著者は何の確認応答がありません。

実験手順や動物の倫理的な治療は、ピッツバーグ大学IACUC（プロトコル＃1104674）によって承認されました。 G6PDの染色用混合物の調製注：次のように各試薬の最終濃度であることを確認してください。 5mMのグルコース-6-リン酸（G6P）。 2mMのNADP、5mMのMgCl 2、0.35 mMの1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルサルフェート（MMPMS）及び0.8mMのNBTの初期濃度は40 mlの最終容積のために導出された各試薬については1,8,9。溶液を、新たに調製し、毎日使用しました。 <ol><li> 50mlのチューブに10月培地35 mlに200mMのpH7.4のリン酸緩衝液（PB）の2ミリリットルを加え、激しく振ります。ソリューションは、pH約7.4であるpH試験紙で確認してください。そうでない場合は、解決策を捨てます。 </li><li> 61ミリグラムG6Pが200mm PBの0.94ミリリットルに溶かし追加、61ミリグラムNADPは、200mMのPBの0.94ミリリットルに溶解し、41mgの塩化マグネシウムは 0.96ミリリットルの100mMのPBに溶解しました。 pHがあることを再確認〜7.4ウィット時間pH試験紙。ない〜7.4場合は、ソリューションを破棄します。 </li><li> 200mMのPB（pH7.4）での0.25ミリリットルに溶かしMMPMS 5mgを追加します。精力的に透明な暗赤色のホモジネートを生成するために、得られた反応混合物を振ります。解決策が濁っている場合、混合物は捨ててください。反応混合物を含むチューブは、光への暴露を最小限に抑えるためにホイルで包まれています。最後のコンポーネント、NBTは、用意されている間、室温で反応混合物を保管してください。 </li><li> Oリングと蓋2 mlチューブにNBTの164 mgの0.4 mlの無水ジメチルホルムアミド（DMF）と0.4 mlの無水エタノールを添加することにより、別々に5mMのNBT溶液を調製します。 loosely蓋を閉じます（しっかりと密封されていない）と、NBTが溶液になるまでオイルバスで活発な沸騰の解決策をもたらす。8 </li><li>可溶化されたNBTを室温まで冷却した後、10月の反応混合物へのソリューションのすべてを追加し、透明な溶液を得るために、積極的に振るようにします。暗赤色またはパープに最初の橙赤色から溶液の色の変化を観察経時ル色。これは正常です。 </li><li>使用前に1時間37℃の暖かい部屋で、最終的なG6PD染色混合物を置きます。 </li></ol> 2.動物の治療や組織採取<ol><li> DNA損傷剤 、例えばで6週齢のC57BL / 6雄マウスを治療、腹腔内注射により200μlのPBSの容量で10mg / kgのアゾキシメタン（AOM）。腹腔内注射により200μlのPBS対照マウスを扱います。 </li><li> IACUCプロトコルによって承認され、90日には、頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりマウスを安楽死させます。 </li><li>外科的胸骨のベースにちょうど肛門上から腹腔を開きます。体腔から小腸に移動し、それを切除しないでください。ちょうど直腸に盲腸以下の低い腸を切除。10 </li><li>慎重にマイクロ解剖ハサミを使用して、コロンの一辺に沿ってスライスし、きれいな滅菌PBSで洗浄することによって開かれたコロンから糞便を削除します。物品税スイスロールDの外側に向け腔側とコロン、および組織型内の場所。10 </li><li>完全に10月の媒体にコロンを浸すと、液体N 2を含むデュワーに金型を配置します。プラスチックベースはちょうど10月の媒体が固体凍結されるまで液体N 2と接触するように金型を持ちます。 </li><li>凍結切片を切断するまで-80で凍結組織ブロックを格納します。 G6PD酵素の不活性化をもたらす任意の固定液を、使用しないでください。 </li></ol>凍結切片の調製<ol><li> -25℃でクライオスタットを用いて、7ミクロンの厚さで凍結組織切片をカットします。 4連続した7μmのセクションをカットし、同じスライド（ 図1）上でそれらのうちの2つを配置します。コロン（ 図1）の1つのレベルを表すために2スライド、または4つの連続した7μmの切片を作製。 </li><li> PRの最後のセクションから&gt;50μmの最小距離と次のレベルのために繰り返しeviousレベル。この距離は、各レベルについて評価陰窩が互いに重複していないことを確実にしました。 </li><li>よく切断中に蓄積する10月の残留物を除去するために、100％エタノールでクライオスタットブレードを拭きます。切片が再開される前に、乾燥したブレードは、蓄積された静電荷を消散させる帯電防止ドライヤーシートで拭きます。 C. O -80で凍結切片と店舗スライド</li></ol>凍結切片の組織の4染色<ol><li>湿度の高い37℃の暖かい部屋で、酵素組織化学反応を実行します。 注：インキュベーションオーブン内またはスライドウォーマー上の酵素反応をしようとは、貧しい人々や一貫性のないG6PD染色につながりました。 </li><li>シリコーングリース（ 図1）を使用して一緒に結合された2つの1.5センチメートルのx 0.15センチメートル鋼ワッシャー（内径×高さ）を使用して、組織染色用の井戸を構築します。中心とウェルのベースに合わせてパラフィルムをカット切り取り、井戸の場所スライド上の組織切片の上にD。 注：洗濯機の底部にパラフィルムは、スライドし、組織切片上の粘性G6PD染色混合物を維持して座金との間にシールを作成します。研究では、各組織切片は、G6PD反応染色混合物の同じ体積を受信するように、0.5ミリリットル容量 - この構築物は0.4とよくを与えます。 </li><li> 10分間、暖かい部屋で37°Cの時に凍結した組織スライドをインキュベートします。 37℃で、45〜50分間、各組織切片ウェル（ス​​ライドあたり2つのセクション）にG6PD染色反応混合物を追加します。暖かい部屋からスライドを取り外し、慎重にスライドオフステンレス製の井戸を持ち上げます。 </li><li>反応媒体を排出できるようにするために彼らの長いエッジでスライドを設定します。組織染色を乱すことなく組織からG6PD染色反応混合物を除去するために30〜60分間、100mMのPB（pH7.4）中置きスライド。 PB塩を除去するために5〜10分間蒸留水中でスライドを沈めます</li><li>追加することによって、組織をシール組織上にスポイトからフルオロゲルをると、それが乾燥するために〜30分を待っています。変異した陰窩の識別を混乱させるできる気泡を避けてください。 注：気泡が形成した場合は、手順は、蒸留水に浸漬してフルオロゲルを除去した後に繰り返すことができます。彼らはトラップ気泡に傾向があるように、カバースリップを使用しないでください。 </li></ol> 5. G6PD変異陰窩の決意と変異頻度<ol><li>光学顕微鏡下でG6PD変異陰窩のためのスライドを分析します。 注：完全に変異クリプトを識別するために使用される基準は、（ⅰ）全体陰窩は青色を欠いていました。 （ii）の陰窩の外部構造（iii）は、変異体のcryptは、（iv）の二人の観察者は、変異体と同じ地下室を識別しなければならなかった、隣接する7μmの切片で観察した、無傷でした。隣接7μmの切片で観察された変異体は、1つの変異体としてカウントされます。 </li><li>画像各G6PD変異40倍の倍率でcryptと5.0メガピクセルのカメラとを使用して画像をカタログイメージングソフトウェア。 </li><li> 10倍の倍率（図1C）で最小の表面積とイメージを持つレベルから各マウスについての代表的な部分を選択してマウスで調べた陰窩の合計数を定量化します。 注：レベルは、その近接にしばしば複数のセクションに陰窩変異SHOW 4つの連続7μmの切片（ 図1D）を表します。レベルは、コロンの異なる領域から陰窩を可視化するためにミクロン50&gt;で分離されています。 </li><li>各画像ファイルを開いて、視覚的に（ 図1Cにボックスとして示されている）ファイルを解析することにより、レベルに陰窩の数を数えます。画像ファイルは、一つのファイルに20〜300&gt;に陰窩ような低いから観察陰窩の数が異なります。 </li><li>各コロンのためのG6PD変異陰窩についてスクリーニングレベルの数によって各マウスのために選択されたレベル（ 図1C）から陰窩の合計数を掛けます。例えば、の総数変異陰窩についてスクリーニング8レベルを乗じ選択されたレベルごとに1,250陰窩10,000陰窩の合計数に等しいです。統計分析のために各コロン10,000陰窩の最小値を評価します。 </li><li>各治療のため、MFを計算するためにスクリーニング陰窩の総数ですべての動物で観察された変異体の数を組み合わせます。未処理マウスにおける背景幹細胞MFレベルが&lt;0.1x10 -4以前にC57BL / 6マウスで報告されているものに近い（ 表1）、。11であります</li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

多くの場合、化合物の遺伝毒性作用はDNAを改変する能力によって決定されます。これは通常、組織を単離し、DNA付加体の全体的なレベルを測定することによって行われます。 AOMの場合、これはOを結腸6 -メチルグアニン付加物を定量伴います。そのような幹細胞ニッチのような特定の細胞型内の損傷に対するこのアプローチの情報を使用して、失われます。付加体の小さなサブセット...

大腸癌は、DNAに損傷を与えることができ、環境エージェントと食物成分への曝露を伴い、（ 例えば 、APC）の腫瘍抑制遺伝子に変異を癌遺伝子に体細胞変異を活性化（例えば、β-カテニン）または不活性化生成すると考えられています。これは、これらの重要な突然変異は結腸幹細胞において生じることが想定されます。なぜなら結腸上皮の固有の暗号アーキテクチャのために、それは、結腸発癌に関連する化学物質に動物を曝露した後に、結腸中の幹細胞の変異を測定することができます。突然変異がクリプト内の全ての細胞に存在することになるなど、いくつかのX連鎖酵素は、幹細胞で起こる突然変異のための指標としての役割を果たすことができます。 以前は、手順は、マウスにおいて結腸腫瘍を誘発する化学物質はまた、X連鎖グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）遺伝子の突然変異の分析によって結腸における体性幹細胞の突然変異を生成することを実証掲載されました。1-3この方法は、任意選択圧なしで結腸幹細胞におけるランダムな体細胞変異の発生率を定量化します。手順は、処理されたマウスおよび対照マウスからの未固定凍結された大腸セクションの生産と機能G6PD活性を産生する細胞を欠いている陰窩の同定を含みます。 、白く見えるこれらの変異した陰窩は、変異はまた、変異したG6PD遺伝子を有する子孫を生じさせた幹細胞で発生したことを示しています。酵素アッセイでは、G6PD欠損変異体の陰窩は、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）の還元のために必要とされるグルコース-6-リン酸を酸化することができません。 G6PD酵素が機能している場合には、染色用混合物中のNBT青色酵素及び「染色」は、細胞の位置に蓄積し、不溶性のホルマザン沈殿物に還元されます。 G6PDの変異体である細胞は青く染色された野生型陰窩とは対照的に白っぽいまま。この方法は、「ヌル」表現型を有する変異を測定します。 enため、zymes、例えば、G6PDとして、切片を水溶液中に置かれた場合に非固定組織切片上で細胞外に拡散することができ、それは分析されるべき組織切片中の酵素を安定化するために必要であり、図4中の酵素の安定化組織は、G6PD酵素反応に必要な試薬の小分子の拡散を妨害してはなりません。 私たちは、元のプロシージャに大幅な変更の数を行いました。重要な酵素染色培地は、pH制御およびアッセイにおいて使用される成分の可溶化を容易に最適切削温度化合物（OCT）にポリビニルアルコールから変更されています。それぞれの組織切片は、G6PD反応混合物の同じ量を受信するようにスチールワッシャからなる0.5 mlのウェル - 染色は、0.4を用いて行われます。手順がなくても、結腸組織の大規模なサンプリングを提供して撮像されたセクション内の陰窩の数を推定するために開発されましたmanually&gt;各コロンのための10 5陰窩をカウントします。隣接7μmの組織切片の分析は、潜在的な染色アーチファクトを低減する複数のスライド上の変異陰窩の視覚化を提供します。これらの変更は、手順がより効率的かつ再現可能にします。 この修正されたプロトコルを使用して、我々は、げっ歯類においてよく知られている結腸の発癌物質のアゾキシメタンをC57BL / 6マウスの曝露後の結腸幹細胞の突然変異頻度を定量化している。5-7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitroblue tetrazolium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose-6-phosphate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm room&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of  colonic stem cell mutations

幹細胞の変異を測定する能力は、化学物質が潜在的に癌を引き起こす突然変異を誘発することができた場合、どの程度に重要な細胞集団に定量化するための強力なツールです。 X連鎖グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で幹細胞変異を定量化するための酵素アッセイの使用は、以前に報告されている。1この方法は、得られる反応混合物と切片の組織の凍結切片とのインキュベーションの準備が必要青色細胞は、機能的なグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）酵素を生成した場合。そうでない場合、細胞が白っぽく見えます。我々は、ポリビニルアルコールの代わりに、最適切削温度化合物（OCT）培地を用いて反応混合物に変更しました。これは、pH測定を容易にG6PD染色成分の可溶化を増加させ、G6PD酵素の拡散を制限します。突然変異は、幹細胞で生じたことを実証するために、全体の陰窩はG6PD酵素を欠いている必要があります活動。幹細胞が抱いている場合のみ、表現型G6PD変異は陰窩における子孫のすべては、G6PD酵素活性を欠くであろう。幹細胞変異を有する陰窩を識別するために、4つの連続した​​隣接する凍結切片（レベル）が7μmの厚さで切断しました。隣接するカットを作るこのアプローチは、同じ変異した地下室は、隣​​接するセクションで観察されるので、地下室が完全に変異させたコンホメーションを提供します。 50μmより離れた組織サンプルとスライドは、マウスあたり&gt; 10 4陰窩の合計を評価するために調製しました。突然変異頻度は、治療群では、野生型（青）陰窩の数で÷観測された変異した（白）陰窩の数です。

動物に結腸幹細胞変異を測定する能力は、癌誘発に変異を相関させるユニークな方法を提供します。通常、これは、発癌における重要な段階は、癌遺伝子における突然変異を活性化および/または腫瘍抑制遺伝子における変異を不活性化することを含むものとします。私たちは、200μlのPBSまたはPBS200μl中10mg / kgのAOMとC57BL / 6マウスに注射。 AOMは、既知の大腸発がん性物質である。コロンは、?...

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Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

結腸幹細胞変異の定量

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.5K ビュー.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

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Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

MYH6プロモーター - 選択と組み合わせたES細胞のプログラミングに基づいて、マウス心臓ペースメーカー細胞凝集体の生成

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

発生生物学

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル<em&gt;のCre-LOX</em&gt;マウスモデル

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...