Los autores agradecen al personal del núcleo Morfología e Imagen, del núcleo de Genética Molecular (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales) y del ratón Genética Core en la Universidad de Washington en St. Louis Escuela de Medicina. Los autores son apoyados por el programa de pequeñas donaciones del centro McDonnell Celular y Neurobiología Molecular, el Centro Esperanza de Trastornos Neurológicos, el Instituto Nacional del Ojo (# R01EY022632 a DH), un Instituto Oftalmológico Centro Nacional Core Grant (# P30EY002687) y un subvención sin restricciones de Investigación de Prevención de la Ceguera en el Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales.

Declaración de Ética: Procedimientos en seres animales fueron aprobadas por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Washington en St. Louis. 1. Ratón Cría y Genotipado <ol><li> Raza ratones Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratones para producir Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Mientras que el resto de este protocolo se centra en el uso de la línea de Tg (PCP2-Cre) del ratón para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje en el cerebelo, un procedimiento similar puede ser seguido con cualquier otro Tg (Cre) ratón ( Figura 2A). </li><li> Realizar genotipado para identificar los cachorros que albergan ambos transgenes EGFP y Cre como se describió anteriormente 19. </li></ol> 2. Preparación de los materiales para la disección y Tissue Collection <ol><li> Preparar 100 ml de 30% de sacarosa en PBS (30 g de sacarosa / 100 ml de PBS 1x) y se almacena a -20 ° C. El día de tejido harvesting, deshielo y la carga ~ 30-35 ml de solución de sacarosa en una jeringa de 35 ml para perfusiones transcardial. </li><li> Preparar 40 ml de PFA al 4% en PBS (10 ml 16% de paraformaldehído y 30 ml de PBS). Cargar ~ de 30-35 ml de PFA al 4% en una jeringa de 35 ml para perfusiones transcardial. </li><li> Llenar una placa de cultivo tisular de 10 cm con 10 ml de PBS para la disección de tejidos. </li><li> Preparar un cóctel de ketamina / xilazina que consiste en 16 mg / ml de ketamina y 3 mg / ml de xilazina. </li><li> Preparar una solución de etanol al 70% para la disección. </li></ol> 3. La disección y Tissue Collection <ol><li> Usando una jeringa de 1 ml, inyectar 500 l de cóctel de ketamina el / xilazina por cada 25 gramos de peso corporal y esperar a ~ 15 min. Alternativamente, utilizar otro método aprobado institucionalmente sedación que es apropiado para el sistema biológico de interés. </li><li> Tras la sedación, pellizque suavemente la pata trasera para confirmar la falta de respuesta al dolor, fijar todas las patas en una bandeja de espuma de poliestireno con la cara dorsal de ladel ratón hacia abajo. </li><li> Pulverizar el abdomen con 70% de etanol y hacer una incisión desde el abdomen inferior a la parte superior de la caja torácica para obtener acceso al corazón. </li><li> Hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón y de insertar la jeringa que contiene la solución de sacarosa al 30% en el ventrículo izquierdo del corazón. </li><li> Perfundir la solución a una velocidad de ~ 2 a 5 ml por min. Cuando está vacío, retire la jeringa y repita con la solución de PFA 4%. </li><li> Liberar el ratón de la bandeja de espuma de poliestireno y decapitar para acceder al cerebro. </li><li> Retire la piel alrededor de la cabeza del animal con unas pinzas y tijeras. Haga un agujero en la parte posterior del cráneo con una aguja y retire con cuidado el cráneo con tijeras y pinzas de disección. </li><li> Una vez que el cerebro es claramente accesible, utilizar pinzas para quitar el cerebelo y colocarlo en PBS. Dividir en dos el cerebelo en el plano sagital con un escalpelo y transferir a la solución de sacarosa al 30% durante la noche a 4 ° C. Nota: Para prepararson secciones de parafina, fijar el cerebelo durante la noche a 4 ° C en el 4% PFA antes de la incrustación de tejidos y seccionamiento. </li></ol> 4. Procesamiento de tejidos y Seccionamiento <ol><li> Preparar una suspensión de hielo seco y butano 2-metilo. Dejar que la temperatura del baño se equilibre durante 5 min. </li><li> Llene una criomolde con compuesto de octubre y coloque una media del cerebelo biseccionado en el molde. </li><li> Usando un microscopio de disección y un par de fórceps posición el cerebelo manera que la superficie dividida en dos partes (cerca de la línea media del cerebelo) quede hacia arriba. </li><li> Transferir el criomolde a la suspensión de hielo seco durante 5 min hasta que el compuesto OCT ha formado un sólido blanco alrededor de matriz de la muestra de tejido. Nota: la muestra congelada ahora se pueden almacenar a -20 ° C si es necesario. </li><li> Label diapositivas poli-lisina pre-tratada para la recogida de las secciones de tejido y preparar el criostato de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el fin de recoger 15 micras secciones de la cerebellum. Para recoger las secciones, póngase en contacto con atención la sección de octubre con el lado revestido de poli-lisina de la diapositiva. Para preservar la orientación de la sección, no gire la diapositiva durante este paso. </li><li> Secciones de tejido tienda a -20 ° C hasta proceder a la tinción y de imagen. </li></ol> 5. La tinción e Imagen de Cerebelo Secciones <ol><li> Preparar las siguientes soluciones antes de la tinción de tejidos: ~ 50 ml de PBS ~ 5-10 ml de PFA al 4% en PBS ~ 10-20 ml de 0,5% Triton X-100, 10% de suero de burro en PBS </li><li> Secciones de cerebelo deshielo. Es importante destacar que minimizar su exposición a cualquier fuente de luz continua e intensa para prevenir la decoloración de EGFP. </li><li> El uso de una barrera hidrofóbica lápiz, dibujar un rectángulo alrededor de las secciones de tejido. </li><li> Post-fijar las secciones con 4% PFA durante 5 min. Use suficiente líquido para cubrir toda el área delimitada por la barrera hidrofóbica (normalmente ~ 500 l). El uso de un vacío o pipeta, remover el fijador particularmente cuidado de no molestar a los cortes de tejido. </li><li> Con una pipeta, aplicar suavemente PBS sobre el portaobjetos sin molestar a las secciones de tejido. Después de 5 min utilizar el vacío o pipeta para retirar con cuidado el líquido. Repita el enjuague de PBS un total de tres veces. </li><li> Con una pipeta, aplicar cuidadosamente la dilución adecuada de anticuerpos primarios (3 l Calbindin y / o anticuerpo Nesprin2 por 900 l de solución) en 0,5% de Triton X-100, 10% de suero de burro en PBS. Incubar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Nota: EGFP-KASH2 será visible por microscopía de fluorescencia directa sobre secciones congeladas, y no es necesario utilizar un anticuerpo anti-EGFP. Sin embargo, si se han preparado las secciones de parafina, formación de imágenes de EGFP-KASH2 requiere inmunodetección con un anticuerpo anti-EGFP. </li><li> Retire la solución de anticuerpo y enjuague con PBS tres veces. </li><li> Preparar 1: 1.000 diluciones de Alexa-Fluor anticuerpos secundarios en 0,5% Triton X-100,10% de suero de burro en PBS y almacenar en la oscuridad. </li><li> Retire con cuidado el enjuague final PBS y aplicar la dilución de anticuerpo secundario durante una hora en la oscuridad. </li><li> Retire la solución de anticuerpo secundario, aclarar y lavar la sección tres veces. Si es necesario, aplicar una mancha nuclear, tales como DAPI (~ 300 nM), durante la primera aplicación PBS. </li><li> Completamente eliminar la solución PBS de todo el tejido y el lugar ~ 5.7 l de medios de montaje en la sección de tejido. Coloque un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la sección de tejido y dejar de lado por unos 15-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Utilice un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros apropiados para visualizar EGFP y cualesquiera otras longitudes de onda adecuadas para los anticuerpos secundarios utilizados en los pasos 5.8 / 5.9. En rebanadas del cerebelo, utilice un objetivo 20X para ver llantas nucleares EGFP-KASH2. </li></ol>

<ol>
	<li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins:+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression?+Nature+reviews.">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li><li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+lamins:+their+structure,+assembly,+and+interactions.">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li><li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton.">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li><li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein.">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li><li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton.">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li><li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei.">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li><li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration.">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li><li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enaptin,+a+giant+actin-binding+protein,+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton.">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li><li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization.">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li><li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+outer+nuclear+membrane+protein,+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin.">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li><li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells.">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+protein+Syne-2/Nesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1/2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development.">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation.">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage.">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li><li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness.">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1/2+and+Syne/Nesprin-1/2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice.">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo.">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I.">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li><li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina.">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180 (2012).</li><li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis.">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El paso más crítico para estudiar con éxito el papel de los complejos de LINC in vivo utilizando el modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) es identificar una línea de ratones Cre adecuado (s). En efecto, si Cre está activo en otros tipos de células implicados en las vías similares, se puede complicar la interpretación de los resultados. Por lo tanto, es importante examinar las células cercanas, como se muestra aquí en las capas celulares moleculares y granulares del cerebelo (Figura 2B).</strong...

La envoltura nuclear (NE) separa el nucleoplasma del citoplasma. Se compone de una membrana nuclear interna y externa (INM y ONM, respectivamente) que se conectan en los poros nucleares. El lumen delimitado por ambas membranas se llama el espacio perinuclear (PNS). La ONM es una extensión del retículo endoplásmico rugoso (ER), y el INM se adhiere a la lámina nuclear, una malla de tipo nuclear-V filamentos intermedios representado por A y de tipo B laminas 1,2. Enlazadores de los complejos Citoesqueleto (LINC) nucleoesqueleto y son conjuntos macromoleculares que abarcan toda la envoltura nuclear para conectar físicamente el interior del núcleo a los filamentos del citoesqueleto y motores moleculares (Figura 1a). Se componen de interacciones entre evolutivamente conservados motivos que caracterizan a dos familias de proteínas transmembrana integrales de la NE: Sol (sad1 / Unc84) proteínas y Nesprins (Nuclear Sobre SPectRINS). En los mamíferos, Sun1 y Sun2 arproteínas transmembrana e del INM cuyo N-terminal nucleoplasmic región interactúa directamente con A y laminas de tipo B 3-5. En el otro lado del INM, dentro del PNS, las proteínas Sun Harbor un estiramiento-evolutiva conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminal llamado el dominio dom Dominios SUN interactúan directamente con la KASH-evolutiva conservada (Klarsicht / ANC-1, Syne homología) de dominio, la firma molecular de Nesprins. KASH dominios consisten en un tramo de ~ 30 aminoácidos C-terminal que sobresale en el PNS seguido por un dominio transmembrana 6. Al menos cuatro genes nesprin distintas (Nesprin1-4) codifican KASH contienen proteínas que se localizan en el NE 7. Las regiones citoplasmáticas de Nesprins, cuyos tamaños varían de ~ 50 kDa (Nesprin4) a un sorprendente 1.000 kDa (gigante Nesprin1), contienen múltiples espectrina repite, así como los motivos específicos que permite su interacción con los componentes del citoesqueleto, tales como actina, plectina y motores moleculares 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Estudios en vertebrados e invertebrados han mostrado que Lamin / Sun / nesprin / motores moleculares constituyen un &quot;eje&quot; conservadas evolutivamente controlar la migración nuclear y anclaje. Varios knock-out (KO) modelos de ratón de componentes complejos LINC se han descrito y fueron fundamentales en la prestación de un marco para comprender las funciones de las proteínas Sol y nesprin en el NE durante el desarrollo de los mamíferos 9,14,15. Sin embargo, estos modelos presentan varios inconvenientes significativos, sobre todo: 1) de dificultad en la interpretación de los fenotipos debido a la celda efectos no autónomos, 2) la dificultad para distinguir las contribuciones fenotípicas de KASH contienen vs. KASH menos nesprin isoformas 16, 3) la redundancia funcional de las proteínas Sun y nesprin en el NE en numerosos tipos de células requiere esquemas de mejoramiento complejos para inactivar todas las interacciones dom-KASH en ratones 17 y 4) la letalidad perinatal de ratones deficientes para el KASH-dominio de ambosNesprins1 y 2 impide el análisis de adultos fenotipos 18. Este protocolo describe un modelo de ratón novedoso diseñado para interrumpir todas las interacciones dom-KASH in vivo, en una célula de manera autónoma y regulado por el desarrollo, evitando así muchos de los inconvenientes descritos anteriormente. Este / modelo de ratón basada en lox Cre se basa en dos conceptos importantes: 1) el dominio KASH de cualquier proteína nesprin conocido es suficiente para dirigir EGFP a la NE en sistemas de cultivo celular y 2) dominios SUN interactuar promiscuamente con dominios Kash, por tanto, la sobreexpresión de cualquier dominio KASH saturará todos los dominios SUN endógenos e inactivar complejos LINC de una manera dominante negativo 17 (Figura 1B). Este protocolo describe la cosecha de tejidos y etapas de procesamiento utilizadas para confirmar la interrupción de todas las interacciones dom-KASH en las células de Purkinje del cerebelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>M1000W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmuEdge Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin Antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EGFP Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nesprin2 Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Previously described in Ref. 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl butane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O3551</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Este protocolo ilustra la utilidad de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modelo de ratón Tg para restringir EGFP-KASH2 expresión a las células de Purkinje del cerebelo utilizando TG (PCP2-CRE) ratones. En Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) descendencia, el marco de lectura abierto LacZ / V5 se escinde en P6 por la Cre recombinasa lo que conduce a la expresión de EGFP-KASH2 dirigida específicamente a las células de Purkinje (Figura 2A). Como era de esperar, EGFP-KASH2 está dirigido a la envoltura nu...

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Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K vistas.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.