Actualmente no hay fármacos que están bien establecidos en la promoción de la formación de heterocromotina. Aquí presentamos un método simple y eficiente para identificar compuestos de moléculas pequeñas que promueven este proceso. Nuestro protocolo de cribado proporciona un sistema in vivo simple, económico y fácil de seguir para la identificación de fármacos que promueven la heterocromtina.
La identificación de compuestos que promueven la formación de heterocromtina puede conducir al descubrimiento de mecanismos de cáncer que la reparación y la terapia contra el cáncer. Este costo efectivo se ha medido para identificar compuestos que promueven la heterocromattina en Drosophila también podría utilizarse para contar los impactos de la forma, ya que es una medida preventiva para un grupo celular más alto de cribado celular. Nuestro protocolo de cribado también podría ser útil para las pantallas piloto rápidas, ya que este sistema Drosophila TranSheet produce un fenotipo de color ocular variado que está inversamente correlacionado con la cantidad de heterocromatina presente en la mosca.
Ayudando a demostrar el procedimiento será Kenny Dao, un estudiante de grado de nuestro laboratorio. Después de identificar y preparar una biblioteca de medicamentos para un cribado utilizando un disolvente adecuado, y la concentración deseada, cruce tres moscas macho con tres o más moscas hembra vírgenes en un vial de alimento de 25 por 95 milímetros. Con nueve milímetros de medio alimenticio Drosophila estándar.
Configure tres viales de réplica para cada medicamento. Agregue un vial de control para la pantalla. Y deje que las moscas pongan huevos durante dos días a temperatura ambiente.
En el segundo día de la cruz, anestesia a las moscas con una breve ráfaga de dióxido de carbono. Y deseche las moscas madre en una botella que contenga 70% de etanol. A continuación, diluir cada compuesto de fármaco de la población inicial para asistir a la concentración final micro molar en 33%DMSO en agua.
Y añadir 60 microlitros de la droga, o el control 33%DMSO solo, encima de la mosca de alimentos. A continuación, confirme que no hay moscas madre presentes dentro de los viales. Y añadir la solución de drogas a los viales apropiados.
Dos días después de la llegada de las moscas F1, transfiera moscas anestesiadas de un vial a la vez a una almohadilla de disección porosa con dióxido de carbono filtrando desde debajo del papel de filtro. Bajo un microscopio diseccionado, examine cada mosca entera, identificando a todos los machos heterocigotos por su falta del fenotipo rizado de ala rizada con o-dominante. Puntuar el color de los ojos de cada macho heterocigoto en una escala de uno a cinco.
Con una puntuación asignada a una superficie total de ojo disperso menos del 5% rojo. Añade una puntuación de dos a las moscas con una superficie total de ojo manchado de 6 a 25% rojo. Un tres a las moscas con una superficie total de ojo manchado de 26 a 50% rojo.
Un cuatro a las moscas con una superficie total de ojo manchado 51 a 75%rojo. Y un cinco vuela con una superficie total de ojo manchado superior al 75%. A continuación, calcule el índice de color medio de todos los machos de cada vial puntuado en triplicado.
Para confirmar que los compuestos de hecho promueven la formación de heterocromtina, se puede realizar una técnica de validación diferente, como la hinchazón occidental. En este experimento representativo, una biblioteca de fármacos de moléculas pequeñas, el conjunto de oncología 3, que se compone de 97 medicamentos oncológicos autorizados por la FDA, se probó utilizando la cepa DX1 de Drosophila Melanogaster. Según el ensayo de cribado, el metotrexato, codificado como E7 en la biblioteca, causó la mayor variación dentro de la cepa Dx1.
Sugiriendo que el metotrexato podría ser el fármaco más prometedor que promueve la heterocromattina para la futura terapia dirigida al cáncer. Para confirmar aún más que este compuesto promueve la transformación de la heterocromtina, se realizaron datos de manchas occidentales. Demostrar la regulación hacia arriba de la proteína asociada a la formatina heterocromática, la trimetilación H3K9 y validar los resultados del cribado.
El paso crítico es anotar el color de los ojos de cada uno de los moscas macho heterocigotas blancas 11-18 DX1 en una escala de uno a cinco según una ruta de estudio predeterminada. Podemos usar manchas occidentales o inmunosuchación para confirmar los impactos. El descubrimiento de compuestos que se sospecha que promueven la formación de heterocromíntina también puede conducir al descubrimiento del mecanismo genético IV del desarrollo del cáncer y ensayos clínicos en pacientes humanos.
