Les auteurs remercient le personnel du noyau Morphologie et d&#39;imagerie, du noyau génétique moléculaire (Département d&#39;ophtalmologie et des sciences visuelles) et de la Génétique de la souris de base à la Washington University School of Medicine à St. Louis. Les auteurs sont soutenus par le programme de petites subventions du centre McDonnell cellulaire et neurobiologie moléculaire, le Centre Espoir pour les troubles neurologiques, le National Eye Institute (# R01EY022632 DH), un National Eye Institute Core Center Grant (# P30EY002687) et une subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité au Département d&#39;ophtalmologie et des sciences visuelles.

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;Université de Washington à St. Louis. 1. élevage de souris et de génotypage <ol><li> Race Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) souris avec Tg (PCP2-Cre) pour produire des souris Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Note: Alors que le reste de ce protocole met l&#39;accent sur l&#39;utilisation de la ligne Tg (PCP2-Cre) de la souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression aux cellules de Purkinje dans le cervelet, une procédure similaire peut être suivi avec un autre Tg (Cre) de la souris ( Figure 2A). </li><li> Effectuer génotypage pour identifier les chiots abritant deux transgènes EGFP et la CRE comme décrit précédemment 19. </li></ol> 2. Préparation des matériaux pour la dissection et de tissus Collection <ol><li> Préparez 100 ml de saccharose à 30% dans du PBS (30 g de saccharose / 100 ml de PBS 1x) et conserver à -20 ° C. Le jour de tissu harvesting, dégel et la charge ~ 30-35 ml de solution de saccharose dans une seringue de 35 ml pour les perfusions transcardial. </li><li> Préparer 40 ml de PFA à 4% dans du PBS (10 ml de 16% de paraformaldehyde et 30 ml de PBS). Charge ~ 30-35 ml de PFA à 4% dans une seringue de 35 ml pour les perfusions transcardial. </li><li> Remplir un tissu plaque de culture de 10 cm avec 10 ml de PBS pour la dissection de tissus. </li><li> Préparer un cocktail kétamine / xylazine constitué de 16 mg / ml de kétamine et de 3 mg / ml de xylazine. </li><li> Préparer une solution d&#39;éthanol à 70% pour la dissection. </li></ol> 3. Dissection et collecte de tissus <ol><li> En utilisant une seringue de 1 ml, 500 pi d&#39;injecter le cocktail de kétamine / xylazine par 25 g de poids corporel et attendre ~ 15 min. Vous pouvez également utiliser une autre méthode de sédation institutionnel approuvé qui est approprié pour le système biologique d&#39;intérêt. </li><li> Sur la sédation, pincez doucement la patte arrière pour confirmer l&#39;absence de réponse de la douleur, épingler tous les pattes sur un plateau de styromousse avec la face dorsale de lasouris vers le bas. </li><li> Pulvériser l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol et de faire une incision de l&#39;abdomen inférieur vers le haut de la cage thoracique pour avoir accès au cœur. </li><li> Faire une petite incision dans l&#39;oreillette droite du cœur et insérer la seringue contenant la solution de saccharose à 30% dans le ventricule gauche du cœur. </li><li> Perfuser la solution à un débit de ~ 2-5 ml par min. Une fois vide, retirer la seringue et répéter avec la solution PFA 4%. </li><li> Détacher la souris à partir du plateau de styromousse et décapiter pour accéder au cerveau. </li><li> Retirer la peau autour de la tête de l&#39;animal à l&#39;aide de pinces et ciseaux. Percer un trou dans la partie postérieure du crâne avec une aiguille et retirer délicatement le crâne avec des ciseaux et des pinces à dissection. </li><li> Une fois que le cerveau est clairement accessible, utiliser une pince pour enlever le cervelet et le placer dans PBS. Couper en deux le cervelet dans le plan sagittal avec un scalpel et le transférer à la solution de saccharose à 30% pendant une nuit à 4 ° C. Remarque: Pour prépsont des coupes en paraffine, fixent le cervelet pendant une nuit à 4 ° C dans 4% de PFA avant l&#39;incorporation de tissu et la coupe. </li></ol> 4. Traitement des tissus et la coupe <ol><li> Préparer une suspension de glace sèche et le butane 2-méthyl. Laisser la température du bain à équilibrer pendant 5 min. </li><li> Remplissez un cryomoule avec le composé PTOM et placer une moitié du cervelet bissectée dans le moule. </li><li> En utilisant un microscope de dissection et d&#39;une paire de pince de la position du cervelet de sorte que la surface coupée en deux (près de la ligne médiane du cervelet) est orientée vers le haut. </li><li> Transférer le cryomoule à la suspension de la glace sèche pendant 5 min jusqu&#39;à ce que l&#39;Ordre a formé composé d&#39;une matrice solide blanc autour de l&#39;échantillon de tissu. Remarque: Les spécimen congelé peuvent désormais être conservés à -20 ° C si nécessaire. </li><li> Étiquette pré-traitée diapositives de poly-lysine pour la collecte des coupes de tissus et de préparer le cryostat selon les instructions du fabricant afin de recueillir 15 um sections de la Cèrebellum. Pour collecter les sections, contactez attentivement la section PTOM à la face revêtue de la lame de poly-lysine. Afin de préserver l&#39;orientation de la section, ne pas tourner la diapositive lors de cette étape. </li><li> Coupes de tissus de magasin -20 ° C à jusqu&#39;à procéder à la coloration et l&#39;imagerie. </li></ol> 5. Coloration et imagerie du cervelet Sections <ol><li> Préparer les solutions suivantes avant la coloration de tissus: ~ 50 ml de PBS ~ 5-10 ml de PFA à 4% dans du PBS ~ 10-20 ml de 0,5% de Triton X-100 de sérum d&#39;âne, à 10% dans du PBS </li><li> Sections cérébelleux dégel. Surtout, minimiser leur exposition à une source de lumière continue et intense pour éviter la décoloration de l&#39;EGFP. </li><li> En utilisant un stylo de barrière hydrophobe, dessinez un rectangle autour des sections de tissus. </li><li> Post-fixer les sections avec PFA 4% pendant 5 min. Utilisez assez de liquide pour couvrir l&#39;ensemble de la zone délimitée par la barrière hydrophobe (généralement ~ 500 pi). Aide d&#39;un aspirateur ou d&#39;une pipette, REdéplacer le fixateur en faisant particulièrement attention à ne pas déranger les coupes de tissus. </li><li> Avec une pipette, appliquer doucement PBS sur la diapositive sans déranger les coupes de tissus. Après 5 min utiliser l&#39;aspirateur ou une pipette pour enlever avec précaution le liquide. Répétez la PBS rincer un total de trois fois. </li><li> En utilisant une pipette, appliquez soigneusement la dilution appropriée d&#39;anticorps primaires (3 pi Calbindin et / ou d&#39;anticorps Nesprin2 par 900 pi de solution) dans 0,5% de Triton X-100, le sérum de l&#39;âne de 10% dans le PBS. Incuber pendant une heure à la température ambiante dans l&#39;obscurité. Remarque: EGFP-KASH2 restera visible par microscopie à fluorescence directe sur des coupes congelées, sans qu&#39;il soit nécessaire d&#39;utiliser un anticorps anti-EGFP. Toutefois, si des sections de paraffine ont été préparés, l&#39;imagerie de l&#39;EGFP-KASH2 nécessite immunodétection avec un anticorps anti-EGFP. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps et rincer avec du PBS à trois reprises. </li><li> Préparation 1: 1000 d&#39;anticorps secondaire dilutions Alexa Fluor-0,5 en% de Triton X-100,10% de sérum de âne dans PBS et de stocker dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirez délicatement le rinçage final PBS et appliquer la dilution d&#39;anticorps secondaire pendant une heure dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps secondaire, rincer et laver la section trois fois. Si nécessaire, appliquer un colorant nucléaire, tels que le DAPI (~ 300 nM), au cours de la première application du PBS. </li><li> Supprimer complètement la solution de PBS à partir autour du tissu et le lieu ~ 5-7 pi de milieu de montage sur la section de tissu. Placez une lamelle de verre sur le dessus de la section de tissu et mettre de côté pour ~ 15-30 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Utilisation d&#39;un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés pour visualiser EGFP ainsi que d&#39;autres longueurs d&#39;onde appropriées pour les anticorps secondaires utilisés dans les étapes 5.8 / 5.9. Dans tranches de cervelet, utilisez un objectif 20X pour voir jantes nucléaires EGFP-KASH2. </li></ol>

<ol>
	<li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins:+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression?+Nature+reviews.">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li><li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+lamins:+their+structure,+assembly,+and+interactions.">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li><li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm:+role+of+the+LINC+complex.">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li><li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton.">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li><li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein.">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li><li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton.">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li><li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei.">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li><li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration.">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li><li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enaptin,+a+giant+actin-binding+protein,+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton.">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li><li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization.">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li><li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+outer+nuclear+membrane+protein,+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin.">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li><li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells.">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+protein+Syne-2/Nesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1/2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development.">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation.">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage.">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li><li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness.">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUN1/2+and+Syne/Nesprin-1/2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice.">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo.">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li><li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I.">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li><li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina.">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180 (2012).</li><li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis.">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

L&#39;étape la plus critique pour étudier avec succès le rôle de complexes CLIC in vivo utilise le (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modèle Tg est d&#39;identifier une ligne appropriée de la souris Cre (s). En effet, si Cre est actif dans d&#39;autres types cellulaires impliqués dans les voies similaires, il peut compliquer l&#39;interprétation des résultats. Par conséquent, il est important d&#39;examiner les cellules voisines, comme illustré ici dans les couches cellulaires et moléculaires granulaires du ce...

L&#39;enveloppe nucléaire (NE) sépare le nucléoplasme à partir du cytoplasme. Il est composé d&#39;une membrane nucléaire interne et externe (INM et ONM, respectivement) qui se connectent à des pores nucléaires. La lumière délimitée par deux membranes est appelé l&#39;espace périnucléaire (PNS). L&#39;ONM est une extension du réticulum endoplasmique rugueux (ER) et l&#39;INM adhère à la lamina nucléaire, un maillage de l&#39;énergie nucléaire de type V filaments intermédiaires représenté par A et de type B lamines 1,2. Lieurs du cytosquelette et Nucleoskeleton (CLIC) sont des assemblages macromoléculaires complexes qui couvrent l&#39;ensemble de l&#39;enveloppe nucléaire de se connecter physiquement à l&#39;intérieur du noyau de filaments du cytosquelette et des moteurs moléculaires (Figure 1A). Ils se composent d&#39;interactions entre les motifs conservés qui caractérisent l&#39;évolution, deux familles de protéines transmembranaires intégrante du NE: Sun (SAD1 / Unc84) des protéines et des Nesprins (SPectRINS enveloppe nucléaire). Chez les mammifères, Sun1 et Sun2 are protéines transmembranaires de l&#39;INM dont la région nucléoplasmique N-terminal interagit directement avec A et de type B lamines 3-5. De l&#39;autre côté de l&#39;INM, dans le PNS, protéines Sun Harbor un tronçon évolutif conservé de ~ 150 acides aminés C-terminal appelé le domaine soleil. SUN domaines interagissent directement avec l&#39;évolution conservé KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologie) domaine, la signature moléculaire de Nesprins. KASH domaines sont constitués par un tronçon de ~ 30 acides aminés C-terminal qui fait saillie dans le PNS suivi d&#39;un domaine transmembranaire 6. Au moins quatre gènes distincts (Nesprin1-4 Nesprin) codent KASH contenant des protéines qui localisent au NE 7. Les régions cytoplasmiques de Nesprins, dont les tailles varient de ~ 50 kDa (Nesprin4) à une étonnante 1.000 kDa (Nesprin1 géant), contiennent spectrine multiples répétitions ainsi que des motifs spécifiques permettant leur interaction avec les composants du cytosquelette tels que l&#39;actine, plectine et moteurs moléculaires 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Études chez les vertébrés et les invertébrés ont montré que Lamin / moteurs moléculaires Sun / Nesprin / constituent un &quot;axe&quot; évolutif conservé le contrôle de la migration nucléaire et d&#39;ancrage. Plusieurs modèles de souris knock-out (KO) de CLIC composants complexes ont été décrites et ont contribué à fournir un cadre pour comprendre le rôle des protéines Sun et Nesprin au cours du développement des mammifères NE 9,14,15. Cependant, ces modèles présentent plusieurs inconvénients importants, et plus particulièrement: 1) difficulté à interpréter phénotypes dues à la cellule des effets non-autonomes, 2) la difficulté de distinguer les contributions phénotypiques de KASH contenant vs KASH-moins Nesprin isoformes 16, 3) la redondance fonctionnelle des protéines Sun et Nesprin à la NE dans de nombreux types de cellules nécessite des programmes de sélection complexes pour inactiver toutes les interactions SUN-Kash chez la souris 17 et 4) la létalité périnatale de souris déficientes pour le KASH-domaine à la foisNesprins1 et 2 se oppose à l&#39;analyse des phénotypes adultes 18. Ce protocole décrit un nouveau modèle de souris conçu pour perturber toutes les interactions SUN-Kash in vivo, dans une cellule de façon autonome et régulée par le développement, contournant ainsi la plupart des inconvénients décrits ci-dessus. Ce modèle de souris Cre / sur la base de LOX-repose sur deux concepts importants: 1) le domaine KASH de toute protéine Nesprin connu est suffisante pour cibler EGFP vers NE dans les systèmes de culture de cellules et 2) les domaines de SUN interagir pêle-mêle avec des domaines KASH, ainsi surexpression de tout domaine KASH va saturer tous les domaines de SUN endogènes et inactiver complexes CLIC de manière dominante négative 17 (figure 1B). Ce protocole décrit la récolte des tissus et des étapes de traitement utilisées pour confirmer l&#39;interruption de toutes les interactions SUN-Kash dans les cellules de Purkinje du cervelet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion Slides</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>M1000W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmuEdge Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin Antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C9848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EGFP Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nesprin2 Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Previously described in Ref. 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl butane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>O3551</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validation of a mouse model to disrupt linc complexes in a cell-specific manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Ce protocole illustre l&#39;utilité de la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) Tg modèle de souris pour restreindre EGFP-KASH2 expression à l&#39;aide de cellules cérébelleuses de Purkinje souris Tg (PCP2-Cre). Dans Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) progéniture, le cadre de lecture ouvert LacZ / V5 est excisée à P6 par la Cre recombinase ce qui conduit à l&#39;expression de EGFP-KASH2 spécifiquement ciblées sur les cellules de Purkinje (figure 2A). Comme prévu, EGFP-KASH2 est destiné à l&#39;env...

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Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validation d&#39;un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K vues.  Washington University in St. Louis School of Medicine. Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.