PAL fue financiado por beca de investigación en Reino Unido un Parkinson (grant F1002). Este trabajo fue apoyado por una beca MRC de investigación investigador del nuevo (Señor/L010933/1) y MRC programa concede Señor/N026004/1 y PAL por beca BBSRC BB/M017222/1 a JET. Agradecemos a la cohorte 2014-15 de MPharm parte 1 estudiantes de la Universidad de Reading, para tomar parte en la primera iteración de este práctico y posteriores cohortes para su retroalimentación y la entrada.

Nota: El siguiente protocolo fue desarrollado para celebrará a lo largo de dos horas (incluyendo la terminación de las hojas de trabajo en clase) en un laboratorio de enseñanza específico. Los pasos experimentales fueron deliberadamente puesto para excluir un análisis más detallado de la cinética de la enzima (llevado a cabo en el contexto de este curso utilizando datos del modelo); sin embargo, como se señaló en la discusión, el Protocolo prevé una plantilla de análisis más avanzados según nivel de logro de tiempo, las instalaciones y los estudiantes.
SEGURIDAD: Esta práctica debe llevarse a cabo según las reglas de práctica de laboratorio química buena (GCLP) — equipos de protección personal, incluyendo capa sujetada de laboratorio, guantes desechables y gafas de seguridad se deben usar en todo momento en el laboratorio .
1. extracción de la enzima
<ol><li>Triturar una pastilla de lactasa, que contiene 200 mg de enzima, para un polvo incluso utilizando un mortero y una maja.</li>
	<li>Coloque el polvo resultante en un tubo de 15 mL con "suspensión" y resuspender en 10 mL de 100 mM fosfato tamponada salino (PBS).</li>
	<li>Vortex durante 1 minuto maximizar la extracción de la enzima.</li>
	<li>Transferir 1 mL de la suspensión a un tubo de centrífuga de 1.5 mL y centrifugar por 1 min a 10.000 x g a partículas de sedimento.</li>
	<li>Transferir 500 μl del sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL con "Extracto de la lactasa".</li>
</ol>2. observación de la reacción colorimétrica
<ol><li>Lugar 390 μl de PBS de 100 m m en un tubo de 1,5 mL etiquetados "A la reacción".</li>
	<li>Añada 100 μl de solución ONPG de 5 mM y mezclar bien todo con un vórtex. PRECAUCIÓN: Este práctico utiliza Orto-nitrofenol -beta-D-galactopiranosida (ONPG) como sustituto de lactosa. ONPG es un compuesto fenólico, deben ser manejado con precaución. En caso de contacto con la piel con ONPG, la piel expuesta se debe lavar inmediatamente. Cualquier derrame debe ser limpiado inmediatamente con toallas de papel sean desechados en la corriente de residuos apropiada.</li>
	<li>Añadir 10 μl de extracto en el tubo de reacción A y mezcla bien con un vórtex.</li>
	<li>Observar la mezcla de reacción durante 5 minutos y anote cualquier cambio colorimétrico en la solución.</li>
</ol>3. medición actividad enzimática
<ol><li>Configurar dos tubos de 1,5 mL: uno marcado con "Reacción B", con un "Control".</li>
	<li>Añadir 390 μl de PBS de 100 mM a la reacción tubo B, 400 μL de PBS de 100 mM para el tubo de control y luego agregar 100 μl de 5 mM ONPG a cada tubo.</li>
	<li>Mezcle el contenido con un vórtex.</li>
	<li>Añada 10 μl de extracto de lactasa al tubo de reacción B, mezclar con un vórtex y permitir la reacción proceder durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transcurrido 1 minuto, Añadir 500 μl de carbonato de sodio de 1 M a ambos tubos para inhibir la enzima lactasa al aumentar el pH, lo que termina la reacción.</li>
	<li>Transferir 500 μl de cada tubo en cubetas de espectrofotómetro limpia y medir la absorbancia a 420 nm con el espectrofotómetro.</li>
	<li>Cuenta la absorbancia de la reacción en B y muestras de control y luego restar el valor del control del valor de la reacción para obtener el cambio en la absorbencia debido a hidrólisis de ONPG en presencia de enzima activa.</li>
</ol>4. efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
<ol><li>Configurar control tres tubos y tres tubos de reacción según se describe en la sección 3 y etiquetar estos «4 ° C», "Temperatura ambiente" y "37 ° C".</li>
	<li>Tras adición de enzima extracto, incubar un tubo de hielo, uno a temperatura ambiente y otro a 37 ° C (en baño de agua previamente calentado).</li>
	<li>Permiten que las reacciones a seguir durante 1 minuto y luego terminar la reacción mediante la adición de 500 μl de carbonato de sodio de 1 M a cada tubo.</li>
	<li>Medir la absorbancia a 420 nm para cada tubo como se describe en la sección 3. Registrar los valores, restando el valor del control del valor de la reacción en cada caso.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Un conocimiento detallado y la comprensión de las enzimas, reacciones enzimáticas y cinética de la enzima se requiere para una amplia gama de temas que abarca la biología, la biomedicina y la farmacología. El protocolo descrito anteriormente utiliza lactasa como un ejemplo de una enzima relevante para la salud humana para demostrar reacciones enzimáticas, proporcionando habilidades clave que pueden utilizarse en experimentos de laboratorio más avanzados.
Este protocolo ha sido diseñado deliberadamente para ser tan robusto como posibles, permitiendo que estudiantes con poca o ninguna experiencia de laboratorio húmedo para producir resultados interpretables en un corto espacio de tiempo. En el año académico 2014/2015 en la Universidad de Reading, escuela de farmacia, un total de 144 alumnos, organizados en grupos de 3, llevó a cabo el experimento de "medición de lactasa", con todos los grupos capaces de detectar algún nivel de la actividad enzimática de tabletas de lactasa extractos.
Hay una serie de pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, es esencial que la extracción inicial es eficiente, lo que permite la solubilización de suficiente enzima activo para posteriores análisis. En nuestra experiencia, primer año estudiantes pueden lograr esto siguiendo el protocolo descrito; sin embargo algunas orientaciones de manifestantes laboratorio fue requerido en este punto. Aunque parece un punto evidente, un factor clave en el éxito de este protocolo es la capacidad de medir volúmenes, correctamente etiquetar tubos y seguir cuidadosamente las instrucciones. Mientras que un cierto nivel de habilidad puede suponer para muchos estudiantes, la supervisión cuidadosa y una solicitud clara para los estudiantes a pedir ayuda en caso de que no está seguros de qué hacer proporciona la mayor probabilidad de una prueba exitosa.
Evaluación de los estudiantes puede llevarse a cabo por la clase hoja de cálculo (disponible como material suplementario), pidiendo a los estudiantes observar datos de los experimentos, comente sus resultados y el enlace al fondo información y lectura del material de la Conferencia, o más detallado de evaluación de la clase con modelo datos permitiendo análisis cinéticos trató y evaluar.
El protocolo aquí presentado es un ejemplo simple de un ensayo de actividad de la lactasa bajo condiciones de laboratorio de enseñanza, y hay una gran oportunidad para aumentar la complejidad del experimento que permite análisis más avanzados. En particular, el protocolo presentado ofrece una introducción al concepto de cinética de la enzima pero no permite el análisis cinético de los datos experimentales. Como tal, se recomienda ver el protocolo descrito como una plantilla inicial de clases, con las precisiones que adaptarse a los objetivos específicos y los talentos de la cohorte de estudiantes llevando a cabo los experimentos. Ejemplos de experimentos extendidos podrían incluir: repetir las mediciones a diferentes temperaturas, utilizando concentraciones de sustrato diferentes para permitir el análisis estadístico, análisis cinético de los datos (convenientes para los estudiantes de bioquímica/mayores), a partir de varios diferentes tabletas y permitiendo a los estudiantes evaluar la actividad de la enzima en cada uno (con la adición de tabletas de control, adecuadas para estudiantes/mayores de ciencia forense), evaluar el impacto de la desnaturalización de calor o llevar a cabo la competencia experimentos de adición de lactosa o inhibidores de la lactasa (tabla 1). Un protocolo detallado para el análisis cinético de la lactasa ha sido previamente publicado12.
Una fuerza importante de este protocolo es que combina una introducción básica a la cinética de la enzimología y la enzima con un estudio de caso reales de enzimología en medicina. Esto hace que este laboratorio experimento de particular relevancia para los estudiantes de medicina, farmacia, ciencias biomédicas y temas relacionados. Lo importante, el hecho de que existe una condición médica grave y un problema dietético más generalizado asociada a catabolismo de la lactosa proporciona la oportunidad de plantear una amplia gama de problemas médicos y éticos con los estudiantes. Esto podría incluir las cuestiones relacionadas con las pruebas genéticas para afecciones y asociados debates relativos a la terapia genética y asesoramiento genético, así como el uso y venta de suplementos medicinales. Una limitación importante es que el Protocolo no permite para la estimación precisa de la concentración de enzima, debido al material de partida utilizado para la extracción. Una modificación para tener en cuenta esto, sin embargo, sería utilizar enzimas de grado reactivo para el análisis. Lo importante, esto permitiría también para el cálculo más preciso de la cinética de la enzima lactasa.
En conclusión, ensayando la actividad de la lactasa en un laboratorio de enseñanza entorno proporciona una introducción robusta, atractiva e interesante en el campo de la biología de la enzima para estadios iniciales universitarios.

Las enzimas son un tipo especializado de proteína que actúan como catalizadores biológicos para las reacciones químicas en la vida de los organismos1. La acción de enzimas es fundamental para la vida, proporcionando energía, eliminación de desechos y permitiendo a los organismos funcionar. Las enzimas de la comprensión es, por tanto, fundamental para un entendimiento completo de la vida. Tal conocimiento es esencial para una amplia variedad de programas de grado de nivel universitarios, que van desde las ciencias médicas a la biología. Mientras que un fondo detallado desde principios de la catálisis a modelos teóricos de la actividad enzimática se puede proporcionar a los estudiantes con charlas y material de lectura, las propiedades de las reacciones enzimáticas son mejor comprendidas por las manos en la experiencia práctica de enzimas en acción como ya demostraron2. Este protocolo proporciona un simple seguir el paradigma experimental para medir la actividad enzimática bajo condiciones de laboratorio, utilizando lactasa como un ejemplo de una enzima con una actividad relevante para la salud y nutrición humana.
La lactasa hidrolasa glicosídicos (EC 3.2.1.23/26) es una enzima de importancia nutricional para mamíferos3. La actividad de la lactasa se conserva altamente a través de la evolución y deriva de la familia beta-galactosidasa de enzimas — una familia actual de Escherichia coli a través de Homo sapiens (figura 1, PDB 1JZ8)4. La importancia de la lactasa en un entorno nutricional humana proviene de su papel en permitir la descomposición de la lactosa en sus componentes monosacáridos constituyentes, que se pueden entonces utilizar para generar energía en el cuerpo. La lactasa cataliza la hidrólisis del enlace glucosídico en la lactosa disacárido, liberando galactosa y glucosa (figura 2)5. Luego, estos monosacáridos se usan principalmente para la generación de trifosfato de adenosina (ATP) vía el ciclo del ácido cítrico y fosforilación oxidativa6. Durante el recién nacido y el desarrollo infantil, la lactasa es altamente expresada en el sistema digestivo humano, romper lactosa proveniente de la leche materna que la lactosa es el componente principal de hidratos de carbono y una de las principales fuentes de nutrición durante los primeros años 7. deficiencia congénita de lactasa (EPC), una condición recesiva de un autosoma rara causada por mutaciones en el gen de la lactasa (LCT) que codifica para la enzima de lactasa8destaca la importancia médica de la lactasa. Recién nacidos con enfermedad pulmonar crónica exhiben muy poca actividad de la lactasa, así no pueden ser alimentados con leche materna, cualquier otro tipo de leche o fórmula que contenga lactosa.
Durante la infancia, normalmente se reduce la expresión de la lactasa; sin embargo, esta reducción tras destete varía geográficamente, con aproximadamente el 35% de adultos en todo el mundo continúan expresan la enzima9. Expresión sostenida de la lactasa, conocida como persistencia de la lactasa, permite a los individuos a seguir digerir la leche y productos lácteos de una variedad de fuentes. Por el contrario, la pérdida de expresión de la lactasa puede conducir a la intolerancia a la lactosa, también conocido como el adulto-tipo hypolactasia (ATH), resultante de la incapacidad de descomponer la lactosa en el intestino. ATH se caracteriza por una estructura arriba de lactosa en el colon después de la ingestión de lactosa que contienen los productos alimenticios. En el colon, se fermenta la lactosa acumulada por la fauna microbiana intestinal, liberando gases como hidrógeno, metano y dióxido de carbono. La producción de estos gases en individuos con deficiencias de lactasa Enzima promover la distensión abdominal, aumento de flatulencia, dolor, náuseas y borborygmi (ruidos de estómago)7. Aumento de los niveles de lactosa en el tracto digestivo también puede llevar a heces sueltas.
El control de la expresión génica de LCT es modulado por polimorfismos en intrones del gen MCM6 cercano. Individuos con la expresión sostenida de lactasa llevan polimorfismos que funcionan como potenciadores distales fuertes de la expresión génica LCT , compensando así la normal por la regulación de la transcripción de la LCT durante el destete y en consecuencia mantener la expresión de la lactasa en la edad adulta3. Polimorfismos de reforzador se han sugerido por haber sido seleccionado positivamente después de la domesticación del ganado y los camellos en el Medio Oriente hace más de 5 mil años9,10.
Los síntomas resultantes de ATH pueden gestionarse por reducción de la ingesta de lactosa, por ejemplo mediante la eliminación de productos lácteos de la dieta. Un enfoque alternativo para la ATH y el método de elección para la enfermedad pulmonar crónica, es el uso de suplementos de lactasa, ampliamente disponibles en las farmacias. Estos suplementos proporcionan lactasa aislada de una variedad de fuentes, incluyendo levaduras y bacterias, en forma basadas en píldora o líquida que puede ser tomada con o añadida a la lactosa que contiene los alimentos. El suplemento hidroliza una parte de la lactosa presente en los alimentos a los productos glucosa y galactosa, así permitiendo su absorción y evitar la acumulación de sustrato de lactosa no digerida en el intestino.
Basado en el uso de suplementos de lactasa como una ayuda dietética, hemos desarrollado un experimento de laboratorio de enzimología simple adecuado para primer año biomédicos ciencia o farmacia estudiantes. Este experimento aprovecha de suplementos de lactasa disponible comercialmente y de Orto-nitrofenol -beta-D-galactopiranosida (ONPG) para proporcionar un punto final colorimétrico para medir la ruptura de los enlaces glucosídicos de lactasa ( Figura 3)11. ONPG actúa un sustrato artificial para la lactasa, que cuando se someten a hidrólisis por esta enzima produce d-galactosa y Orto-nitrofenol. Este último producto posee un color amarillo, absorción de luz en una longitud de onda de 420 nm. Mediante la cuantificación de los cambios de absorbancia a 420 siguiente nm la exposición de ONPG a lactasa, es posible estimar la actividad de esta enzima. Este experimento de laboratorio ofrece una demostración de la actividad enzimática de la hidrolasa. Construyendo en repeticiones adicionales y llevar a cabo ensayos en diferentes condiciones, es posible incorporar análisis más sofisticados de la cinética de la enzima, proporcionando un valioso ejemplo de la vida real de las enzimas en acción relevante para la salud humana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lactase tablet</td>
			<td style="width:71px;">Lamberts</td>
			<td style="width:119px;">8511-60</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Phosphate buffered saline (powdered)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">ONPG</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N1127</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Carbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">451614</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:71px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pestle and mortar</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Jenway 6315</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pipettes</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">15 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:71px;">Jenway</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Vortex genie 2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Weighing scales</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

Entender cómo las enzimas trabajan y esto referente a ejemplos de la vida real, son fundamental para una amplia gama de licenciaturas en las ciencias biológicas y biomédicas. Este fácil de seguir protocolo fue desarrollado para estudiantes de pregrado de farmacia primer año y proporciona una introducción básica a reacciones enzimáticas y procedimientos analíticos para el análisis de enzima. La enzima de elección es lactasa, ya que esto representa un ejemplo de una enzima disponible comercialmente relevante para la práctica del farmacéutico de la enfermedad humana. La lactasa se extrae de tabletas de suplemento dietético y evaluó mediante un ensayo colorimétrico basado en la hidrólisis de un sustrato artificial de lactasa (Orto-nitrofenol - -D-betade galactopiranosida, ONPG). Lanzamiento de lactasa después de la ruptura hidrolítica de ONPG Orto-nitrofenol se mide por un cambio en la absorbancia a 420 nm y el efecto de la temperatura en la reacción enzimática se evalúa mediante la realización de la reacción en hielo, a temperatura ambiente y a 37 ° C. Análisis más avanzado se pueden implementar usando este protocolo de evaluación de la actividad enzimática bajo diferentes condiciones y utilizando diferentes reactivos.

Resultados representativos para la sección 2 del Protocolo se muestran en la Figura 4A. La reacción de control, en ausencia de la enzima lactasa, sigue siendo clara que la solución de reacción, que contiene extracto de la pastilla de lactasa, se vuelve amarilla como ONPG es hidrolizado liberando Orto- nitrofenol. Figura 4B muestra cuantificación utilizando unidades arbitrarias de la sección 4 del Protocolo, el siguiente análisis de las muestras utilizando el espectrofotómetro. Producción de Orto-nitrofenol es menor cuando la reacción se incuba en hielo y mayor cuando la reacción se lleva a cabo a 37 ° C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> Figura 1 : E. coli beta-galactosidasa. (A) estructura cristalina de la beta-galactosidasa de Escherichia coli, que muestra la estructura tetramérica de activo complejo. (B) Allolactose (mostrado en rojo) enlazado al sitio activo de la beta-galactosidasa. Imágenes generadas a partir de PDB 1JZ84. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> Figura 2 : Acción enzimática de la lactasa. Hidrólisis de lactosa por lactasa para producir beta-D-galactosa y beta-D-glucosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> Figura 3 : Hidrólisis de Orto-nitrofenol - beta -D-galactopiranosida. Hidrólisis ONPG por lactasa para producir beta-D-galactosa y Orto-nitrofenol (que es de color amarillo), lo que permite la estimación de la actividad de la lactasa por medición de absorbancia a 420 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> Figura 4 : Hidrólisis ONPG. Resultados representativos de la hidrólisis ONPG, mostrando los tubos de control y reacción (A) y datos representativos de la sección 4 del Protocolo de grabado en hojas de trabajo en clase, que muestra cruda absorbancia en unidades arbitrarias en 420 nm, corregida para el fondo y a tres diferentes temperaturas (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Condición experimental</td>
			<td>Variables experimentales</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura</td>
			<td>0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentración de sustrato</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inhibición competitiva</td>
			<td>lactosa ONPG y 0 mM, 1 mM, 5 mM o 10 mM de 5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dependencia del tiempo</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturalización de calor</td>
			<td>Extracto de lactasa se calienta a 100 ° C para 10 min antes del ensayo</td>
		</tr>
</tbody></table>Cuadro 1: potencial extendida condición experimental. Sugiere experimentos extendidos, a llevarse a cabo por triplicado, investigar aspectos específicos de la biología de la lactasa.

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Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

La actividad enzimática de la lactasa es esencial para el proceso catabólico de la lactosa disacárido. Aquí, la actividad de la lactasa en los suplementos dietéticos se analizan mediante un ensayo colorimétrico. Esto proporciona los estudiantes una plataforma experimental para la comprensión de la actividad de la lactasa y la enzima cinética.

Medición de actividad enzimática de la lactasa en el laboratorio de enseñanza

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

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112.7K vistas.  University of Reading. La actividad enzimática de la lactasa es esencial para el proceso catabólico de la lactosa disacárido. Aquí, la actividad de la lactasa en los suplementos dietéticos se analizan mediante un ensayo colorimétrico. Esto proporciona los estudiantes una plataforma experimental para la comprensión de la actividad de la lactasa y la enzima cinética.

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Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Trasplante de lentes en el pez cebra y su aplicación en el análisis de mutantes de ojos

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Investigación

Biología

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Todo el montaje utilizando In situ La hibridación de Enlace de Organismos y Biología Molecular

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

La medición de las larvas La actividad en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Actividad

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the mouse provides great potential to explore cardiac function at the molecular level. The mouse&#39;s small size does present some challenges in regards to performing detailed cardiac phenotyping. Miniaturization and other advancements in technology have made many methods of cardiac assessment possible in the mouse. Of these, the simultaneous collection of pressure and volume data provides a detailed picture of cardiac function that is not available through any other modality. Here a detailed procedure for the collection of pressure-volume loop data is described. Included is a discussion of the principles underlying the measurements and the potential sources of error. Anesthetic management and surgical approaches are discussed in great detail as they are both critical to obtaining high quality hemodynamic measurements. The principles of hemodynamic protocol development and relevant aspects of data analysis are also addressed.

This manuscript describes a detailed protocol for the collection of pressure-volume data from the mouse.

La medición de volumen de bucles de presión en el ratón

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the ...