ve ne ölçüde eleştirel bir hücre popülasyonu ölçmek için güçlü bir araçtır. X-bağlantılı glikoz-6-fosfat dehidrojenaz geni kök hücre mutasyonlan ölçmek için bir enzim testi kullanımı daha önce bildirilmiştir. 1 Bu yöntem, bir veren bir reaksiyon karışımı ile kesitli doku dondurulmuş bölümleri ve inkübasyon hazırlık gerektirir Hücreler fonksiyonel glikoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzim üreten eğer mavi renk. Eğer değilse, hücreler beyaz görünür. Bu polivinil alkol yerine optimal kesme sıcaklık Bileşik (Ekim) ortamı kullanılarak reaksiyon karışımı olarak var. Bu pH ölçme kolaylaştırır G6PD boyama bileşenlerin çözünürlüğünü arttırır ve G6PD enzimin yayılmasını engellemektedir. Bir mutasyonun kök hücre meydana geldiğini göstermek için, tüm kript G6PD enzimatik yoksun olmalıdırfaaliyet. Bir kök hücre barındıran Sadece eğer bir fenotipik G6PD mutasyon crypt döl tüm G6PD enzimatik aktivitesini yoksun olacak. Kök hücre mutasyonu olan crypts belirlemek için, arka arkaya dört bitişik dondurulmuş kesitler (seviye) 7 um kalınlığında kesildi. Bitişik kesim yapma Bu yaklaşım, aynı mutasyona uğramış crypt bitişik bölümlerde görüleceği beri crypt tam mutasyona edildi uymasını sağlar. 50&#39;den fazla um ayrı olan doku örnekleri ile slaytlar fare başına&gt; 10 4 crypts toplam değerlendirmek için hazırlanmıştır. Mutasyon sıklığı tedavi grubunda yabani tip (mavi) kript sayısına göre ÷ gözlemlenen mutasyona uğramış (beyaz) kript sayısıdır.

Hayvanlarda kolon kök hücre mutasyonlarını ölçmek için yeteneği kanser indüksiyon mutasyonlar ilişkilendirmek için özel bir yol sağlar. Normal olarak, bu karsinogenezde önemli bir adım onkojenlerde mutasyonlar aktive edilmesi ve / veya tümör süpresör genler mutasyon inaktive içerir varsayılmıştır. Biz 200 ul PBS ya da PBS 200 ul 10 mg / kg AOM ile C57BL / 6 fareler enjekte edildi. AOM bilinen kolon kanserojendir. Kolonlar kök hücre mutasyonları için analiz edildi 90 gün sonra 5-7....

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations at JoVE.com

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Görüntüleme.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Video: Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Kanser Araştırmaları

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

Kolorektal Kanser Hücre Yüzey Protein Profil Antikor Mikroarray ve Floresans Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the initiation of cancer stemness properties. Since gene expression in the formation of colorectal cancer-derived tumorspheres is unclear, it takes time to discover the mechanisms working on one gene at a time. This study demonstrates a method to quickly discover the driver genes involved in the survival of the colorectal cancer stem-like cells in vitro. Colorectal HT29 cancer cells that express the LGR5 when cultured as spheroids and accompany an increase CD133 stemness markers were selected and used in this study. The protocol presented is used to perform RNAseq with available bioinformatics to quickly uncover the overexpressed driver genes in the formation of colorectal HT29-derived stem-like tumorspheres. The methodology can quickly screen and discover potential driver genes in other disease models.

Presented here is a protocol to discover the overexpressed driver genes maintaining the established cancer stem-like cells derived from colorectal HT29 cells. RNAseq with available bioinformatics was performed to investigate and screen gene expression networks for elucidating a potential mechanism involved in the survival of targeted tumor cells.

Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Davranış

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblastlar

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Tıp

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other malignancies of the same tissue type, often in a nearby location. Such field defects have been indicated in colon cancer. The molecular abnormalities that are responsible for a field defect in the colon should be detectable at high frequency in the histologically normal tissue surrounding a colonic adenocarcinoma or surrounding an adenoma with advanced neoplasia (well on the way to a colon cancer), but at low frequency in the colonic mucosa from patients without colonic neoplasia.
Using immunohistochemistry, entire crypts within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas or advanced colonic neoplasias were found to be frequently reduced or absent in expression for two DNA repair proteins, Pms2 and/or ERCC1. Pms2 is a dual role protein, active in DNA mismatch repair as well as needed in apoptosis of cells with excess DNA damage. ERCC1 is active in DNA nucleotide excision repair. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 would create cells with both increased ability to survive (apoptosis resistance) and increased level of mutability. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 is likely an early step in progression to colon cancer.
DNA repair gene Ku86 (active in DNA non-homologous end joining) and Cytochrome c Oxidase Subunit I (involved in apoptosis) had each been reported to be decreased in expression in mucosal areas close to colon cancers. However, immunohistochemical evaluation of their levels of expression showed only low to modest frequencies of crypts to be deficient in their expression in a field defect surrounding colon cancer or surrounding advanced colonic neoplasia.
We show, here, our method of evaluation of crypts for expression of ERCC1, Pms2, Ku86 and CcOI. We show that frequency of entire crypts deficient for Pms2 and ERCC1 is often as great as 70% to 95% in 20 cm long areas surrounding a colonic neoplasia, while frequency of crypts deficient in Ku86 has a median value of 2% and frequency of crypts deficient in CcOI has a median value of 16% in these areas. The entire colon is 150 cm long (about 5 feet) and has about 10 million crypts in its mucosal layer. The defect in Pms2 and ERCC1 surrounding a colon cancer thus may include 1 million crypts. It is from a defective crypt that colon cancer arises.

Reduced/absent expression of Pms2 and/or ERCC1 in entire crypts is a frequent event within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas, likely the basis of a field defect with high mutability and progression to cancer. Deficiency in Ku86 or CcOI is much less frequent in these field defects.

Eksik Pms2 ERCC1, Ku86 Kolon Kanseri ilerleme sırasında Alan Kusur CcOI

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Biyoloji

MLH1 Gene Expression in Peripheral Blood in Colon Cancer Patients and Their Association with Colon Cancer

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops caused by nucleotide misincorporation. In the absence of MLH1 protein, the frequency of non-repaired mismatches increases, resulting in organ cancer. The current study sought to quantify MLH1 gene expression and its relationship with tumor invasion (T) and lymph node invasion (N) in blood samples from patients with colorectal cancer (CRC). Blood samples were obtained from 36 CRC patients. RNA was extracted, and cDNA was synthesized using a kit. The primers were built using the exon-exon junction approach, and MLH1 and &#946;-actin genes were tested 3x using real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR). Gene expression analysis software was used to analyze the data, and a t-test was used to examine the expression of MLH1 and its connection with T and N variables. In this study, 36 patients with colorectal cancer, including 15 (41.6%) women and 21 (58.4%) men, with a mean age of 57.35 &plusmn; 4.22 years and in the age range of 26-87 years, were included. The results showed that the ratio of MLH1 gene expression in patients decreased compared to that in healthy individuals, and the decrease in gene expression at different stages of the disease was significant. The results of this study showed that the reduction of MLH1 gene expression has an effective role in the development of CRC.

This study examines the association between MLH1 gene expression in peripheral blood and colon cancer, utilizing a case-control approach to compare expression levels in patients and matched healthy controls.

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops ...