Name: myocardial infarction in neonatal mice, a model of cardiac regeneration
Uploaded: 2016-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
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This study was supported by an operating grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to Q.F. (grant #MOP-119600).

Las parejas reproductoras de C57BL / 6 y CD-1 IG-S ratones fueron adquiridos de Charles River. Los animales utilizados en este estudio fueron manejados de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de los Animales, y los protocolos de estudio fueron aprobados por el Subcomité Uso de Animales de la Universidad de Western, Londres, Canadá. 1. Cuidado de Animales <ol><li> Después de dar a luz es completa y crías de haber sido inicialmente amamantado por su madre para unos pocos horas, colocarlos en una jaula diferente, con una madre adoptiva CD-1. Madres CD-1 presentan un fenotipo más tranquilo con un fuerte instinto de fomento, y tienen una menor tendencia a recuperar las piezas aprovechables cachorros heridos 15. </li></ol> 2. Cirugía <ol><li> Inducir la anestesia mediante la colocación de la cría en una cámara sellada isoflurano (aproximadamente 500 l de 100% v / v isoflurano permite disipar más de 1.300 cm 3 de cámara). Mantenga el ratón en la cámara hasta el cese de movimiento (aproximadamente 30 segundos). </li><li> Retire moutilizar de la cámara y de inducir la anestesia con isoflurano hipotermia mediante la colocación del ratón sobre hielo húmedo. Para evitar la congelación, coloque hielo dentro de un guante quirúrgico estéril, envuelva el ratón dentro del guante y cubrir el guante con hielo o envolver el ratón en una gasa húmeda estéril y colocarlo sobre hielo. NOTA: Los ratones enfrían más rápido cuando el contacto con el hielo es sobre un área superficial más grande, y como tal hielo derretido puede acortar el tiempo de inducción de hipotermia. </li><li> Confirmar la anestesia por la falta de respuesta del movimiento a los pies y de pinzamiento del rabo. NOTA: cese del movimiento provocado ocurre a una temperatura corporal entre 15 ° C y 8 ​​° C. (Tiempo de enfriamiento a esta temperatura aproximadamente 1 min). La apnea completa y asistolia no se requiere para la ligadura de LAD. </li><li> Mover la cama hielo en el área quirúrgica equipado con un microscopio quirúrgico. Asegúrese de que la cría de ratón se mantiene en hielo durante todo el procedimiento quirúrgico. NOTA: El área quirúrgica, gasas y los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados. maintaen el campo estéril durante todo el procedimiento, y el desgaste de un solo uso, guantes quirúrgicos estériles. No se requiere pomada oftálmica ya que los ratones nacen con los ojos cerrados 17. </li><li> Coloque la cría de ratón en la posición de decúbito lateral derecho. Desinfectar el pecho limpiando suavemente con solución de povidona yodada seguido de un algodón empapado en etanol. </li><li> Realizar incisión en la piel en el pecho izquierdo a lo largo de la línea axilar media cortando la piel entre el xifoides y la axila izquierda de unos pocos milímetros por debajo de la pata delantera izquierda. También utilizar tijeras para cortar a través de la capa de músculo pectoral subyacente. </li><li> Realizar una toracotomía izquierda en el espacio intercostal 4º separando las costillas y los músculos intercostales con unas pinzas. NOTA: costillas neonatales son muy frágiles y pueden romperse fácilmente. Para evitar esto, suavemente costillas separadas mediante la apertura de pinzas a lo largo del músculo intercostal (en lugar de agarrar costillas). </li><li> Visualizar el anterior izquierda arteria coronaria descendente (LAD) que emerge de la aur izquierdaIcle detrás de la vena pulmonar y descender más allá de la gran vena cardíaca. NOTA: En esta ventana neonatal precoz, el timo a menudo se visualiza y puede cubrir parte de la base cardiaca. La LAD se puede ver emergente al lado de la posición del timo, en función del ángulo de incisión torácica. </li><li> Ligar la LAD pasando una sutura de nylon 11-0 (aguja de 0,007 mm de diámetro) por debajo de la arteria a través de mediados del ventrículo por debajo de la aurícula izquierda (Figura 1C). La isquemia se confirma con el escaldado del miocardio por debajo del sitio de la sutura (Figura 1G). </li><li> Cerrar la incisión torácica usando 8-0 suturas de nylon (aguja de 0,15 mm de diámetro). Use dos suturas para cerrar las costillas. Coloque ambas suturas de nervio antes de ligación para asegurar que la aguja no perforar los pulmones cuando pasa a través de la cavidad del cuerpo. </li><li> Después de cerrar las costillas, retire el ratón del lecho de hielo. Mantenga el ratón dentro del área quirúrgica y colocarlo directamente en la estéril quirúrgico parawel sobre una almohadilla térmica a 37 ° C para comenzar el calentamiento. </li><li> Una vez en la zona caliente estéril, cerrar las capas musculares y de la piel utilizando 8-0 suturas de nylon (aguja de 0,15 mm de diámetro). Utilice una sutura para la capa muscular y el uso de dos suturas para la incisión de la piel. NOTA: Músculo y capas de la piel pueden estar cerradas en una almohadilla térmica para reducir el tiempo de exposición hipotermia. la temperatura del ratón comienza a elevarse una vez colocado sobre el cojín eléctrico, pero sigue siendo lo suficientemente baja para el mantenimiento de la anestesia durante el cierre de los músculos y la piel. </li></ol> 3. recuperación quirúrgica <ol><li> Continuar el calentamiento rápido sobre una almohadilla térmica hasta el regreso de circulación espontánea. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Retire la povidona yodada y la sangre limpiando suavemente sitio de la lesión con la esponja de etanol. </li><li> Después de la recuperación de la anestesia suficiente, eliminarlo de la zona quirúrgica estéril, untarlo con ropa de cama de Fosterjaula de la madre y las crías de retorno para estimular la madre. Esto ayuda a prevenir el rechazo de la madre o la canibalización. NOTA: No devuelva los cachorros a una jaula con otros animales hasta que esté completamente recuperado. Si no se ha utilizado una camada entera, y sus compañeros de camada permanecer con la madre de crianza, colocar cachorros recuperados en el medio de la camada. Si se realiza más de una cirugía, completa todas las cirugías necesarias para una litera individual antes de devolver los ratones a su madre adoptiva. </li><li> Observar el comportamiento de la madre adoptiva hacia el cachorro cada 10 - 15 min para 2 - 3 horas para asegurar la aceptación del cachorro. Si la madre muestra la agresión hacia el cachorro herido, retire el cachorro y la eutanasia por sobredosis de isoflurano (&gt; 5%; hasta el cese de la respiración), seguido por decapitación. NOTA: perioperatoria medicamentos analgesia no son necesarios ya que los reflejos de dolor centralizados no están completamente desarrollados en esta temprana edad de 15 años. </li></ol> 4. Medición de miocardio tamaño del infarto 4 -6 horas después de la MI <ol><li> Permitir a los cachorros a recuperarse en el cuidado de una madre adoptiva CD-1 por un período de 4 - 6 horas. Retire el cachorro de la jaula con la madre y practicar la eutanasia por sobredosis de isoflurano seguido por decapitación con grandes tijeras. </li><li> Escindir el corazón bajo microscopio de disección, con cuidado de no rasgar el miocardio. <ol><li> Cortar la piel del proceso xifoides a la parte superior del tórax. pared abdominal abierta debajo de la caja torácica. Agarre la caja torácica inferior y cortar a través de las costillas y la musculatura longitudinalmente a lo largo axilar media izquierda de la línea desde el diafragma hasta la axila. </li><li> Mantenga tijeras en plano transversal y cortar cuidadosamente a través del diafragma de izquierda a derecha. Asegúrese de colocar las tijeras por debajo del nivel del corazón a fin de evitar cualquier daño al ápice. </li><li> Agarre la caja torácica y la parte cortada hacia la derecha de las costillas y la musculatura junto axilar media la línea derecha. Retire todas las conexiones vasculares en el corazón con unas tijeras. Retire el corazón de la cavidad del pecho agarrandola base. </li></ol></li><li> Sección el corazón en tres pedazos usando una cuchilla de afeitar de acero al carbono quirúrgica. Haga el primer corte a lo largo del eje corto del corazón en el punto medio entre la sutura y el ápex cardíaco. Hacer que el segundo corte en el nivel de la sutura (Figura 3A). NOTA: Esto deja una sección ápice de aproximadamente 0,75 mm de espesor, que pesa 0,0018 g; una sección mediados de base de aproximadamente 1 mm de espesor, con un peso 0,0065 g; y la base del corazón. </li><li> Colocar las secciones del corazón en 1% de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) a temperatura ambiente durante 10 - 15 min. Tenga mucho cuidado con la muestra para evitar el exceso de tinción. </li><li> Para aumentar el contraste, corregir las rebanadas del corazón manchadas con paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C. Para calcular el área del infarto%, secciones del corazón fotografía y medir el área del infarto de software de imágenes. El miocardio viable se tiñe de color rojo, mientras que el área de infarto es demarcada como blanco de 18. </li></ol> 5. Medición de laLa función cardíaca mediante ecocardiografía post-MI <ol><li> Permitir a los cachorros a recuperarse en el cuidado de una madre adoptiva CD-1 por un período de 24 - 48 h. Inducir la anestesia mediante la colocación de la cría en una cámara sellada isoflurano (5% de isoflurano). Mantenga el ratón en la cámara hasta el cese de movimiento (aproximadamente 30 segundos). </li><li> Asegure que el cachorro en la posición supina en un muelle climatizada (temperatura de 37 ° C), con su nariz en un cono de entregar 0,5 - 1% isoflurano (para el mantenimiento de la anestesia). Coloque gel de eco pre-calentado en la zona torácica izquierda. </li><li> Obtener una vista de eje largo paraesternal del ventrículo izquierdo (VI). Asegurar que las imágenes se obtienen por debajo del nivel de la sutura en el VI. Tras la adquisición de la posición, gire la sonda de ultrasonido (40 MHz) 90 ° para obtener una vista de eje corto paraesternal, y grabar en modo M imágenes ecocardiográficas. </li><li> Medir la diastólica final y terminar con diámetros internos sistólica del ventrículo izquierdo de las imágenes en modo M de eje corto. Calcular la fracción de eyección y fractioacortamiento nal. </li></ol> 6. Medición de miocardio tamaño del infarto 24 horas después de la MI <ol><li> Permitir a los cachorros a recuperarse en el cuidado de una madre adoptiva CD-1 por un período de 24 horas. Retire el cachorro de la jaula con la madre y practicar la eutanasia por sobredosis de isoflurano seguido por decapitación con grandes tijeras. </li><li> Abrir la cavidad torácica como en el paso 4.2. Antes de ablación del corazón, cuidado, sujete la aorta torácica justo por encima del diafragma con unas pinzas finas. Mantenga tijeras finas en el plano coronal, planas contra la pared torácica, y cortar la aorta torácica de la pared torácica posterior tijeras se mueve en la dirección craneal. </li><li> Cortar la aorta libre de la pared torácica y cualquier otra conexión hasta que llega al corazón. Escindir el corazón sujetando la vena cava superior y cortar todas las demás conexiones vasculares en el cuerpo. </li><li> Enjuague el corazón (aorta con adjuntos) en solución salina. cannulate cuidadosamente la aorta torácica con una aguja de calibre 30 y atar unaorta a la cánula con hilo de sutura de nylon 8-0. </li><li> Perfundir el corazón con 1 ml de solución salina a través de la aorta a través de una aguja de calibre 30 a una velocidad de 1 ml / min. Perfundir el corazón con 150 l de solución de azul de Evans al 2% a una velocidad de 1 ml / min. Retire el corazón de la cánula, la sección en tres pedazos y teñirla con TTC como se describe en la sección 4. </li><li> Para calcular el tamaño del infarto, las secciones del corazón fotografía y medir el área del infarto de software de imágenes. El miocardio viable mancha azul, en la zona de riesgo manchas de color rojo, y el área del infarto está demarcado como blanco. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La ligadura de LAD quirúrgico demostrado en el presente documento es un método fiable para producir MI en ratones neonatales. Este modelo proporciona a los investigadores un modelo reproducible con el que para estudiar la regeneración del corazón de los mamíferos. La visualización de la vasculatura coronaria es un componente clave de este método, asegurando la colocación de sutura correcta y garantizando así la reproducibilidad. Mientras que los ratones adultos no poseen capacidades poiquilotermos, la temperatu...

El infarto de miocardio (IM) es la principal causa de muerte en el mundo, y sigue siendo responsable de aproximadamente un tercio de los casos de insuficiencia cardiaca 1. Mientras que la llegada de la intervención percutánea y optimización continua del uso de trombolíticos ha aumentado la reperfusión después de un IM, la muerte de los cardiomiocitos y la pérdida de miocardio contráctil, sin embargo, ocurre. También queda un gran número de pacientes &quot;sin opción&quot; que no son candidatos para o que no vea los beneficios de estas intervenciones. Estos pacientes continúan experimentando isquemia incapacitantes que conducen a la formación de la cicatriz y el remodelado ventricular perjudicial como un mecanismo de curación del infarto. Este proceso resulta en última instancia, la insuficiencia cardíaca, para los que el pronóstico sigue siendo pobre a pesar del tratamiento farmacológico óptimo con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) y los bloqueadores beta. Por desgracia, la tasa de mortalidad a un año en pacientes con función ventricular izquierda severamente dañada todavía permanece comoalto como 26% 2. El trasplante de corazón es la última opción de tratamiento para los pacientes con insuficiencia cardíaca. Sin embargo, el grupo limitado de donantes para el trasplante de corazón no hacer de esto una opción viable para la mayoría de los pacientes. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos para restaurar el miocardio dañado sigue siendo primordial para resolver el problema de la enfermedad cardíaca. Por lo tanto, se requieren modelos animales fiables de lesión cardíaca como un componente crítico de este proceso. El dogma tradicional ha dictado que los cardiomiocitos adultos son post-mitótico, terminales células diferenciadas, incapaces de dividir o cierre definitivo de diferenciación para reemplazar el miocardio dañado 3. Como tal, un corazón de los mamíferos adultos nunca pudo recuperarse completamente de una lesión, y cardiomiocitos perdidos sería reemplazado por tejido fibroso. Por lo tanto, la investigación se ha centrado principalmente en agentes terapéuticos para reducir al mínimo la expansión del infarto y reducir la formación de cicatrices. Sin embargo, más recientemente, se ha producido un cambio de paradigmaen el pensamiento que rodea la cicatrización cardíaca y muchos esfuerzos de investigación se han redirigido a centrarse en el potencial para la regeneración cardiaca 4. Hasta hace poco, el estudio in vivo de regeneración cardiaca se restringió a los modelos no de vertebrados, tales como los que en anfibios y peces teleósteos urodelos 5-7. Sin embargo, el descubrimiento de la capacidad de regeneración cardiaca en el ratón neonatal ha llevado al desarrollo de dos modelos quirúrgicos de la regeneración cardiaca de mamífero: la resección de la oclusión de la arteria coronaria cardiaca ápice y para inducir el infarto de miocardio 8,9. En 2011, se utilizó un modelo de la resección del ápice del ratón para demostrar que la regeneración cardiaca completa es posible en el día postnatal 1 (P1). Sin embargo, esta capacidad disminuye rápidamente después del período neonatal inicial. El corazón de los mamíferos pierde su potencial regenerativo poco después del nacimiento en P7 como el número de células progenitoras declive, y cardiomiocitos llegar a ser binucleadas, perdersu competencia proliferativa, y permanentemente salen del 10,11 ciclo celular. La comprensión de las diferencias fundamentales entre el recién nacido y corazón de los mamíferos adultos puede conducir a nuevos conocimientos sobre la regeneración cardiaca. Si bien la resección del ápice de hecho ofrece una visión de re-crecimiento de tejido contráctil, el modelo no simula una lesión cardiaca humano típico, y por lo tanto no se presta también para el desarrollo de la terapéutica. El modelo de oclusión de la arteria coronaria, sin embargo, simula de forma más directa los aspectos fisiopatológicos de la patología MI, y por lo tanto pueden proporcionar información más útil sobre los mecanismos que pueden ser aplicables al avance terapéutico para uso humano. Ligadura coronaria quirúrgica se ha utilizado como una técnica experimental útil en muchos modelos animales 12-14. En el modelo de ligadura de la arteria coronaria de adultos, los animales se anestesiaron y se intubados para permitir la apertura de la cavidad torácica, manteniendo respiratien. El corazón sigue latiendo regularmente, permitiendo la visualización de la vasculatura coronaria y permitiendo la colocación de la sutura precisa. Por otra parte, el corazón sigue siendo de color rosa como la perfusión continua, y después de la ligadura del miocardio isquémico se ve pálido, lo que indica éxito ligadura de la arteria coronaria. El protocolo descrito para ratones recién nacidos, sin embargo, es menos fiable como la arteria coronaria no se visualiza y el cirujano debe estimar dónde colocar la sutura 15. Aunque la anatomía general de la vasculatura coronaria es el mismo, la variabilidad animal individual en la dirección y la ramificación de la LAD existe 16. Por lo tanto, cuando &quot;ir a ciegas&quot;, la arteria podría perderse fácilmente. entonces se requieren otras técnicas, como la ecocardiografía para confirmar la inducción exitosa de MI, y para asegurar que todas las cirugías como resultado un tamaño del infarto similar. Aquí se describe una mejora en un método recientemente publicado 15, donde la posición de la LAD Se puede establecercado y por lo tanto LAD se pueden ligar para inducir reproducible MI. Esta técnica no requiere intubación endotraqueal o ventilación mecánica, como la toracotomía en un estado hipotérmico en el ratón neonatal no resulta en el colapso pulmonar. Sin embargo, en el método anteriormente descrito, la hipotermia severa debe ser inducida hasta el punto de tanto apnea completa y el cese del ritmo cardíaco 15. La principal limitación de este enfoque es que la arteria coronaria ya no es perfundido y el corazón se ve pálido, incluso antes de la ligadura de LAD. En el enfoque descrito en el presente documento, la visualización de las arterias coronarias es posible en un punto de letargo antes de la hipotermia profunda y la cesación del ritmo cardíaco y la recuperación completa del ratón neonatal después de la cirugía. Este método ofrece una ventaja importante de 100% de reproducibilidad.

<table><tbody><tr><td>8-0 Nylon Suture</td><td>Microsurgery Instruments</td><td>8-0 Nylon</td><td></td></tr><tr><td>11-0 Nylon Suture</td><td>Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd</td><td>H1101</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Small forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Micro Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-02</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>300002</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>CA2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Chamber</td><td>Made in Feng laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC)</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope SteREO Discovery. V8</td><td>Zeiss</td><td>435400</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision 8.0</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiocam Icc5</td><td>Zeiss</td><td>426554</td><td></td></tr><tr><td>Heat pad</td><td>Sunbeam&amp;nbsp;</td><td>731A0-CN</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gloves</td><td>VWR</td><td>414004-430</td><td></td></tr><tr><td>Gauze Sponges</td><td>Ducare</td><td>90212</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound imaging system, Vevo2100</td><td>Visual Sonics</td><td>VEVO2100</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound transducer, 40 MHz</td><td>Visual Sonics</td><td>MS400</td><td></td></tr></tbody></table>

myocardial infarction in neonatal mice, a model of cardiac regeneration

El infarto de miocardio inducido por ligadura de la arteria coronaria se ha utilizado en muchos modelos animales como una herramienta para estudiar los mecanismos de la reparación cardíaca y la regeneración, y para definir nuevas dianas para la terapéutica. Durante décadas, los modelos de la regeneración cardíaca completa existían en anfibios y peces, sino un homólogo de mamíferos no estaba disponible. El reciente descubrimiento de una ventana postnatal durante el cual los ratones poseen capacidades regenerativas ha llevado a la creación de un modelo de mamífero de la regeneración cardíaca. Un modelo quirúrgico de la regeneración cardiaca de mamífero en el ratón neonatal se presenta en este documento. En pocas palabras, postnatal día 1 (P1) los ratones se anestesian por isoflurano y se coloca sobre una almohadilla de hielo para inducir la hipotermia. Después se abre el pecho, y la descendente anterior de la arteria coronaria (LAD) se visualiza, una sutura se coloca alrededor de la LAD para causar isquemia de miocardio en el ventrículo izquierdo. El procedimiento quirúrgico tarda 10-15 minutos. La visualización de la arteria coronaria secrucial para colocación de la sutura precisa y reproducibilidad. El infarto de miocardio y disfunción cardíaca se confirman por el cloruro de trifenil-tetrazolio tinción y la ecocardiografía (TTC), respectivamente. regeneración completa 21 días después de un infarto de miocardio es verificada por la histología. Este protocolo se puede utilizar como una herramienta para dilucidar los mecanismos de regeneración cardiaca de mamífero después de un infarto de miocardio.

El procedimiento de infarto de miocardio en P1 puede ser completado en el 10 - 15 min y tiene una tasa de mortalidad del 7,8% (5 de 64 cachorros). Después de la cirugía, los ratones se recuperan de la anestesia de hipotermia en el próximo de 5 - 20 minutos (tiempo de recuperación depende de la temperatura corporal alcanzado durante la anestesia y la velocidad del cirujano). Cuando se utiliza crías P7 (para la comparación con un miocardio no regenerativa), se requiere un período de...

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Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

El infarto de miocardio en ratones recién nacidos, un modelo de regeneración cardiaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

myocardial-infarction-in-neonatal-mice-a-model-of-cardiac-regeneration

Research

JoVE Journal

Medicine

18.4K vistas.  Western University. This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Video: Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study reveals that transplantation of neonatal cardiac macrophages recruited by injury promotes adult heart regeneration after myocardial infarction with improvement of cardiac function and cardiomyocyte proliferation. The results indicate that neonatal cardiac macrophage transplantation could be a promising strategy for cardiac injury treatment. Here, we provide the technical details, including the isolation of neonatal cardiac macrophages from apical resection-injured neonatal mouse hearts, the transplantation of macrophages into myocardial-infarcted adult mice, and the estimation of heart regeneration after a macrophage graft.

We provide a protocol for neonatal cardiac macrophage separation and transplantation into an adult mouse heart, which could be a promising way to promote cardiac repair.

Trasplante de macrófagos cardíacos neonatales de ratón en ratones adultos

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...

Investigación

Bioquímica

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Captura de la respuesta de la lesión cardíaca de las poblaciones celulares objetivo a través de imágenes tridimensionales del corazón despejado

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Biología del Desarrollo

Clonal Analysis of the Neonatal Mouse Heart using Nearest Neighbor Modeling

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting bona fide heart regeneration limits the validation of potential regenerative factors. One method to detect new cardiomyocytes is multicolor lineage tracing with clonal analysis. Clonal analysis experiments can be difficult to undertake, because labeling conditions that are too sparse lack sensitivity for rare events such as cardiomyocyte proliferation, and diffuse labeling limits the ability to resolve clones. Presented here is a protocol to undertake clonal analysis of the neonatal mouse heart by using statistical modeling of nearest neighbor distributions to resolve cardiomyocyte clones. This approach enables resolution of clones over a range of labeling conditions and provides a robust analytical approach for quantifying cardiomyocyte proliferation and regeneration. This protocol can be adapted to other tissues and can be broadly used to study tissue regeneration.

Presented here is a protocol for using multicolor lineage tracing and nearest-neighbor modeling to identify clonally derived cardiomyocytes during growth and regeneration in mice. This approach is objective, works across different labeling conditions, and can be adapted to incorporate a variety of image analysis pipelines.

By replacing lost or dysfunctional myocardium, tissue regeneration is a promising approach to treat heart failure. However, the challenge of detecting ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Modelo apical Resección ratón para el Estudio de la regeneración del corazón de mamíferos Temprana

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

Medicina

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

Trasplante de un parche bioimpreso 3D en un modelo murino de infarto de miocardio

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Bioingeniería

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modelo de criolesiones para estudiar el infarto de miocardio en el ratón

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

Inducción de infarto de miocardio y lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar Langendorff over a century ago. Although this technique has been applied to mice over the last 25 years, its use in this species has been limited to adult animals. Development of a successful method to consistently cannulate the neonatal murine aorta would allow for the systematic study of the isolated retrograde perfused heart during a critical period of cardiac development in a genetically modifiable and low-cost species. Modification of the Langendorff preparation enables cannulation and establishment of reperfusion in the neonatal murine heart while minimizing ischemic time. Optimization requires a two-person technique to permit successful cannulation of the newborn mouse aorta using a dissecting microscope and a modified commercially available needle. The use of this approach will reliably establish retrograde perfusion within 3 min. Because the fragility of the neonatal mouse heart and ventricular cavity size prevents direct measurement of intraventricular pressure generated using a balloon, use of a force transducer connected by a suture to the apex of the left ventricle to quantify longitudinal contractile tension is necessary. This method allows investigators to successfully establish an isolated constant-flow retrograde-perfused newborn murine heart preparation, permitting the study of developmental cardiac biology in an ex-vivo manner. Importantly, this model will be a powerful tool to investigate the physiological and pharmacological responses to ischemia-reperfusion in the neonatal heart.

The present protocol describes aortic cannulation and retrograde perfusion of the ex-vivo neonatal murine heart. A two-person strategy, using a dissecting microscope and a blunted small gauge needle, permits reliable cannulation. Quantification of longitudinal contractile tension is achieved using a force transducer connected to the apex of the left ventricle.

Técnica modificada para el uso de corazones murinos neonatales en la preparación de Langendorff

The use of the ex-vivo retrograde perfused heart has long been a cornerstone of ischemia-reperfusion investigation since its development by Oskar ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...