יש הסופרים לא תודות.

הפרוצדורות והטיפול אתי בבעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטת פיטסבורג IACUC (פרוטוקול # 1,104,674). 1. הכנת תערובת מכתים G6PD הערה: ודא שהריכוז הסופי של כל ריאגנטים הוא כדלקמן; 5 מ&quot;מ glucose-6-פוספט (G6P); 2 מ&quot;מ NADP, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 0.35 סולפט 1 מ&quot;מ-methoxy-5-מתיל methylphenazinium (MMPMS) ו0.8 מ&quot;מ NBT. 1,8,9 לכל מגיב הריכוז הראשוני נגזר ל40 מיליליטר נפח סופי. פתרונות היו מוכנים טריים ומשמשים בכל יום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של 200 מ&quot;מ 7.4 חיץ pH פוספט (PB) ל -35 מיליליטר של מדיום אוקטובר בצינור 50 מ&quot;ל ולנער במרץ. ודא עם נייר pH שהפתרון הוא ~ pH 7.4. אם לא לבטל את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 61 G6P מ&quot;ג מומס ב0.94 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB, 61 מ&quot;ג NADP מומס ב0.94 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB, ו -41 מ&quot;ג MgCl 2 מומס ב0.96 PB מיליליטר של 100 מ&quot;מ. לאשרר שpH הוא ~ 7.4 שנינותנייר pH שעות. אם לא ~ 7.4, לבטל את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ג של MMPMS מומס ב0.25 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB (pH 7.4). במרץ לנער את תערובת תגובה וכתוצאה מכך ליצור homogenate אדום כהה ברור. אם הפתרון הוא עכור, צריכה להיות מושלכת התערובת. הצינור המכיל תערובת התגובה הוא עטוף בנייר כסף כדי למזער את החשיפה לאור. אחסן את תערובת התגובה ב RT ואילו הרכיב הסופי, NBT, מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בנפרד פתרון 5 מ&quot;מ NBT על ידי הוספת 0.4 מיליליטר פוראמיד דימתיל נטול מים (DMF) ו -0.4 מיליליטר אתנול נטול מים ל- 164 מ&quot;ג של NBT בצינור 2 מיליליטר עם מכסה O-טבעת. לסגור את המכסה באופן רופף (לא סגור היטב) ולהביא את הפתרון לרתיחה באמבטית שמן עד NBT הוא בפתרון. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר NBT solubilized להתקרר לRT ולאחר מכן להוסיף את כל הפתרון לתערובת תגובת OCT ולנער במרץ כדי להשיג פתרון ברור. שים לב לשינוי בצבע פתרון מכתום-אדום ראשונית לאדום כהה או purpצבע le לאורך זמן. זה נורמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת כתמי G6PD הסופית בC חדר חם 37 מעלות במשך שעה 1 לפני השימוש. </li></ol> 2. בעלי חיים טיפול ואוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את עכברי זכרים 6 שבועות בן C57Bl / 6 עם סוכן מזיק DNA, למשל, 10 מ&quot;ג / קילוגרם azoxymethane (AOM) בהיקף של 200 μl PBS על ידי הזרקת IP. פנק את עכברי שליטה עם 200 μl של PBS על ידי הזרקת IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 יום, להרדים עכברים על ידי CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם כפי שאושר על ידי פרוטוקול IACUC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בניתוח בחלל הבטן מבדיוק מעל פי הטבעת לבסיס של עצם החזה. הזז את המעי הדק מתוך חלל הגוף אבל לא לכרות אותו. בלו המעי התחתון, ממש מתחת לcecum לפי הטבעת. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורס בזהירות בצד אחד של המעי הגס באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה ולהסיר צואה מהמעי הגס נפתח על ידי שטיפה עם PBS סטרילי הנקי. רול שוויצרי הבלומעי גס ד עם צד luminal פונה החוצה, והמקום בעובש רקמה. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלוטין לטבול את המעי הגס בתבנית בינונית ומקום אוקטובר בדיואר המכיל נוזל N 2. להחזיק את התבנית כך שבסיס הפלסטיק הוא רק במגע עם הנוזל N 2 עד בינוני אוקטובר קפוא מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את גוש הרקמה הקפוא ב -80 עד חיתוך חלקים קפואים. אין להשתמש בכל מקבע, אשר יביא לאיון של אנזים G6PD. </li></ol> 3. הכנת סעיפים קפואים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך קטעי רקמה קפוא בעובי של 7 מיקרומטר באמצעות cryostat ב-25 מעלות צלזיוס. חותך 4 7 מיקרומטר סעיפים רצופים ומקום שניהם על אותו השקופית (איור 1). הכן 2 שקופיות, או ארבעה 7 מיקרומטר סעיפים רצופים לייצג רמה אחת של המעי הגס (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לרמה הבאה עם מרחק מינימאלי של&gt; 50 מיקרומטר מהחלק האחרון של יחסי הציבוררמת evious. מרחק זה הבטיח כי מאורות העריכו לכל רמה לא לשכפל אחד לשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות לנגב את להב cryostat עם 100% אתנול להסיר את שאריות אוקטובר שמצטברת במהלך חיתוך. לפני חתך יתחדש, הלהב היבש ניגב עם גיליון מייבש אנטי-סטטית להתפוגג מטען סטטי שנצבר. שקופיות חנות עם החלקים קפואים ב -80 o C. </li></ol> 4. הכתמה של רקמה קפואה סעיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את תגובת היסטוכימיה האנזים בחדר חם 37 ° C עם לחות גבוהה. הערה: ניסיון התגובה האנזימטית בתנור דגירה או על חם שקופית הובילה לצביעת G6PD עניה ועולה בקנה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות בארות מכתים רקמות באמצעות שני 1.5 סנטימטרים X מנקי פלדה 0.15 סנטימטר (גובה X הקוטר פנימי) שמחובר יחד באמצעות גריז סיליקון (איור 1). חותך את parafilm כדי להתאים את הבסיס של היטב עם המרכז לגזור והמקום גםד על קטע הרקמה בשקופית. הערה: parafilm על החלק התחתון של מכונת הכביסה יוצרת חותם בין השקופיות ומכונת הכביסה ששומרת את תערובת כתמי G6PD צמיגה בסעיף הרקמה. מבנה זה נותן גם עם 0.4-0.5 מיליליטר נפח, כך שכל קטע רקמה במחקר מקבל את אותו הנפח של תערובת כתמי תגובת G6PD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות רקמה קפוא ב 37 o C בחדר חם למשך 10 דקות. על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף את תערובת התגובה מכתימה G6PD היטב כל אחד קטע רקמה (2 סעיפים לכל שקופית) ל45-50 דקות. הסר שקופיות מחדר חם, ולהרים בזהירות את בארות נירוסטה מהשקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות הגדר בקצה הארוך שלהם כדי לאפשר את מדיום התגובה לניקוז. מגלשות מקום ב100 מ&quot;מ PB (pH 7.4) במשך 30-60 דקות להסיר את תערובת התגובה מכתימה G6PD מהרקמה מבלי להפריע צביעת הרקמות. לצלול שקופיות במים מזוקקים למשך 5-10 דקות כדי להסיר מלחי PB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הרקמה על ידי תוספתing fluoro-ג&#39;ל מטפטף על הרקמות ומחכים ~ 30 דקות לייבוש. למנוע בועות שיכולים לבלבל את זיהוי של מאורות שעברו מוטציה. הערה: אם בועות טופס, ההליך ניתן לחזור לאחר הסרת fluoro-ג&#39;ל על ידי שריה במים מזוקקים. אין להשתמש בתלושי כיסוי כפי שהם נוטים בועות אוויר מלכודת. </li></ol> 5. קביעת מאורות Mutant G6PD ותדירות המוטציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שקופיות עבור מאורות מוטציה G6PD תחת מיקרוסקופ אור. הערה: הקריטריונים המשמשים לזיהוי קריפטה מוטציה מלאה היו: (i) כל הכוך היה נטול צבע הכחול; (Ii) המבנה החיצוני של הכוך היה שלם, (iii) קריפטה המוטציה נצפתה על 7 מיקרומטר חלקים סמוכים ו, ​​(iv) שני משקיפים היו לזהות את אותו כוך כמוטציה. מוטציות שנצפו על 7 מיקרומטר סעיפים סמוכים נספרות כמוטציה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה כל קריפטה המוטציה G6PD ב40X הגדלה ולקטלג את התמונות באמצעות מצלמה 5.0 מגה פיקסל עםתוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את המספר הכולל של מאורות נבחנו בעכבר על ידי בחירת סעיף נציג לכל עכבר מהרמה עם השטח הקטן ביותר פני השטח ותמונתו בהגדלה 10x (איור 1 ג). הערה: רמה מייצגת ארבעה 7 מיקרומטר סעיפים רצופים (איור 1D), אשר בשל הקרבה שלהם לעתים קרובות להראות מוטציה מאורות בסעיף אחד או יותר. הרמות מופרדות על ידי&gt; 50 מיקרומטר לדמיין מאורות מאזורים שונים של המעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח כל קובץ תמונה וחזותי לספור את מספר מאורות ברמה על ידי ניתוח הקבצים (כפי שמוצגים בתיבות תרשים 1C). קבצי תמונות ישתנו במספר מאורות נצפו מנמוך כמו 20 עד&gt; 300 מאורות בקובץ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הכולל של מאורות מהרמה הנבחרת (איור 1 ג) לכל עכבר במספר הרמות הוקרנו למאורות מוטציה G6PD עבור כל מעי גס. לדוגמא, ספירה כוללת של1,250 מאורות לרמה שנבחרה מוכפלים 8 רמות הוקרנו למאורות מוטציה שווים ספירה כוללת של 10,000 מאורות. להעריך מינימום של 10,000 מאורות עבור כל מעי גס לניתוח סטטיסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את מספר מוטציות שנצפו בכל בעלי החיים במספר הכולל של מאורות הוקרנו לחשב MF עבור כל טיפול. רמת MF תאי גזע רקע בעכברים שלא טופלו היא &lt;0.1x10 -4 (טבלת 1), שהוא קרוב לזה שדווח בעבר בC57Bl / 6 עכברים. 11 </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לעתים קרובות השפעת genotoxic של מתחם נקבעה על ידי יכולתה לשנות DNA. זה נעשה בדרך כלל על ידי בידוד הרקמות ומדידת הרמה הגלובלית של adducts DNA. לAOM, זה יהיה כרוך בכימות O 6 -methylguanine adducts במעי הגס. שימוש במידע בגישה זו על נזק בתוך סוגי תאים ספציפיים, כגון בנישת תאי גזע, הולך לאיבוד. ...

הוא חשב לסרטן מעי גס לערב חשיפה לגורמים סביבתיים ורכיבים תזונתיים שיכול לגרום נזק לדנ&quot;א ולייצר הפעלת מוטציות סומטיות באונקוגנים (למשל, SS-קטנין) או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן (למשל, APC). הנחה היא כי המוטציות קריטיות הללו מתרחשות בתאי גזע במעי הגס. בגלל ארכיטקטורת קריפטה הייחודית של האפיתל המעי הגס, אפשר למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס לאחר חשיפת בעלי חיים לכימיקלים הקשורים לסרטן מעי גס. אנזימים צמודים X כמה יכולים לשמש כמדדים למוטציות המתרחשות בתאי גזע, כמו המוטציות תהיה נוכחת בכל התאים בתוך כוך. בעבר, הליך פורסם הוכחה כי כימיקלים שגורמים לגידולים במעי הגס בעכברים גם נוצרו מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס באמצעות ניתוח של מוטציות בdehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X הגן (G6PD). 1-3השיטה מכמתת את השכיחות של מוטציות סומטיות אקראיות בתאי גזע במעי הגס ללא כל לחץ בחירה. ההליך כרוך הייצור של חלקי מעי גס קפוא מבולבל מעכברים שטופלו ובקרה וזיהוי של מאורות חסרי תאים המייצרים פעילות G6PD פונקציונלית. מאורות אלה שעברו מוטציה, אשר מופיעים לבן, מצביעים על כך שהמוטציה התרחשה בתאי גזע שהולידו צאצאים גם מחסה גן שעבר מוטציה G6PD. בassay האנזימטית, מאורות המוטציה deficient G6PD לא יכולים לחמצן גלוקוז 6-פוספט, אשר נדרש להפחתת tetrazolium ניטרו הכחול (NBT). כאשר אנזים G6PD הוא פונקציונלי, NBT בתערובת הכתמים מצטמצם formazan ומשקעים לא מסיסים, צבירה במיקום של האנזים ותאים &quot;הכתמה&quot; כחולים. תאים שמוטציות G6PD להישאר לבנבן בניגוד למאורות סוג כחולים מוכתמים פראיים. שיטה זו מודדת מוטציות שיש פנוטיפ &quot;null&quot;. בגלל enzymes, כגון G6PD, יכול לפזר את התאים בסעיף רקמה מבולבל אם החלקים ממוקמים בתמיסה מימית, יש צורך לייצב את האנזים בסעיפי הרקמות להיות מנותחים. 4 הייצוב של האנזים ב רקמה אסור להפריע לדיפוזיה של מולקולות מגיב קטנות נחוצות לתגובה האנזימטית G6PD. עשינו מספר השינויים המשמעותיים בהליך המקורי. הבינוני לצביעה האנזימטית הקריטית השתנה מאלכוהול פוליוויניל למתחם אופטימלי טמפרטורת חיתוך (אוקטובר), המאפשר שליטת pH וsolubilization של הרכיבים המשמשים assay. הצביעה מתבצעת באמצעות 0.4-0.5 מיליליטר בארות עשויות מנקי פלדה, כך שכל קטע רקמה קיבל את אותו הנפח של תערובת תגובת G6PD. הליך פותח כדי להעריך את מספר מאורות בסעיף הדמיה המספק דגימה גדולה של רקמת המעי הגס מבלילספור ידני&gt; 10 5 מאורות עבור כל מעי גס. הניתוח של 7 מיקרומטר סעיפי רקמות סמוכים מאפשר הדמיה של קריפטה מוטציה בשקופית אחד או יותר, אשר מפחיתה חפצים מכתים פוטנציאליים. שינויים אלה הופכים את ההליך יעיל יותר ושחזור. שימוש בפרוטוקול מתוקן זה, יש לנו לכמת את תדירות המוטציה בתאי גזע במעי הגס לאחר החשיפה של C57Bl / 6 עכברים לazoxymethane, סרטן מעי גס ידוע במכרסמים. 5-7

<table><tbody><tr><td>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nitroblue tetrazolium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NADP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glucose-6-phosphate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimethyl formamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffer (pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>warm room&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of  colonic stem cell mutations

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע היא כלי רב עוצמה כדי לכמת באוכלוסיית תאים קריטית אם, ובאיזו מידה, כימי יכול לגרום למוטציות שעלולות לגרום לסרטן. השימוש בassay האנזימטית לכמת מוטציות בתאי גזע בגן dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X כבר דווח בעבר. 1 שיטה זו דורשת ההכנה של חלקים ודגירה קפוא של הרקמה מחולק עם תערובת תגובה כי תשואות צבע כחול אם התאים לייצר אנזים פונקציונלי dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט (G6PD). אם לא, התאים להופיע לבנבן. יש לנו שונה תערובת התגובה באמצעות מדיום אופטימלי מתחם טמפרטורת חיתוך (אוקטובר) במקום של אלכוהול פוליוויניל. זה מקל על מדידת pH, מגביר solubilization של רכיבי צביעת G6PD ומגביל דיפוזיה של אנזים G6PD. על מנת להוכיח כי מוטציה התרחשה בתאי גזע, כל קריפטה חייבת חסר אנזימטי G6PDפעילות. רק אם תאי גזע נמלי מוטציה G6PD פנוטיפי כל הצאצאים בקריפטה תחסר פעילות האנזימטית G6PD. לזהות מאורות עם מוטציה בתאי גזע, ארבעה חלקים רצופים סמוכים קפוא (רמה) נחתכו ב 7 מיקרומטר עוביים. גישה זו של ביצוע חתכים סמוכים מספקת קונפורמציה שכוך היה מוטציה באופן מלא מאז אותו קריפטה מוטציה יקויימו בחלקים סמוכים. שקופיות עם דגימות רקמה שהיו בהפרש של יותר מ -50 מיקרומטר היו מוכנות להעריך כולל של&gt; 10 4 מאורות לכל עכבר. תדירות המוטציה היא מספר מאורות הנצפים מוטציה (לבן) ÷ במספר סוג בר מאורות (כחולים) בקבוצת טיפול.

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס בבעלי חיים מספקת דרך ייחודית, כדי לקשר בין מוטציות גיוס הסרטן. בדרך כלל, ההנחה היא כי הצעד הקריטי בהיווצרות הסרטן כרוך הפעלת מוטציות באונקוגנים ו / או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן. אנחנו הזרקנו C57Bl / 6 עכברים עם 200 μl של PBS או 10 מ&quo...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations at JoVE.com

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Views.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Video: Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Cancer Research

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification1.
A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).
The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types2,3. However, no single &#x2018;marker&#x2019; has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. 
A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple 'markers'. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. 
In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response5, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody6. 
For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells7. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.

We described a procedure for the disaggregation of colorectal cancer (CRC) to produce viable single cells, which are then captured on customized antibody microarrays recognizing surface antigens (DotScan CRC microarray). Sub-populations of cells bound to the microarray can be profiled by fluorescence multiplexing using monoclonal antibodies tagged with fluorescent dyes.

סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Immunology and Infection

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the initiation of cancer stemness properties. Since gene expression in the formation of colorectal cancer-derived tumorspheres is unclear, it takes time to discover the mechanisms working on one gene at a time. This study demonstrates a method to quickly discover the driver genes involved in the survival of the colorectal cancer stem-like cells in vitro. Colorectal HT29 cancer cells that express the LGR5 when cultured as spheroids and accompany an increase CD133 stemness markers were selected and used in this study. The protocol presented is used to perform RNAseq with available bioinformatics to quickly uncover the overexpressed driver genes in the formation of colorectal HT29-derived stem-like tumorspheres. The methodology can quickly screen and discover potential driver genes in other disease models.

Presented here is a protocol to discover the overexpressed driver genes maintaining the established cancer stem-like cells derived from colorectal HT29 cells. RNAseq with available bioinformatics was performed to investigate and screen gene expression networks for elucidating a potential mechanism involved in the survival of targeted tumor cells.

גילוי של גנים הנהג ב המעי הגס HT29-נגזר סרטן גזע כמו Tumorspheres

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Behavior

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; פיברובלסטים

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Medicine

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other malignancies of the same tissue type, often in a nearby location. Such field defects have been indicated in colon cancer. The molecular abnormalities that are responsible for a field defect in the colon should be detectable at high frequency in the histologically normal tissue surrounding a colonic adenocarcinoma or surrounding an adenoma with advanced neoplasia (well on the way to a colon cancer), but at low frequency in the colonic mucosa from patients without colonic neoplasia.
Using immunohistochemistry, entire crypts within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas or advanced colonic neoplasias were found to be frequently reduced or absent in expression for two DNA repair proteins, Pms2 and/or ERCC1. Pms2 is a dual role protein, active in DNA mismatch repair as well as needed in apoptosis of cells with excess DNA damage. ERCC1 is active in DNA nucleotide excision repair. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 would create cells with both increased ability to survive (apoptosis resistance) and increased level of mutability. The reduced or absent expression of both ERCC1 and Pms2 is likely an early step in progression to colon cancer.
DNA repair gene Ku86 (active in DNA non-homologous end joining) and Cytochrome c Oxidase Subunit I (involved in apoptosis) had each been reported to be decreased in expression in mucosal areas close to colon cancers. However, immunohistochemical evaluation of their levels of expression showed only low to modest frequencies of crypts to be deficient in their expression in a field defect surrounding colon cancer or surrounding advanced colonic neoplasia.
We show, here, our method of evaluation of crypts for expression of ERCC1, Pms2, Ku86 and CcOI. We show that frequency of entire crypts deficient for Pms2 and ERCC1 is often as great as 70% to 95% in 20 cm long areas surrounding a colonic neoplasia, while frequency of crypts deficient in Ku86 has a median value of 2% and frequency of crypts deficient in CcOI has a median value of 16% in these areas. The entire colon is 150 cm long (about 5 feet) and has about 10 million crypts in its mucosal layer. The defect in Pms2 and ERCC1 surrounding a colon cancer thus may include 1 million crypts. It is from a defective crypt that colon cancer arises.

Reduced/absent expression of Pms2 and/or ERCC1 in entire crypts is a frequent event within 10 cm on each side of colonic adenocarcinomas, likely the basis of a field defect with high mutability and progression to cancer. Deficiency in Ku86 or CcOI is much less frequent in these field defects.

Pms2 לקוי, ERCC1, Ku86, CcOI ב פגמים שדה במהלך התקדמות סרטן המעי הגס

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

Biology

MLH1 Gene Expression in Peripheral Blood in Colon Cancer Patients and Their Association with Colon Cancer

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops caused by nucleotide misincorporation. In the absence of MLH1 protein, the frequency of non-repaired mismatches increases, resulting in organ cancer. The current study sought to quantify MLH1 gene expression and its relationship with tumor invasion (T) and lymph node invasion (N) in blood samples from patients with colorectal cancer (CRC). Blood samples were obtained from 36 CRC patients. RNA was extracted, and cDNA was synthesized using a kit. The primers were built using the exon-exon junction approach, and MLH1 and &#946;-actin genes were tested 3x using real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR). Gene expression analysis software was used to analyze the data, and a t-test was used to examine the expression of MLH1 and its connection with T and N variables. In this study, 36 patients with colorectal cancer, including 15 (41.6%) women and 21 (58.4%) men, with a mean age of 57.35 &plusmn; 4.22 years and in the age range of 26-87 years, were included. The results showed that the ratio of MLH1 gene expression in patients decreased compared to that in healthy individuals, and the decrease in gene expression at different stages of the disease was significant. The results of this study showed that the reduction of MLH1 gene expression has an effective role in the development of CRC.

This study examines the association between MLH1 gene expression in peripheral blood and colon cancer, utilizing a case-control approach to compare expression levels in patients and matched healthy controls.

MutL homolog 1 (MLH1) is a component of the heterodimeric complex MutL&#945; that detects and fixes base-base mismatches and insertion/deletion loops ...