PAL wurde von einer Parkinson UK Research Fellowship (Stipendium F1002) finanziert. Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine MRC neue Investigator Research Grant (MR/L010933/1) und vom MRC-Programm gewähren MR/N026004/1 PAL und durch BBSRC Zugehörigkeit BB/M017222/1 Jet. Wir danken die 2014 / 15-Kohorte MPharm Teil 1-Studenten an der University of Reading für Ihre Teilnahme an der ersten Iteration dieses praktische und nachfolgende Kohorten für ihre Feedbacks und Inputs.

Hinweis: Das folgende Protokoll wurde entwickelt, um im Laufe von zwei Stunden (einschließlich der Abschluss-Klasse Arbeitsblätter) gehalten werden in einem speziell angefertigten Lehre-Labor. Die experimentellen Schritte waren absichtlich zu ausschließen, genauere Analyse der Enzym-Kinetik (durchgeführt im Rahmen dieses Kurses mit Modelldaten); aber – wie in der Diskussion erwähnt – das Protokoll stellt eine Vorlage für fortgeschrittene Analysen je nach Zeit, Einrichtungen und Schüler Zielerreichungsgrad.
Sicherheit: Diese praktische erfolgt nach den Regeln der guten chemischen Labor Praxis (GCLP) – persönliche schützende Ausrüstung, einschließlich befestigt Laborkittel, Einweg-Handschuhe und Schutzbrille sollte getragen werden, bei aller Zeiten im Labor .
(1) extrahieren das Enzym
<ol><li>Zerdrücken Sie eine Laktase-Tablette mit 200 mg des Enzyms zu einer sogar Pulver mit einem Mörser und Stößel.</li>
	<li>Das resultierende Pulver in eine 15 mL-Tube "Aussetzung" gekennzeichnet und Aufschwemmen in 10 mL 100 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Vortex für 1 min, Enzym-Extraktion zu maximieren.</li>
	<li>Überführen Sie 1 mL aus der Suspension in eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 1 min bei 10.000 X g solide trubstoffe.</li>
	<li>Eine saubere 1,5 mL-Tube beschriftet "Extrakt Laktase" übermitteln Sie 500 µL des Überstands.</li>
</ol>2. beobachten die kolorimetrischen Reaktion
<ol><li>Platz 390 µL 100 mm PBS in ein 1,5 mL Röhrchen beschriftet "A-Reaktion".</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL 5 mM ONPG-Lösung und Mischung gut aufschütteln hinzu. Achtung: Diese praktische verwendet ortho-Nitrophenol -Beta-D-Galactopyranoside (ONPG) als Ersatz für Laktose. Da ONPG eine phenolische Verbindung ist, sollte es mit Vorsicht gehandhabt werden. Bei Hautkontakt mit ONPG sollte die Haut sofort gewaschen werden. Alle mögliche Überläufe sollten sofort mit Küchenpapier in den entsprechenden Abfallstrom entsorgt werden abgewischt werden.</li>
	<li>10 µL des Extraktes in das Reaktionsgefäß A und die Mischung gut aufschütteln hinzufügen.</li>
	<li>Beobachten Sie das Reaktionsgemisch für 5 Minuten zu und notieren Sie farbmetrischen Änderungen an der Lösung.</li>
</ol>3. Messung der Enzymaktivität
<ol><li>Richten Sie zwei 1,5 mL Röhrchen: eine "Reaktion B", eine beschriftete "Control" gekennzeichnet.</li>
	<li>Die Reaktion B Schlauch, 400 µL 100 mm PBS, die kontrollröhrchen fügen Sie 390 µL 100 mm PBS hinzu und dann jedes Rohr 100 µL 5 mM ONPG hinzu.</li>
	<li>Mischen Sie den Inhalt durch aufschütteln.</li>
	<li>Das Reaktionsgefäß B 10 µL der Laktase-Extrakt hinzufügen, mischen durch Vortexen und die Reaktion auf 1 min. bei Zimmertemperatur gehen lassen.</li>
	<li>Nach Ablauf 1 min fügen Sie 500 µL 1 M Natriumcarbonat beider Röhren das Laktase-Enzym zu hemmen, indem man den pH-Wert, wodurch die Reaktion beendet hinzu.</li>
	<li>500 µL aus jeder Tube in sauberen Spektrofotometer Küvetten und Messung der Extinktion bei 420 nm mit dem Spektralphotometer.</li>
	<li>Beachten Sie Absorption für Reaktion B und Kontrollproben und dann subtrahieren Sie der Kontrollwert von reaktionswert, die Änderung der Extinktion durch Hydrolyse von ONPG im Beisein von aktives Enzym abzuleiten.</li>
</ol>4. Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität
<ol><li>Drei kontrollröhrchen und drei Reaktionsgefäßen eingerichtet, wie in Abschnitt 3 beschrieben und beschriften Sie diese "4 ° C", "Zimmertemperatur" und "37 ° C".</li>
	<li>Nach Zugabe des Enzyms zu extrahieren, eine Röhre auf Eis, bei Raumtemperatur und bei 37 ° C (im Wasserbad vorgewärmt) inkubieren.</li>
	<li>Die Reaktionen auf fahren für 1 min und dann kündigen die Reaktion durch Zugabe von 500 µL 1 M Natriumcarbonat auf jedes Rohr zu ermöglichen.</li>
	<li>Messung der Extinktion bei 420 nm für jedes Rohr wie in Abschnitt 3 beschrieben. Notieren Sie die Werte Subtrahieren der Kontrollwert von reaktionswert in jedem Fall.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Ein detailliertes Wissen und Verständnis von Enzymen, enzymatischen Reaktionen und Enzym-Kinetik ist erforderlich für eine breite Palette von Themen aus Biologie, Biomedizin und Pharmakologie. Das oben beschriebene Protokoll verwendet Laktase als Beispiel für ein Enzym, das für die menschliche Gesundheit relevant für den Nachweis der enzymatischer Reaktionen, Bereitstellung von Schlüsselqualifikationen, die in erweiterten Labor Experimente verwendet werden können.
Dieses Protokoll wurde absichtlich so robust wie möglich, so dass Schüler mit wenig oder gar keine nassen Laborerfahrung interpretierbare Ergebnisse in kurzer Zeit werden. Im akademischen Jahr 2014/2015 an der University of Reading School of Pharmacy durchgeführt insgesamt 144 Studenten, organisiert in Gruppen von 3, die "Messung der Laktase" Experiment mit allen Gruppen in der Lage, gewisse enzymatische Aktivität von Laktase Tablette zu erkennen Extrakte.
Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in diesem Protokoll. Erstens ist es wichtig, dass dem ersten extrahieren effizient ist, Solubilisierung von genügend aktive Enzym für spätere Analysen ermöglicht. Nach unserer Erfahrung können erste Jahr Studenten dies erreichen durch nach dem Protokoll wie beschrieben; Allerdings bedurfte es an dieser Stelle einige Hinweise von Labor-Demonstranten. Obwohl es eine selbstverständliche Punkt scheinen würde, ist ein Schlüsselfaktor für den Erfolg dieses Protokolls die Fähigkeit, sorgfältig messen Volumen, korrekt beschriften Röhren und Anweisungen folgen. Während ein gewisses Maß an Leistungsfähigkeit kann, für viele Studenten ausgegangen werden, sorgfältige Überwachung und eine klare Aufforderung für Studierende um Hilfe bitten, wenn sie unsicher sind, bietet was zu tun ist als nächstes die größte Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Assays.
Studentischen Evaluation kann durch das in Klasse Arbeitsblatt (als Zusatzmaterial erhältlich), Kursteilnehmer, Daten aus den Experimenten, kommentieren Sie ihre Ergebnisse und die Verknüpfung mit Hintergrund Informationen/Lesung aus Vorlesungsunterlagen, Fragen oder mehr durchgeführt werden detaillierte, aus Klasse Bewertung mit Modelldaten zur Verfügung gestellt, damit kinetische Analysen versucht und bewertet werden.
Das Protokoll enthaltenen ist ein einfaches Beispiel für einen Laktase-Aktivität-Assay unter Laborbedingungen zu unterrichten, und gibt es reichlich Gelegenheit, erhöht die Komplexität des Experiments um erweiterte Analysen zu ermöglichen. Insbesondere der vorgestellte Protokoll bietet eine Einführung in das Konzept der Enzym-Kinetik aber nicht für kinetische Analyse experimenteller Daten ermöglichen. So empfehlen wir die Anzeigen des beschriebenen Protokolls als erste Vorlage für Klassen, die genaue Angaben, die die spezifischen Ziele und Talente der Schüler-Kohorte, die Durchführung der Experimente angepasst. Beispiele für erweiterte Experimente könnten: wiederholte Messungen bei verschiedenen Temperaturen, mit verschiedenen Substrat-Konzentrationen damit statistische Analyse, kinetische Analyse der Daten (geeignet für Biochemie Studierende/Majors), beginnend mit mehrere verschiedene Tabletten und ermöglicht die Schülern unterschiedliche Aktivität des Enzyms in jedem (mit dem Zusatz von Kontrolle Tabletten, geeignet für forensische Wissenschaft Studenten/Majors) bewerten, Bewertung der Auswirkungen von Hitze Denaturierung oder Durchführung Wettbewerbs Experimente durch Zugabe von Laktose oder Inhibitoren der Laktase (Tabelle 1). Ein detailliertes Protokoll für kinetische Analyse der Laktase bislang veröffentlichten12.
Eine wichtige Stärke dieses Protokolls ist, dass es eine grundlegende Einführung in Enzymologie und Enzym Kinetik mit einer realen Fallstudie der Enzymologie in der Medizin kombiniert. Dies macht dieses Labor-Experiment von besonderer Bedeutung für die Studenten der Medizin, Pharmazie, Biomedizin und verwandte Fächer. Wichtig ist, die Tatsache, dass es eine schwerwiegende Erkrankung und eine breitere diätetische Problem mit Milchzucker Katabolismus bietet die Möglichkeit, eine Vielzahl von medizinischen und ethischen Fragen mit den Studenten zu erhöhen. Dies könnte umfassen Themen rund um Gentests für Erkrankungen und verbundenen Diskussionen im Zusammenhang mit Gentherapie und genetische Beratung sowie den Einsatz und Verkauf von medizinischen Ergänzungen. Eine große Einschränkung ist, dass das Protokoll keine genaue Einschätzung der Enzym-Konzentration, durch das Ausgangsmaterial für die Gewinnung verwendet zulässt. Eine Änderung an, dies zu berücksichtigen wäre jedoch Reagenz Grade Enzym für den Test verwenden. Wichtig ist, würde dies auch für eine genauere Berechnung der Bewegungslehre für die Laktase-Enzym ermöglichen.
Prüfen Sie abschließend die Aktivität der Laktase in ein Lehrlabor Umfeld bietet eine robuste, fesselnde und interessante Einführung in das Feld der Enzym-Biologie für frühzeitige Studenten.

Enzyme sind eine spezielle Art von Protein, das als biologischer Katalysator für chemische Reaktionen in lebenden Organismen1. Die Handlung von Enzymen ist von entscheidender Bedeutung für das Leben, Energie, Entsorgung von Abfällen und die Organismen funktionieren. Verständnis Enzyme ist daher entscheidend für ein umfassendes Verständnis des Lebens. Solches Wissen ist essentiell für eine Vielzahl von Ebenen Studiengänge Universität, von der Medizin bis hin zu Biologie. Während ein detaillierten Hintergrund von Prinzipien der Katalyse bis hin zu theoretischen Modellen der Enzym-Aktivität für Studenten mit Vorträgen und lesestoff zur Verfügung gestellt werden kann, sind die Eigenschaften der enzymatischen Reaktionen am besten mit den Händen auf praktische Erfahrungen von Begriffen. Enzyme in Aktion gezeigt wie vorher2. Dieses Protokoll bietet eine einfach zu experimentellen Paradigma zur Messung der Enzymaktivität unter Laborbedingungen mit Laktase als ein Beispiel für ein Enzym mit einer Aktivität, die für die menschliche Ernährung und Gesundheit relevanten folgen.
Die glykosidisch Hydrolase Laktase (EC 3.2.1.23/26) ist ein Enzym Ernährungs zentral für Säugetiere3. Die Aktivität der Laktase ist stark durch die Evolution konserviert und leitet sich aus der Beta-Galaktosidase-Familie der Enzyme – eine Familie von Escherichia coli durch Homo Sapiens (Abbildung 1, PDB 1JZ8)4vorhanden. Die entscheidende Bedeutung der Laktase inmitten der menschlichen Ernährung ergibt sich aus seiner Rolle darin, dass der Abbau von Laktose in seine konstituierenden Monosaccharid-Bestandteile, die dann zur Energiegewinnung im Körper verwendet werden können. Laktase katalysiert die Hydrolyse der Glykosid-Bindung in das Disaccharid Laktose, Freisetzung von Galaktose und Glukose (Abbildung 2)5. Diese Monosaccharide werden dann in erster Linie zur Erzeugung von Adenosintriphosphat (ATP) über den Zitronensäurezyklus und Oxidative Phosphorylierung6verwendet. Während Neugeborene und kindliche Entwicklung Laktase hoch drückt sich in das menschliche Verdauungssystem, Abbau von Laktose erhielt von Muttermilch welche Laktose die primäre Kohlenhydrat-Komponente und eine der wichtigsten Quellen der Ernährung während der frühen Jahre ist 7. die medizinische Bedeutung der Laktase wird hervorgehoben durch angeborene Laktasemangel (CLD), eine seltene autosomal rezessive Erkrankung, verursacht durch Mutationen in dem Laktase-gen (LCT) Kodierung für die Laktase-Enzym-8. Neugeborene mit CLD weisen sehr wenig Laktase-Aktivität, daher können nicht sie mit Muttermilch, jede andere Art von Milch oder Formel, enthält Laktose zugeführt werden.
Während der Kindheit wird Laktase Ausdruck normalerweise reduziert; Diese Reduktion nach Entwöhnung variiert jedoch geographisch, mit etwa 35 % der Erwachsenen weltweit weiterhin die Enzym-9zum Ausdruck bringen. Nachhaltig Ausdruck der Laktase, bekannt als laktasepersistenz, kann weiterhin Milch und Produkte aus den unterschiedlichsten Quellen zu verdauen. Im Gegensatz dazu kann der Verlust von Laktase Ausdruck zu Laktose-Intoleranz, auch bekannt als Erwachsenen-Typ Hypolactasia (ATH), infolge der Unfähigkeit zum Abbau von Laktose im Darm führen. ATH zeichnet sich durch einen Build, der Laktose im Darm nach der Einnahme von Milchzucker mit Lebensmitteln. Im Dickdarm wird die kumulierte Laktose durch mikrobielle Flora Darm, Freigabe Gase wie Wasserstoff, Methan und Kohlendioxid vergoren. Die Produktion dieser Gase in den Einzelpersonen mit Laktase Enzymmangel fördern, abdominale Blähungen, verstärkte Blähungen, Schmerzen, Übelkeit und Borborygmi (Bauch Rumpeln)7. Höheres Maß an Laktose im Verdauungstrakt führen auch zu weicher Stuhl.
Die Kontrolle der LCT -gen-Expression wird durch Polymorphismen befindet sich in Introns des nahe gelegenen Gens MCM6 moduliert. Personen mit anhaltenden Ausdruck der Laktase tragen Polymorphismen, die als starke distalen Enhancer für LCT -gen-Expression, kompensieren die normale down-Regulation der LCT Transkription während der Entwöhnung, fungieren und somit tragenden Laktase Ausdruck im Erwachsenenalter3. Enhancer-Polymorphismen, positiv im Anschluss an die Domestizierung von Rindern und Kamelen im Nahen Osten vor über fünftausend Jahren ausgewählt wurden vorgeschlagen worden9,10.
Die Symptome der ATH daraus können durch Reduktion Laktose Aufnahme, zum Beispiel indem Sie Milchprodukte aus der Ernährung verwaltet werden. Ein alternativer Ansatz für ATH und den Ansatz der Wahl für CLD, ist die Verwendung von Laktase Ergänzungen, weit verbreitet in Apotheken erhältlich. Diese Ergänzungen stellen Laktase isoliert aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Hefen und Bakterien, in flüssigen oder Pille-basierten Form, die mit genommen oder Laktose enthalten Lebensmittel hinzugefügt werden kann. Der Zuschlag wird einen Teil des Milchzuckers vorhanden in der Nahrung in Glukose und Galaktose Produkte, damit ihre Absorption bei schönem und verhindert Ansammlung von Substrat unverdaute Laktose im Darm hydrolyseneigung.
Basierend auf die Verwendung von Laktase Ergänzungen als diätetische Hilfe, haben wir eine einfache Enzymologie Laborexperiment geeignet für biomedizinische Wissenschaft oder Apotheke Studenten im ersten Studienjahr entwickelt. Diese Labor-Experiment nutzt die im Handel erhältlichen Laktase Ergänzungen und Verwendungen ortho-Nitrophenol -Beta-D-Galactopyranoside (ONPG) zu einer kolorimetrischen Endpunkt zur Messung der Spaltung von Glykosid-Bindungen durch Laktase ( Abbildung 3)11. ONPG wirkt einem künstlichen Substrat für Laktase, die bei Hydrolyse durch dieses Enzym produziert D-Galaktose und ortho-Nitrophenol. Die letztgenannte Ware hat eine gelbe Farbe, absorbieren Licht bei einer Wellenlänge von 420 nm. Durch Quantifizierung der Extinktion bei 420 nm folgende Änderungen gegenüber der ONPG Laktase, ist es möglich, die Aktivität dieses Enzyms zu schätzen. Diese Labor-Experiment bietet eine Demonstration der enzymatischen Hydrolase-Aktivität. Durch den Bau in zusätzliche Wiederholungen und Durchführung von Tests unter verschiedenen Bedingungen, ist es möglich, komplexere Analysen der Enzym-Kinetik, bietet ein wertvolles realen Beispiel von Enzymen in Aktion für die menschliche Gesundheit zu übernehmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:796px;" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lactase tablet</td>
			<td style="width:71px;">Lamberts</td>
			<td style="width:119px;">8511-60</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Phosphate buffered saline (powdered)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">ONPG</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N1127</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Carbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">451614</td>
			<td style="width:392px;">Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">De-ionized water</td>
			<td style="width:71px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:392px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pestle and mortar</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Jenway 6315</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Pipettes</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">15 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Spectrophotometer cuvettes</td>
			<td style="width:71px;">Jenway</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Vortex genie 2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Beckman</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Water bath</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:215px;">Weighing scales</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

Verstehen, wie Enzyme funktionieren und über dies die Beispiele aus der Praxis, ist entscheidend für eine Vielzahl von Bachelor-Grad in der biologischen und biomedizinischen Wissenschaften. Diese einfach zu folgen Protokoll wurde für Studenten im ersten Studienjahr Bachelor Apotheke entwickelt und bietet eine Entry-Level-Einführung in enzymatischen Reaktionen und analytischen Verfahren für die Enzym-Analyse. Das Enzym Wahl ist Laktase, da dies ein Beispiel für eine handelsübliche Enzym für die menschliche Krankheit/pharmazeutischen Praxis relevant ist. Laktase ist Nahrungsergänzungsmittel Tabletten entnommen und anhand eines kolorimetrischen Assays basiert auf Hydrolyse von einem künstlichen Substrat für Laktase (ortho-Nitrophenol -Beta-D-Galactopyranoside, ONPG). Freisetzung von ortho-Nitrophenol nach die hydrolytische Spaltung von ONPG durch Laktase wird gemessen, indem eine Änderung der Extinktion bei 420 nm und die Wirkung der Temperatur auf die Enzymreaktion wird durch die Durchführung der Reaktion auf Eis, bei Raumtemperatur und bei 37 ausgewertet ° C. Erweiterte Analyse kann mithilfe dieses Protokolls durch Beurteilung der Enzym-Aktivität unter verschiedenen Bedingungen und mit unterschiedlichen Reagenzien umgesetzt werden.

Repräsentative Ergebnisse für Abschnitt 2 des Protokolls werden in Abbildung 4Aangezeigt. Der Kontrollreaktion in Abwesenheit des Enzyms Laktase, übersichtlich bleibt, während die Reaktionslösung mit Extrakt aus der Laktase Tablette gelb dargestellt wird, wie ONPG hydrolysiert wird die Freigabe ortho- Nitrophenol. Abbildung 4 b zeigt Quantifizierung mit beliebigen Einheiten aus Abschnitt 4 des Protokolls, folgende Analyse von Proben mit dem Spektralphotometer. Produktion von ortho-Nitrophenol ist höchsten und tiefsten bei die Reaktion auf Eis inkubiert wird, wenn die Reaktion erfolgt bei 37 ° C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> Abbildung 1 : E. Coli Beta-Galaktosidase. (A) Kristallstruktur des Beta-Galaktosidase aus Escherichia coli, zeigen die tetrameres Struktur des aktiven Komplex. (B) Allolactose (rot dargestellt) verpflichtet, der aktiven Seite des Beta-Galaktosidase. Bilder aus PDB 1JZ84generiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> Abbildung 2 : Enzymatische Wirkung von Laktase. Hydrolyse von Laktose durch Laktase, Beta-D-Galaktose und Beta-D-Glucose zu produzieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> Abbildung 3 : Hydrolyse von ortho-Nitrophenol - Beta -D-Galactopyranoside. ONPG Hydrolyse durch Laktase zu produzieren Beta-D-Galaktose und ortho-Nitrophenol (das ist in der Farbe gelb), so dass Schätzung der Laktase-Aktivität durch Messung der Extinktion bei 420 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> Abbildung 4 : ONPG Hydrolyse. Repräsentative Ergebnisse der ONPG Hydrolyse, zeigt Kontrolle und Reaktion (A) und repräsentative Daten aus Abschnitt 4 des Protokolls aufgenommen am-Klasse Arbeitsblätter, zeigt roh Extinktion in beliebigen Einheiten bei 420 nm, korrigiert für Hintergrund und bei drei verschiedenen Temperaturen (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Versuchsbedingung</td>
			<td>Experimentellen Variablen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatur</td>
			<td>10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 0 ° C, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Substratkonzentration</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wettbewerbsfähige Hemmung</td>
			<td>5 mM ONPG plus 0 mM, 1 mM, 5 mM oder 10 mM Laktose</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zeitabhängigkeit</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hitze-Denaturierung</td>
			<td>Laktase-Extrakt beheizt bis 100 ° C für 10 min vor der Testdurchführung</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Potential erweitert versuchsbedingung. Vorgeschlagenen erweiterten Experimente, in dreifacher Ausfertigung, Untersuchung von bestimmten Aspekten der Laktase Biologie durchgeführt werden.

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Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Die enzymatische Aktivität der Laktase ist essentiell für die katabolen Verarbeitung von Disaccharid Laktose. Hier ist die Aktivität der Laktase in Nahrungsergänzungsmitteln gefunden untersucht mit Hilfe eines kolorimetrischen Assays. Dies bietet Studenten eine experimentelle Plattform für die Aktivität der Laktase und Enzym Kinetik zu verstehen.

Messung der Laktase enzymatische Aktivität in das Lehrlabor

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

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112.7K Aufrufe.  University of Reading. Die enzymatische Aktivität der Laktase ist essentiell für die katabolen Verarbeitung von Disaccharid Laktose. Hier ist die Aktivität der Laktase in Nahrungsergänzungsmitteln gefunden untersucht mit Hilfe eines kolorimetrischen Assays. Dies bietet Studenten eine experimentelle Plattform für die Aktivität der Laktase und Enzym Kinetik zu verstehen.

Serie: Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Objektiv Transplantation in Zebrafisch und ihre Anwendung in der Analyse von Eye-Mutanten

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Forschung

Biologie

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, techniques for studying the regulatory mechanism of this system are essential to elucidating the cellular and molecular processes of the aforementioned diseases. The use of hemagglutinin derived ubiquitin probes outlined in this paper serves as a valuable tool for the study of this system. This paper details a method that enables the user to perform assays that give a direct visualization of deubiquitinating enzyme activity. Deubiquitinating enzymes control proteasomal degradation and share functional homology at their active sites, which allows the user to investigate the activity of multiple enzymes in one assay. Lysates are obtained through gentle mechanical cell disruption and incubated with active site directed probes. Functional enzymes are tagged with the probes while inactive enzymes remain unbound. By running this assay, the user obtains information on both the activity and potential expression of multiple deubiquitinating enzymes in a fast and easy manner. The current method is significantly more efficient than using individual antibodies for the predicted one hundred deubiquitinating enzymes in the human cell.

The current protocol details a method for measuring the activity of functionally homologous deubiquitinating enzymes. Specialized probes covalently modify the enzyme and allow for detection. This method holds the potential to identify new therapeutic targets.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the mouse provides great potential to explore cardiac function at the molecular level. The mouse&#39;s small size does present some challenges in regards to performing detailed cardiac phenotyping. Miniaturization and other advancements in technology have made many methods of cardiac assessment possible in the mouse. Of these, the simultaneous collection of pressure and volume data provides a detailed picture of cardiac function that is not available through any other modality. Here a detailed procedure for the collection of pressure-volume loop data is described. Included is a discussion of the principles underlying the measurements and the potential sources of error. Anesthetic management and surgical approaches are discussed in great detail as they are both critical to obtaining high quality hemodynamic measurements. The principles of hemodynamic protocol development and relevant aspects of data analysis are also addressed.

This manuscript describes a detailed protocol for the collection of pressure-volume data from the mouse.

Mess Druck Volumen Loops in der Maus

Understanding the causes and progression of heart disease presents a significant challenge to the biomedical community. The genetic flexibility of the ...