יש הסופרים לא תודות.

הפרוצדורות והטיפול אתי בבעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטת פיטסבורג IACUC (פרוטוקול # 1,104,674). 1. הכנת תערובת מכתים G6PD הערה: ודא שהריכוז הסופי של כל ריאגנטים הוא כדלקמן; 5 מ&quot;מ glucose-6-פוספט (G6P); 2 מ&quot;מ NADP, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 0.35 סולפט 1 מ&quot;מ-methoxy-5-מתיל methylphenazinium (MMPMS) ו0.8 מ&quot;מ NBT. 1,8,9 לכל מגיב הריכוז הראשוני נגזר ל40 מיליליטר נפח סופי. פתרונות היו מוכנים טריים ומשמשים בכל יום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של 200 מ&quot;מ 7.4 חיץ pH פוספט (PB) ל -35 מיליליטר של מדיום אוקטובר בצינור 50 מ&quot;ל ולנער במרץ. ודא עם נייר pH שהפתרון הוא ~ pH 7.4. אם לא לבטל את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 61 G6P מ&quot;ג מומס ב0.94 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB, 61 מ&quot;ג NADP מומס ב0.94 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB, ו -41 מ&quot;ג MgCl 2 מומס ב0.96 PB מיליליטר של 100 מ&quot;מ. לאשרר שpH הוא ~ 7.4 שנינותנייר pH שעות. אם לא ~ 7.4, לבטל את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ג של MMPMS מומס ב0.25 מיליליטר של 200 מ&quot;מ PB (pH 7.4). במרץ לנער את תערובת תגובה וכתוצאה מכך ליצור homogenate אדום כהה ברור. אם הפתרון הוא עכור, צריכה להיות מושלכת התערובת. הצינור המכיל תערובת התגובה הוא עטוף בנייר כסף כדי למזער את החשיפה לאור. אחסן את תערובת התגובה ב RT ואילו הרכיב הסופי, NBT, מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בנפרד פתרון 5 מ&quot;מ NBT על ידי הוספת 0.4 מיליליטר פוראמיד דימתיל נטול מים (DMF) ו -0.4 מיליליטר אתנול נטול מים ל- 164 מ&quot;ג של NBT בצינור 2 מיליליטר עם מכסה O-טבעת. לסגור את המכסה באופן רופף (לא סגור היטב) ולהביא את הפתרון לרתיחה באמבטית שמן עד NBT הוא בפתרון. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר NBT solubilized להתקרר לRT ולאחר מכן להוסיף את כל הפתרון לתערובת תגובת OCT ולנער במרץ כדי להשיג פתרון ברור. שים לב לשינוי בצבע פתרון מכתום-אדום ראשונית לאדום כהה או purpצבע le לאורך זמן. זה נורמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת כתמי G6PD הסופית בC חדר חם 37 מעלות במשך שעה 1 לפני השימוש. </li></ol> 2. בעלי חיים טיפול ואוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את עכברי זכרים 6 שבועות בן C57Bl / 6 עם סוכן מזיק DNA, למשל, 10 מ&quot;ג / קילוגרם azoxymethane (AOM) בהיקף של 200 μl PBS על ידי הזרקת IP. פנק את עכברי שליטה עם 200 μl של PBS על ידי הזרקת IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 יום, להרדים עכברים על ידי CO 2 מחנק ואחריו נקע בצוואר הרחם כפי שאושר על ידי פרוטוקול IACUC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בניתוח בחלל הבטן מבדיוק מעל פי הטבעת לבסיס של עצם החזה. הזז את המעי הדק מתוך חלל הגוף אבל לא לכרות אותו. בלו המעי התחתון, ממש מתחת לcecum לפי הטבעת. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורס בזהירות בצד אחד של המעי הגס באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה ולהסיר צואה מהמעי הגס נפתח על ידי שטיפה עם PBS סטרילי הנקי. רול שוויצרי הבלומעי גס ד עם צד luminal פונה החוצה, והמקום בעובש רקמה. 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלוטין לטבול את המעי הגס בתבנית בינונית ומקום אוקטובר בדיואר המכיל נוזל N 2. להחזיק את התבנית כך שבסיס הפלסטיק הוא רק במגע עם הנוזל N 2 עד בינוני אוקטובר קפוא מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את גוש הרקמה הקפוא ב -80 עד חיתוך חלקים קפואים. אין להשתמש בכל מקבע, אשר יביא לאיון של אנזים G6PD. </li></ol> 3. הכנת סעיפים קפואים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך קטעי רקמה קפוא בעובי של 7 מיקרומטר באמצעות cryostat ב-25 מעלות צלזיוס. חותך 4 7 מיקרומטר סעיפים רצופים ומקום שניהם על אותו השקופית (איור 1). הכן 2 שקופיות, או ארבעה 7 מיקרומטר סעיפים רצופים לייצג רמה אחת של המעי הגס (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לרמה הבאה עם מרחק מינימאלי של&gt; 50 מיקרומטר מהחלק האחרון של יחסי הציבוררמת evious. מרחק זה הבטיח כי מאורות העריכו לכל רמה לא לשכפל אחד לשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות לנגב את להב cryostat עם 100% אתנול להסיר את שאריות אוקטובר שמצטברת במהלך חיתוך. לפני חתך יתחדש, הלהב היבש ניגב עם גיליון מייבש אנטי-סטטית להתפוגג מטען סטטי שנצבר. שקופיות חנות עם החלקים קפואים ב -80 o C. </li></ol> 4. הכתמה של רקמה קפואה סעיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את תגובת היסטוכימיה האנזים בחדר חם 37 ° C עם לחות גבוהה. הערה: ניסיון התגובה האנזימטית בתנור דגירה או על חם שקופית הובילה לצביעת G6PD עניה ועולה בקנה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות בארות מכתים רקמות באמצעות שני 1.5 סנטימטרים X מנקי פלדה 0.15 סנטימטר (גובה X הקוטר פנימי) שמחובר יחד באמצעות גריז סיליקון (איור 1). חותך את parafilm כדי להתאים את הבסיס של היטב עם המרכז לגזור והמקום גםד על קטע הרקמה בשקופית. הערה: parafilm על החלק התחתון של מכונת הכביסה יוצרת חותם בין השקופיות ומכונת הכביסה ששומרת את תערובת כתמי G6PD צמיגה בסעיף הרקמה. מבנה זה נותן גם עם 0.4-0.5 מיליליטר נפח, כך שכל קטע רקמה במחקר מקבל את אותו הנפח של תערובת כתמי תגובת G6PD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות רקמה קפוא ב 37 o C בחדר חם למשך 10 דקות. על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף את תערובת התגובה מכתימה G6PD היטב כל אחד קטע רקמה (2 סעיפים לכל שקופית) ל45-50 דקות. הסר שקופיות מחדר חם, ולהרים בזהירות את בארות נירוסטה מהשקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות הגדר בקצה הארוך שלהם כדי לאפשר את מדיום התגובה לניקוז. מגלשות מקום ב100 מ&quot;מ PB (pH 7.4) במשך 30-60 דקות להסיר את תערובת התגובה מכתימה G6PD מהרקמה מבלי להפריע צביעת הרקמות. לצלול שקופיות במים מזוקקים למשך 5-10 דקות כדי להסיר מלחי PB </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הרקמה על ידי תוספתing fluoro-ג&#39;ל מטפטף על הרקמות ומחכים ~ 30 דקות לייבוש. למנוע בועות שיכולים לבלבל את זיהוי של מאורות שעברו מוטציה. הערה: אם בועות טופס, ההליך ניתן לחזור לאחר הסרת fluoro-ג&#39;ל על ידי שריה במים מזוקקים. אין להשתמש בתלושי כיסוי כפי שהם נוטים בועות אוויר מלכודת. </li></ol> 5. קביעת מאורות Mutant G6PD ותדירות המוטציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שקופיות עבור מאורות מוטציה G6PD תחת מיקרוסקופ אור. הערה: הקריטריונים המשמשים לזיהוי קריפטה מוטציה מלאה היו: (i) כל הכוך היה נטול צבע הכחול; (Ii) המבנה החיצוני של הכוך היה שלם, (iii) קריפטה המוטציה נצפתה על 7 מיקרומטר חלקים סמוכים ו, ​​(iv) שני משקיפים היו לזהות את אותו כוך כמוטציה. מוטציות שנצפו על 7 מיקרומטר סעיפים סמוכים נספרות כמוטציה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה כל קריפטה המוטציה G6PD ב40X הגדלה ולקטלג את התמונות באמצעות מצלמה 5.0 מגה פיקסל עםתוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את המספר הכולל של מאורות נבחנו בעכבר על ידי בחירת סעיף נציג לכל עכבר מהרמה עם השטח הקטן ביותר פני השטח ותמונתו בהגדלה 10x (איור 1 ג). הערה: רמה מייצגת ארבעה 7 מיקרומטר סעיפים רצופים (איור 1D), אשר בשל הקרבה שלהם לעתים קרובות להראות מוטציה מאורות בסעיף אחד או יותר. הרמות מופרדות על ידי&gt; 50 מיקרומטר לדמיין מאורות מאזורים שונים של המעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח כל קובץ תמונה וחזותי לספור את מספר מאורות ברמה על ידי ניתוח הקבצים (כפי שמוצגים בתיבות תרשים 1C). קבצי תמונות ישתנו במספר מאורות נצפו מנמוך כמו 20 עד&gt; 300 מאורות בקובץ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הכולל של מאורות מהרמה הנבחרת (איור 1 ג) לכל עכבר במספר הרמות הוקרנו למאורות מוטציה G6PD עבור כל מעי גס. לדוגמא, ספירה כוללת של1,250 מאורות לרמה שנבחרה מוכפלים 8 רמות הוקרנו למאורות מוטציה שווים ספירה כוללת של 10,000 מאורות. להעריך מינימום של 10,000 מאורות עבור כל מעי גס לניתוח סטטיסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את מספר מוטציות שנצפו בכל בעלי החיים במספר הכולל של מאורות הוקרנו לחשב MF עבור כל טיפול. רמת MF תאי גזע רקע בעכברים שלא טופלו היא &lt;0.1x10 -4 (טבלת 1), שהוא קרוב לזה שדווח בעבר בC57Bl / 6 עכברים. 11 </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לעתים קרובות השפעת genotoxic של מתחם נקבעה על ידי יכולתה לשנות DNA. זה נעשה בדרך כלל על ידי בידוד הרקמות ומדידת הרמה הגלובלית של adducts DNA. לAOM, זה יהיה כרוך בכימות O 6 -methylguanine adducts במעי הגס. שימוש במידע בגישה זו על נזק בתוך סוגי תאים ספציפיים, כגון בנישת תאי גזע, הולך לאיבוד. ...

הוא חשב לסרטן מעי גס לערב חשיפה לגורמים סביבתיים ורכיבים תזונתיים שיכול לגרום נזק לדנ&quot;א ולייצר הפעלת מוטציות סומטיות באונקוגנים (למשל, SS-קטנין) או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן (למשל, APC). הנחה היא כי המוטציות קריטיות הללו מתרחשות בתאי גזע במעי הגס. בגלל ארכיטקטורת קריפטה הייחודית של האפיתל המעי הגס, אפשר למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס לאחר חשיפת בעלי חיים לכימיקלים הקשורים לסרטן מעי גס. אנזימים צמודים X כמה יכולים לשמש כמדדים למוטציות המתרחשות בתאי גזע, כמו המוטציות תהיה נוכחת בכל התאים בתוך כוך. בעבר, הליך פורסם הוכחה כי כימיקלים שגורמים לגידולים במעי הגס בעכברים גם נוצרו מוטציות בתאי גזע סומטיים במעי הגס באמצעות ניתוח של מוטציות בdehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X הגן (G6PD). 1-3השיטה מכמתת את השכיחות של מוטציות סומטיות אקראיות בתאי גזע במעי הגס ללא כל לחץ בחירה. ההליך כרוך הייצור של חלקי מעי גס קפוא מבולבל מעכברים שטופלו ובקרה וזיהוי של מאורות חסרי תאים המייצרים פעילות G6PD פונקציונלית. מאורות אלה שעברו מוטציה, אשר מופיעים לבן, מצביעים על כך שהמוטציה התרחשה בתאי גזע שהולידו צאצאים גם מחסה גן שעבר מוטציה G6PD. בassay האנזימטית, מאורות המוטציה deficient G6PD לא יכולים לחמצן גלוקוז 6-פוספט, אשר נדרש להפחתת tetrazolium ניטרו הכחול (NBT). כאשר אנזים G6PD הוא פונקציונלי, NBT בתערובת הכתמים מצטמצם formazan ומשקעים לא מסיסים, צבירה במיקום של האנזים ותאים &quot;הכתמה&quot; כחולים. תאים שמוטציות G6PD להישאר לבנבן בניגוד למאורות סוג כחולים מוכתמים פראיים. שיטה זו מודדת מוטציות שיש פנוטיפ &quot;null&quot;. בגלל enzymes, כגון G6PD, יכול לפזר את התאים בסעיף רקמה מבולבל אם החלקים ממוקמים בתמיסה מימית, יש צורך לייצב את האנזים בסעיפי הרקמות להיות מנותחים. 4 הייצוב של האנזים ב רקמה אסור להפריע לדיפוזיה של מולקולות מגיב קטנות נחוצות לתגובה האנזימטית G6PD. עשינו מספר השינויים המשמעותיים בהליך המקורי. הבינוני לצביעה האנזימטית הקריטית השתנה מאלכוהול פוליוויניל למתחם אופטימלי טמפרטורת חיתוך (אוקטובר), המאפשר שליטת pH וsolubilization של הרכיבים המשמשים assay. הצביעה מתבצעת באמצעות 0.4-0.5 מיליליטר בארות עשויות מנקי פלדה, כך שכל קטע רקמה קיבל את אותו הנפח של תערובת תגובת G6PD. הליך פותח כדי להעריך את מספר מאורות בסעיף הדמיה המספק דגימה גדולה של רקמת המעי הגס מבלילספור ידני&gt; 10 5 מאורות עבור כל מעי גס. הניתוח של 7 מיקרומטר סעיפי רקמות סמוכים מאפשר הדמיה של קריפטה מוטציה בשקופית אחד או יותר, אשר מפחיתה חפצים מכתים פוטנציאליים. שינויים אלה הופכים את ההליך יעיל יותר ושחזור. שימוש בפרוטוקול מתוקן זה, יש לנו לכמת את תדירות המוטציה בתאי גזע במעי הגס לאחר החשיפה של C57Bl / 6 עכברים לazoxymethane, סרטן מעי גס ידוע במכרסמים. 5-7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitroblue tetrazolium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose-6-phosphate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm room&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of  colonic stem cell mutations

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע היא כלי רב עוצמה כדי לכמת באוכלוסיית תאים קריטית אם, ובאיזו מידה, כימי יכול לגרום למוטציות שעלולות לגרום לסרטן. השימוש בassay האנזימטית לכמת מוטציות בתאי גזע בגן dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט צמוד X כבר דווח בעבר. 1 שיטה זו דורשת ההכנה של חלקים ודגירה קפוא של הרקמה מחולק עם תערובת תגובה כי תשואות צבע כחול אם התאים לייצר אנזים פונקציונלי dehydrogenase גלוקוז-6-פוספט (G6PD). אם לא, התאים להופיע לבנבן. יש לנו שונה תערובת התגובה באמצעות מדיום אופטימלי מתחם טמפרטורת חיתוך (אוקטובר) במקום של אלכוהול פוליוויניל. זה מקל על מדידת pH, מגביר solubilization של רכיבי צביעת G6PD ומגביל דיפוזיה של אנזים G6PD. על מנת להוכיח כי מוטציה התרחשה בתאי גזע, כל קריפטה חייבת חסר אנזימטי G6PDפעילות. רק אם תאי גזע נמלי מוטציה G6PD פנוטיפי כל הצאצאים בקריפטה תחסר פעילות האנזימטית G6PD. לזהות מאורות עם מוטציה בתאי גזע, ארבעה חלקים רצופים סמוכים קפוא (רמה) נחתכו ב 7 מיקרומטר עוביים. גישה זו של ביצוע חתכים סמוכים מספקת קונפורמציה שכוך היה מוטציה באופן מלא מאז אותו קריפטה מוטציה יקויימו בחלקים סמוכים. שקופיות עם דגימות רקמה שהיו בהפרש של יותר מ -50 מיקרומטר היו מוכנות להעריך כולל של&gt; 10 4 מאורות לכל עכבר. תדירות המוטציה היא מספר מאורות הנצפים מוטציה (לבן) ÷ במספר סוג בר מאורות (כחולים) בקבוצת טיפול.

היכולת למדוד מוטציות בתאי גזע במעי הגס בבעלי חיים מספקת דרך ייחודית, כדי לקשר בין מוטציות גיוס הסרטן. בדרך כלל, ההנחה היא כי הצעד הקריטי בהיווצרות הסרטן כרוך הפעלת מוטציות באונקוגנים ו / או inactivating מוטציות בגנים מדכאי סרטן. אנחנו הזרקנו C57Bl / 6 עכברים עם 200 μl של PBS או 10 מ&quo...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations at JoVE.com

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

כימות של מוטציות בתאי גזע המעי הגס

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.5K Views.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Video: Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

דור של אגרגטים תא Murine לב קוצב לב בהתבסס על ES-Cell-תכנות בשילוב עם Myh6-יזם-בחירה

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...